專利名稱：上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異的實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明描述了一種實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19基因缺失變異的新方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來，以上皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)為治療靶標(biāo)的分子靶向治療(Molecular Targeted Therapy)受到了國(guó)內(nèi)外腫瘤界的普遍關(guān)注，其中EGFR酪氨酸激酶抑制劑Genfitinib(又稱Iressa)和Erlotinib(又稱Tarceva)已被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，并且Gefitinib還分別獲得包括日本、澳大利亞等27個(gè)國(guó)家的批準(zhǔn)，我國(guó)也于2005年2月批準(zhǔn)了Genfitinib進(jìn)入臨床。
資料顯示，對(duì)歷經(jīng)多次化療失敗的晚期NSCLC，Genfitinib和Erlotinib藥物治療是目前首選的治療措施，能使病人的癥狀緩解，病灶縮小，生活質(zhì)量提高，生存期延長(zhǎng)。這類藥物治療其他實(shí)體腫瘤(如乳腺癌和大腸癌)的臨床試驗(yàn)也在進(jìn)行之中。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，Genfitinib和Erlotinib治療顯效的病人絕大多數(shù)是EGFR基因突變者，這類病人約占NSCLC總數(shù)的10％-30％，而對(duì)野生型腫瘤上述藥物基本無效。因而對(duì)患者腫瘤中EGFR基因進(jìn)行檢測(cè)既可以有針對(duì)性地選擇治療對(duì)象，使患者最大限度地受益，又可以避免不合理用藥所造成的病人醫(yī)療費(fèi)用增加和社會(huì)醫(yī)療資源浪費(fèi)。這一基因診斷新技術(shù)應(yīng)用于臨床，每年可使數(shù)百萬癌癥病人得益，其社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值均十分顯著。
人EGFR基因位于7號(hào)染色體短臂7p12-14區(qū)，由28個(gè)外顯子組成。但基因突變90％以上發(fā)生在外顯子19-21，這些突變可以分為三種類型a)外顯子19的堿基缺失。主要是第746-752位密碼子的堿基缺失突變，導(dǎo)致EGFR蛋白中氨基酸(ELREATS)序列丟失，這一缺失改變了受體ATP結(jié)合囊(ATP-binding pocket，簡(jiǎn)稱ABP)的角度，從而顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)Gefitinib和Erlotinib的敏感性。
b)外顯子20的點(diǎn)突變或堿基插入突變。點(diǎn)突變主要是第790位密碼子出現(xiàn)C＞T轉(zhuǎn)換，引起EGFR蛋白中該位點(diǎn)的氨基酸由蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?簡(jiǎn)稱T790M)，這一突變僅見于藥物治療后復(fù)發(fā)者，突變使得癌細(xì)胞對(duì)Gefitinib和Erlotinib產(chǎn)生抗性。堿基插入突變出現(xiàn)在第770-775位密碼子，在gac aac ccc cac gtg tgc序列之間(主要在ccccc序列兩側(cè))存在8種不同的插入方式，插入的片段為3-9個(gè)堿基。這類插入突變的臨床意義目前尚不清楚。
c)外顯子21的點(diǎn)突變。主要是第858位密碼子出現(xiàn)T＞G轉(zhuǎn)換，引起EGFR蛋白中該位點(diǎn)的氨基酸由亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?簡(jiǎn)稱L858R)，此突變位于DFG序列附近，其作用是使A-Loop的穩(wěn)定性提高，癌細(xì)胞對(duì)Gefitinib和Erlotinib的敏感性明顯增強(qiáng)。
美國(guó)學(xué)者Shigematsu等開展了迄今國(guó)際上規(guī)模最大的臨床研究，他們分析了617例肺癌組織，發(fā)現(xiàn)外顯子19基因突變的發(fā)生率最高，占EGFR基因突變總數(shù)的50％以上。此外，日本學(xué)者M(jìn)itsudomi等的最新研究發(fā)現(xiàn)，在所有的EGFR基因突變中外顯子19缺失突變與Gefitinib臨床療效的相關(guān)性最好。而韓國(guó)學(xué)者Lee等報(bào)道，頭頸部鱗癌中約7％存在EGFR外顯子19的缺失突變，提示該突變并不僅僅局限于肺癌，其他惡性實(shí)體腫瘤也存在類似的突變。因此，外顯子19突變的基因檢測(cè)受到了高度重視。
據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的外顯子19基因突變至少有22種不同的類型(表1)，但中國(guó)人肺癌中外顯子19的基因突變譜目前尚未完全闡明。從現(xiàn)有資料共218例腫瘤的研究結(jié)果(包括大陸學(xué)者2篇文獻(xiàn)共117例和臺(tái)灣學(xué)者1篇文獻(xiàn)101例)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)肺癌中EGFR外顯子19-21基因突變的發(fā)生率約為34.4％(75/218例)，其中外顯子19突變占48％(36/75例)，外顯子20突變占6.7％(5/75例)，外顯子21突變占45.3％(34/75例)。此外，中國(guó)人肺癌中EGFR基因突變存在地區(qū)差異，如大陸學(xué)者報(bào)道外顯子19的突變發(fā)生率(19.7％，23/117例)高于外顯子21(10.3％，12/117例)，而臺(tái)灣報(bào)道的結(jié)果相反(12.9％vs.21.8％)。但兩地學(xué)者均報(bào)道，外顯子20的突變發(fā)生率很低，分別為0.9％(大陸)和4.0％(臺(tái)灣)。
迄今為止，已發(fā)現(xiàn)中國(guó)人肺癌中外顯子19基因突變有9種類型(表2)，但主要類型為delE746-A750[包括del E746-A750(1)和del E746-A750(2)]，占61％(22/36例)。
表1 EGFR外顯子19的基因突變類型


表2 中國(guó)人肺癌EGFR外顯子19基因突變的主要類型


目前外顯子19基因突變的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是組織DNA樣本的直接測(cè)序，但這種基因檢測(cè)方法存在若干不足之處一是DNA需要量大、檢測(cè)樣本的采集困難。一般認(rèn)為，組織DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行基因測(cè)序，DNA需要量至少在100ng以上，而晚期腫瘤病人唯一能夠獲得組織的途徑是穿刺活檢，但腫瘤穿刺活檢組織的樣本很小，通常僅含數(shù)萬個(gè)細(xì)胞，因而微量組織標(biāo)本的EGFR基因檢測(cè)相當(dāng)困難，目前國(guó)內(nèi)還沒有成功的報(bào)道。
二是該方法對(duì)技術(shù)的要求高、結(jié)果判讀耗時(shí)費(fèi)力。基因測(cè)序雖然是最直觀、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，可以明確診斷突變的范圍及其類型，但整個(gè)檢測(cè)過程需要3-5個(gè)工作日才能完成，并且由于大多數(shù)突變屬于雜合性突變(即同時(shí)存在野生型和突變型擴(kuò)增產(chǎn)物)，準(zhǔn)確診斷突變類型難度較大。因而該方法僅適合少數(shù)技術(shù)裝備精良的實(shí)驗(yàn)室開展，國(guó)內(nèi)能夠開展這項(xiàng)診斷的醫(yī)院屈指可數(shù)。
因此，EGFR基因突變的檢測(cè)要成為一項(xiàng)臨床常規(guī)診斷技術(shù)，迫切需要研究開發(fā)靈敏度高、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的新方法。
實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time Quantitative PCR)是二十世紀(jì)九十年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新穎基因檢測(cè)技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)1.靈敏度高。由于實(shí)時(shí)定量PCR采用熒光檢測(cè)技術(shù)，因而敏感性要比其他基因檢測(cè)方法顯著增高，一般認(rèn)為其最低可測(cè)限度達(dá)到0.1-1pg DNA。
2.特異性好。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)要求在200bp以內(nèi)的靶基因DNA片段上設(shè)計(jì)一組引物及熒光探針，因而在該片段中3/4以上的堿基序列必須與引物探針互補(bǔ)才能獲得熒光信號(hào)，這就保證了檢測(cè)結(jié)果具有良好的特異性。
3.簡(jiǎn)便、快速、高通量。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)借助儀器的自動(dòng)化處理，可以在1小時(shí)左右同時(shí)完成30-100例樣本的分析并直接給出結(jié)果，因而數(shù)據(jù)分析直觀簡(jiǎn)便。同時(shí)由于省去了PCR擴(kuò)增后的各項(xiàng)操作，既節(jié)省了時(shí)間、減輕了勞動(dòng)強(qiáng)度，又降低了因這些操作導(dǎo)致DNA污染的機(jī)會(huì)。
日本學(xué)者Sasaki等首先采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)開展了EGFR的基因檢測(cè)研究，他們采用雜交探針法對(duì)外顯子19進(jìn)行基因分型，獲得了滿意結(jié)果。但該方法也存在一些缺點(diǎn)，因?yàn)樵谀壳耙阎?2種基因突變中，作者只對(duì)其中的2種類型(即del E746-A750(1)和delE746-A750(2))進(jìn)行過分析，該方法能否診斷外顯子19的其他突變類型，目前尚缺乏資料可供判斷。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問題，本發(fā)明者首先開展了大規(guī)模的臨床研究，對(duì)120例肺癌進(jìn)行了外顯子19的基因測(cè)序，共檢出6種突變類型。根據(jù)外顯子19的基因突變譜，本發(fā)明者研究開發(fā)了一種新的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)，可以對(duì)所有22種外顯子19基因突變進(jìn)行檢測(cè)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由以下組成(a)上皮生長(zhǎng)因子受體外基因標(biāo)準(zhǔn)品；(b)第一試劑組，該試劑組含有一對(duì)引物和Taqman探針，所述引物對(duì)是對(duì)上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19編碼的ATP結(jié)合囊序列有特異性的引物，所述Taqman探針具有對(duì)應(yīng)于野生型上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19第746位至752位密碼子的編碼序列的核苷酸序列，其5′端與熒光報(bào)告基團(tuán)相連，3′端與熒光淬滅基團(tuán)相連；(c)第二試劑組，該試劑組包含一對(duì)引物和DNA染料，其中所述引物對(duì)與第一試劑組中的引物對(duì)相同。
具體而言，本發(fā)明的試劑盒由一個(gè)EGFR基因標(biāo)準(zhǔn)品和兩個(gè)試劑組組成。第一個(gè)試劑組(簡(jiǎn)稱ABP試劑)包括了一對(duì)引物和一個(gè)Taqman探針，其特點(diǎn)是，所述引物對(duì)野生型和突變型EGFR蛋白ATP結(jié)合囊(ATP Binding Pocket，簡(jiǎn)稱ABP)的編碼序列(EGFR基因外顯子19)均具有結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，所述引物具有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示的序列。而Taqman探針具有對(duì)應(yīng)于外顯子19第746-752位密碼子編碼序列的核苷酸序列，如具有SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。因此，應(yīng)用ABP試劑對(duì)野生型和突變型外顯子19進(jìn)行PCR反應(yīng)均能夠獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，其中野生型基因產(chǎn)物由于具有Taqman探針的完整結(jié)合序列，因而在反應(yīng)過程中探針被Taq酶水解產(chǎn)生熒光信號(hào)，并且信號(hào)強(qiáng)度與模板含量成正比。而突變型基因產(chǎn)物只具有探針的部分結(jié)合序列，因而探針在反應(yīng)過程中不能被Taq酶水解，所以PCR反應(yīng)中只有擴(kuò)增產(chǎn)物而沒有熒光信號(hào)(ABP檢測(cè)試劑的反應(yīng)原理如圖2所示)。
本發(fā)明的試劑盒中的第二個(gè)試劑組(稱為SYB試劑)包含一對(duì)引物和DNA染料，其中所述引物對(duì)與第一試劑組中的引物對(duì)相同。所述DNA染料宜為Syb Green I[如寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的SYBR Premix Ex TaqTM產(chǎn)品，目錄號(hào)DRR041D]。由于在上述反應(yīng)體系中，野生型和突變型外顯子19均可以被擴(kuò)增，因而采用DNA染料Syb Green I可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的總量進(jìn)行測(cè)定。
此外，本試劑盒提供了拷貝數(shù)已知的EGFR基因表達(dá)質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線后，用ABP試劑和SYB試劑分別對(duì)待測(cè)樣本DNA進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)字化處理，獲得野生型外顯子19的基因拷貝數(shù)(稱為ABP)和擴(kuò)增產(chǎn)物的總拷貝數(shù)(稱為SYB)，通過計(jì)算ABP/SYB比值，就能夠得出檢測(cè)結(jié)果。
因此，本發(fā)明提供了一種通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)樣品中上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異的方法，該方法包括，(a)用本發(fā)明所述的第一試劑組對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，獲得樣品中野生型上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19的基因拷貝數(shù)；(b)用本發(fā)明所述的第二試劑組對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，獲得樣品中擴(kuò)增產(chǎn)物的總拷貝數(shù)；根據(jù)步驟(a)和(b)獲得的拷貝數(shù)的比值判斷樣品中是否存在上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異。
本發(fā)明試劑盒的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)具有高度的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，對(duì)目前已知的所有突變型基因應(yīng)用本方法都能獲得診斷結(jié)果。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)具有高度的檢測(cè)敏感性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，樣本DNA中突變型基因低于10％、DNA總量低于2.5ng，應(yīng)用本方法都能獲得診斷結(jié)果，因而本方法更適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)常規(guī)使用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了EGFR外顯子20的堿基插入突變?cè)谕怙@子20中存在5個(gè)插入位點(diǎn)(雙劃線部分)，其插入片段有8種不同的序列。
圖2顯示了EGFR外顯子19缺失突變的定量PCR檢測(cè)示意圖。
圖3顯示了EGFR外顯子19的6種基因突變類型的測(cè)序結(jié)果。
圖4顯示了肺癌組織EGFR外顯子19的基因缺失突變。
圖5顯示了定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品制備的結(jié)果，其中1表示純化前的PCR產(chǎn)物；2表示純化后的PCR產(chǎn)物；3，4表示經(jīng)篩選獲得的2個(gè)陽性表達(dá)質(zhì)粒電泳結(jié)果。
圖6A顯示了ABP的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(RG3000型定量PCR儀結(jié)果)。
圖6B顯示了SYB的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(RG3000型定量PCR儀結(jié)果)。
圖7顯示了ABP檢測(cè)試劑的特異性分析。對(duì)野生型和突變型外顯子19進(jìn)行定量PCR檢測(cè)(A)，反應(yīng)結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.6％瓊脂糖凝膠電泳100V 30min，EB染色攝片(B)。其中泳道1-6為野生型DNA模板，7-12為突變型DNA模板，其中1，7空白對(duì)照；2，810,000pg；3，91,000pg；4，10100pg；5，1110pg；6，121pg。
較佳實(shí)施方案下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、重組DNA的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。
實(shí)施例1肺癌組織EGFR外顯子19的基因測(cè)序(1)材料與方法A.腫瘤組織采集手術(shù)切除的肺癌組織120例，組織類型為肺腺癌48例，腺鱗癌24例，肺鱗癌41例，其他類型7例。其中男性85例，女性35例，年齡為37-79歲，平均為60.4歲。腫瘤組織在采集后1小時(shí)內(nèi)快速凍存于液氮中，然后-80℃深低溫冰箱保存。
B.DNA提取取50mg組織樣本，采用DNAezsol基因組DNA抽提試劑盒(上海申能博采公司)提取基因組DNA，DNA提取過程按照試劑盒說明書操作。
PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫公開發(fā)表人上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因(AY588246)序列，采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司的Primer Express軟件分別在外顯子19設(shè)計(jì)以下引物(表3)。上述引物均由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。
表3 EGFR基因外顯子19的PCR引物

DNA的PCR擴(kuò)增采用Pfu高保真DNA聚合酶(購(gòu)自立陶宛MBI Fermantas公司)，PCR反應(yīng)液內(nèi)含DNA 4μl(100ng)，10×緩沖液5μl，2.5mM dNTP 5μl，上游及下游引物(20μM)各1μl，Pfu酶(2.5U/μl)1μl，用DEPC-H2O補(bǔ)充至50μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5分鐘變性，然后95℃30秒，57℃30秒，72℃45秒，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。
PCR產(chǎn)物用于1.6％瓊脂糖凝膠電泳，條件為100V 30分鐘，凝膠經(jīng)EB染色后攝片。PCR產(chǎn)物經(jīng)柱分離純化后采用上游引物進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序工作由北京奧科生物技術(shù)有限公司上海分公司完成。
(2)結(jié)果對(duì)我國(guó)大陸120例肺癌組織中EGFR外顯子19基因進(jìn)行了檢測(cè)，共檢出突變16例，外顯子19基因突變的檢出率為13.3％。此16例外顯子19基因突變均為雜合性突變(即同時(shí)存在野生型和突變型基因)，分為6種類型(表4)
類型1(693)缺失了15個(gè)堿基，導(dǎo)致EGFR蛋白第746-750位氨基酸(E L R E A)丟失，簡(jiǎn)稱del E746-A750。
類型2(864)的堿基缺失位點(diǎn)較類型1后移1位，也缺失15個(gè)堿基，但缺失引起的氨基酸丟失與類型1相同，因而該型突變也可以歸類為del E746-A750。
類型3(775)缺失了9個(gè)堿基(t t a a g a g a a)，并且其后的鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)換為胞嘧啶(C)，導(dǎo)致EGFR蛋白第747-749位氨基酸(L R E)丟失，同時(shí)引入1個(gè)新的突變，由原來的丙氨酸(A)變?yōu)楦彼?P)，簡(jiǎn)稱del L747-E749insP。
類型4(201)的缺失數(shù)較類型3增加4個(gè)堿基，并且其后的腺嘌呤(A)轉(zhuǎn)換為胞嘧啶(C)，導(dǎo)致EGFR蛋白第747-750位氨基酸(L R E A)丟失，同時(shí)引入1個(gè)新的突變，由原來的丙氨酸(A)變?yōu)楦彼?P)，簡(jiǎn)稱del L747-A750insP。
類型5(251)缺失了18個(gè)堿基，導(dǎo)致EGFR蛋白第747-752位氨基酸(L R E A T S)丟失，簡(jiǎn)稱del L747-S752。
類型6(694)由二個(gè)堿基缺失組成，導(dǎo)致EGFR蛋白第746-752位氨基酸(L R E A T S)丟失，同時(shí)引入1個(gè)新的突變，由原來的746位的谷胺酰胺(E)變?yōu)轭R氨酸(V)，簡(jiǎn)稱delE746-S752insV。
上述突變的序列分析圖譜見圖3。
表4 EGFR外顯子19的6種基因突變類型

與表4結(jié)果比較，上述6種類型突變中有2種[Del L747-S752和Del L747-S752ins V(2)]為首次發(fā)現(xiàn)，其余4種突變已有報(bào)道。
表5結(jié)果顯示，從性別和組織類型看，外顯子19基因突變者中女性(7/35例，20％)高于男性(9/85例，10.6％)，腺癌(13/48例，27.1％)高于腺鱗癌(1/24例，4.2％)和鱗癌(2/41例，4.9％)。而從突變類型分析，2種類型的Del E746-A750突變約占2/3(11/16例，68.8％)，其他4種類型占1/3(5/16例，31.3％)。上述結(jié)果與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。
表5 EGFR外顯子19基因突變的臨床相關(guān)資料

實(shí)施例2突變組織的EGFR外顯子19基因克隆(1)材料與方法組織DNA采用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)液內(nèi)含10×緩沖液5μl，2.5mM dNTP5μl，EGFR外顯子19上游及下游引物(20μM)各1μl，Taq酶(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司，2.5U/μl)1μl，組織DNA 4μl(100ng)，用DEPC-H2O補(bǔ)充至50μl。
PCR反應(yīng)條件為95℃5min變性，然后95℃45sec.，56℃2min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.6％瓊脂糖凝膠電泳100V 30min后切割獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，然后采對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。
純化產(chǎn)物克隆到pMD 18-T載體(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)中。按照操作說明篩選獲得陽性表達(dá)質(zhì)粒。
純化質(zhì)粒的基因測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)公司上海分公司完成。
(2)結(jié)果對(duì)圖3中的6種類型外顯子19缺失突變進(jìn)行了基因克隆，共篩選獲得克隆120株，測(cè)序結(jié)果顯示野生型基因105株，突變型基因15株，突變型基因的序列與表4所述完全一致(圖4)。
實(shí)施例3實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備(1)材料與方法EGFR陽性表達(dá)細(xì)胞人A431上皮樣癌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生化和細(xì)胞生物學(xué)研究所。胎牛血清及F12培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司。Tri Reagent RNA抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Molecular Research Center公司。RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自立陶宛MBIFermantas公司。PCR引物及熒光探針由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)公司上海分公司完成。Ex TaqDNA聚合酶和pMD 18-T PCR產(chǎn)物克隆載體和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。
RNA抽提及cDNA合成選擇活躍增殖期細(xì)胞，按試劑盒要求抽提總RNA，采用紫外分光光度法測(cè)定A260及A280，要求A260/A280＞1.80。然后取2μg RNA按試劑盒要求合成cDNA，反應(yīng)體積為20μl。
引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫公開發(fā)表人上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)cDNA(X00588)序列，采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司的Prism Express軟件設(shè)計(jì)了1組引物(表6)(EGFR基因(AY588246)第28外顯子序列是EGFR基因的序列，包括內(nèi)含子和外顯子；而上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)cDNA(X00588)序列是EGFR的cDNA序列，相當(dāng)于EGFR基因的外顯子按順序首尾相連，不含內(nèi)含子)。
表6 PCR標(biāo)準(zhǔn)品引物序列

cDNA的PCR擴(kuò)增應(yīng)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)液內(nèi)含cDNA1μl，10×Ex Taq緩沖液5μl，2.5mM dNTP 5μl，上游及下游引物(20μM)各1μl，Ex Taq(5U/μL)0.25μl，用DEPC-H2O補(bǔ)充至50μl。PCR反應(yīng)條件為95℃5min變性，然后95℃45sec.，56℃2min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.6％瓊脂糖凝膠電泳100V 30min后EB染色攝片。
基因克隆和標(biāo)準(zhǔn)品篩選方法如上所述。
(2)結(jié)果A431細(xì)胞為目前國(guó)際公認(rèn)的EGFR高表達(dá)細(xì)胞株。取該細(xì)胞制備cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了單一條帶，此產(chǎn)物經(jīng)凝膠分離純化后(圖5A)，通過克隆和抗菌素篩選獲得陽性表達(dá)質(zhì)粒(圖5B)，后者經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)其序列為野生型。該質(zhì)粒作為定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品。
實(shí)施例4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法的建立(1)材料與方法A.引物探針設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫公開發(fā)表人上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因(AY588246)外顯子19序列，采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司的Prism Express軟件，分別設(shè)計(jì)了1組引物及Taqman探針(表7)。
表7 EGFR基因外顯子19及28的引物探針序列

B.試劑配制質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至5×109拷貝/μl后分裝成10μl/支，-70℃冰箱保存。標(biāo)準(zhǔn)品基因拷貝數(shù)＝質(zhì)粒的摩爾濃度×6.023×1023。
ABP試劑反應(yīng)液內(nèi)含5x實(shí)時(shí)PCR緩沖液5μl[試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，Takara Ex TaqTMR-PCR Version 2.1，目錄號(hào)DRR032A)，10mM dNTP 0.75μl，250mM Mg溶液0.5μl，熱啟動(dòng)Taq酶(5U/ml)0.25μl，上游及下游引物(100μM)各0.1μl，熒光探針(50μM)，用DEPC-H2O補(bǔ)充至23μl。反應(yīng)液配制后分裝成950μl/支，-70℃冰箱保存。
SYB試劑反應(yīng)液內(nèi)含2×SYBR Primix Ex Taq混合液12.5μl[試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，SYBR Premix Ex TaqTM，目錄號(hào)DRR041D]，上游及下游引物(100μM)各0.1μl，50×ROX內(nèi)參照染料(試劑來源同上)0.5μl，用DEPC-H2O補(bǔ)充至23μl。反應(yīng)液配制后分裝成950μl/支，-70℃冰箱保存。
C.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及檢測(cè)1.取出標(biāo)準(zhǔn)品管及反應(yīng)混合液管，放置4℃冰箱待冰融化。
2.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋(1)取0.5ml Eppendorf離心管4個(gè)，各加DEPC-H2O 18μl；(2)將標(biāo)準(zhǔn)品管輕輕混勻后短暫離心，取2μl標(biāo)準(zhǔn)品于1號(hào)管內(nèi)，混勻10次；(3)從1號(hào)管內(nèi)取2μl標(biāo)準(zhǔn)品，置于2號(hào)管內(nèi)，混勻10次；(4)從2號(hào)管內(nèi)取2μl標(biāo)準(zhǔn)品，置于3號(hào)管內(nèi)，混勻10次；(5)從3號(hào)管內(nèi)取2μl標(biāo)準(zhǔn)品，置于4號(hào)管內(nèi)，混勻10次；3.在0.2ml PCR薄壁管(或PCR毛細(xì)管)內(nèi)加入23μl反應(yīng)混合液。
4.在空白管(0號(hào)管)內(nèi)加入2μl DEPC-H2O，在標(biāo)準(zhǔn)品管中按上述次序依次加入0-5號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品2μl，輕輕混勻后短暫離心，各管所含的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)分別為管號(hào) 拷貝數(shù)001 1×1082 1×1073 1×1064 1×1055.標(biāo)準(zhǔn)管系列之后為樣品管，依次加入2μl樣品DNA，輕輕混勻后短暫離心。
6.然后將標(biāo)準(zhǔn)品管和樣品管依次放入PCR儀中。
7.PCR反應(yīng)程序

在RG300型定量PCR儀上，選定檢測(cè)熒光為FAM，并在PCR循環(huán)第二步60℃時(shí)采集熒光數(shù)據(jù)。在LightCycler定量PCR儀上，熒光采集方式設(shè)定為“SINGLE”，儀器檢測(cè)通道選擇為F1通道，并在PCR循環(huán)第二步60℃時(shí)采集熒光數(shù)據(jù)，其他為默認(rèn)值。
8.結(jié)果分析1.LightCycler用熒光顯示模式F1/F2讀取結(jié)果?；€設(shè)定原則以剛好超過空白對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，然后用自動(dòng)搜索鍵取值，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.99時(shí)，此反應(yīng)視為有效。
2.RG3000基線設(shè)定原則以剛好超過空白對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，也可以采用自動(dòng)搜索鍵取值，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.99時(shí)，此反應(yīng)視為有效。
3.ABI Prism 7000基線設(shè)定原則以剛好超過空白對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，也可以采用自動(dòng)搜索鍵取值，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.99時(shí)，此反應(yīng)視為有效。
4.當(dāng)基線設(shè)定后，分析軟件會(huì)自動(dòng)給出各樣品的拷貝值。
5.計(jì)算ABP/SYB比值。
(2)結(jié)果按上述方法操作，證明在基因拷貝數(shù)為104-108范圍內(nèi)，ABP和SYB試劑均能夠給出線性結(jié)果，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R＞0.999(圖6)。
實(shí)施例5實(shí)時(shí)定量PCR試劑的檢測(cè)特異性分析(1)材料與方法A.野生型及突變型外顯子19DNA模板經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)的野生型質(zhì)粒及6種類型的突變型質(zhì)粒(圖4)。對(duì)其他類型的外顯子19基因突變，根據(jù)其堿基序列進(jìn)行人工合成(表8)。
表8 人工合成的EGFR外顯子19堿基序列


B.定量PCR檢測(cè)在梯度分析實(shí)驗(yàn)中采用合成的野生型和del E746-A750(1)突變型DNA片段，分別調(diào)整DNA濃度至5000pg-0.5pg/μl。各取2μl DNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。
在其它實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒DNA片段濃度均調(diào)整至5pg/μl，合成的DNA濃度均調(diào)整至0.5pg/μl。各取2μl DNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)(方法同前)。
(2)結(jié)果圖7A結(jié)果顯示，野生型DNA模板在10ng-1pg濃度之間，定量PCR反應(yīng)的熒光信號(hào)與模板濃度呈線性關(guān)系。但相同濃度的del E746-A750(1)突變型DNA模板在PCR反應(yīng)中均未能檢出熒光信號(hào)。
對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后攝片，證實(shí)無論是野生型還是突變型模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)清晰的條帶(圖7B)。
上述結(jié)果提示，采用Taqman探針檢測(cè)野生型外顯子19含量，Syb Green I DNA染料檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物總含量，通過計(jì)算二者的比值(ABP/SYB)可以鑒別野生型和突變型外顯子19。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，本發(fā)明者選擇圖4所示的4種質(zhì)粒進(jìn)行了檢測(cè)，表9結(jié)果顯示突變型外顯子的ABP/SYB值均顯著低于野生型。
進(jìn)一步應(yīng)用該方法檢測(cè)16種不同類型的外顯子19基因突變，證明所有類型突變型外顯子的ABP/SYB值均顯著低于野生型(表10)。
以上結(jié)果說明，應(yīng)用本試劑盒能夠檢測(cè)目前已知的所有類型外顯子19基因突變。
表9 定量PCR方法對(duì)4種EGFR外顯子19基因突變的檢測(cè)特異性

注質(zhì)粒DNA濃度調(diào)整至5pg/μl，取2μl DNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。
表10 定量PCR方法對(duì)16種EGFR外顯子19基因突變的檢測(cè)特異性

注DNA片段濃度調(diào)整至0.5pg/μl，取2μl DNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。
實(shí)施例6實(shí)時(shí)定量PCR試劑的檢測(cè)敏感性分析(1)材料與方法A.將野生型(693T)和突變型(693-3)質(zhì)粒的濃度分別調(diào)整至5pg/μl，然后按不同的比例將二者混合，使得突變型DNA的含量占野生型DNA的0-100％(表11)。各取2μl進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(方法同前)。
B.隨機(jī)選擇了2例突變型和2例野生型肺癌組織，將基因組DNA進(jìn)行系列稀釋，濃度范圍為20ng/μl-0.31ng/μl，各取2μl進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(方法同前)。
(2)結(jié)果表11結(jié)果顯示，當(dāng)樣本DNA中突變型基因占10％時(shí)，采用定量PCR方法可以將其檢測(cè)出來，由于基因測(cè)序的最高分辨率為突變型基因占DNA總量的10％或以上，因而定量PCR檢測(cè)的敏感性與基因測(cè)序方法相等。
表11 實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)突變型基因的檢測(cè)敏感性

實(shí)施例7組織中EGFR外顯子19基因突變的定量PCR檢測(cè)(1)材料及方法迄今為止，本發(fā)明者已經(jīng)完成了176例肺癌組織的EGFR外顯子19基因測(cè)序。在這些肺癌組織中隨機(jī)選擇20例突變型組織，其中男性16例，女性4例，年齡為38-74歲，平均為59.7歲，組織類型為腺癌7例，鱗癌10例，腺鱗癌3例。作為對(duì)照，本發(fā)明者選擇了年齡、性別和組織類型基本匹配的20例野生型肺癌組織(表12)。將各病例的基因組DNA稀釋至25ng/μl，各取2μ1進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(方法同前)。
(2)結(jié)果表12結(jié)果顯示，20例野生型組織的ABP/SYB值范圍為0.807-2.748，平均為1.326±0.584。而20例突變型組織的ABP/SYB值范圍為0.171-0.789，平均為0.540±0.201。二組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著差異(P＜0.001)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，以ABP/SYB比值＜0.8作為臨界值，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)可以快速診斷肺癌組織中EGFR外顯子19的基因缺失突變。
表12 野生型和突變型EGFR基因外顯子19的定量PCR檢測(cè)

盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均納入本文作參考。
主要參考文獻(xiàn)1.董強(qiáng)剛。上皮生長(zhǎng)因子受體家族與肺癌的分子靶向治療。腫瘤，2004，2493-952.Tsao AS和Herbst RS.Factors that determine response to EGFR inhibitors.Signal，2003，44-93.Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，等Activating mutations in the epidermalgrowth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer togefitinib.N Engl J Med，2004，3502129-21394.Paez JG，Janne PA，Lee JC，等EGFR mutations in lung cancerCorrelationwith clinical response to gefitinib therapy.Science，2004，3041497-15005.Pao W，Miller V，Zakowski M，等EGF receptor gene mutations are commonin lung cancers from“never smokers”and are associated with sensitivity of tumorsto gefitinib and erlotinib.PNAS，2004，10113306-133116.Pao W，Wang TY，Reily GJ，等KRAS mutations and primary resistance of lungadenocarcinomas to gefitinib and erlotinib.PLoS Medicine，2005，257-617.Sodella R，bell DW，haber DA，Settleman J.Gefitinib-sensitizing EGFRmutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways.Science，2004，3051163-11678.Arao T，F(xiàn)ukumoto H，Takeda M，等Small in-frame deletion in the epidermalgrowth factor receptor as a target for ZD6476.Cancer Res，2004，649101-91049.Huang SF，Liu HP，Li LH，等High frequency of epidermal growth factorreceptor mutations with complex patterns in non-small cell lung cancers related togefitinib responsiveness in Taiwan.Clin Cancer Res，2004，108195-820310.Kosaka T，Yatabe Y，Endo H，等Mutations of the epidermal growthfactor receptor gene in lung cancerBiological and clinical implications.CancerRes，2004，648919-892311.Han SW，Kim TY，Hwang PG，等Predictive and prongostic impact ofepidermal growth factor receptor mutation in non-small cell lung cancer patientstreated with gefitinib.J Clin Oncol，2005，231-912.Shigmatsu H，Lin L，Takahashi T，等Clinical and biological featuresassociated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers.JNCI，2005，97339-34613.Tokumo M，Toyooka S，Kiura K，等The relationship between epidermal growthfactor receptor mutations and clinicopathologic features in non-small cell lungcancers.Clin Cancer Res，2005，111167-117314.Cho D，Kocher O，Tenen DG，等Mutation of epidermal growth factor inan elderly man with advanced，gefitinib-response，non-small-cell lung cancer.JClin Oncol，2005，1235-23715.Chabner BA.The miracle of Iressa.The Oncologist，2004，9245-246
16.Arteaga CL.Selecting the right patient for tumor therapy.Nat Med，2004，10577-57817.Lee JW，Soung YH，Kim HK，等Somatic mutations of EGFR gene in squamouscell carcinoma of the head and neck.Clin Cancer Res，2005，112879-288218.Mitsudomi T，Kosaka T，Endoh H，等Mutations of the epidermal growthfactor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment inpatients with non-small cell lung cancer.J Clin Oncol，2005，112513-252019.Berggren P，Kumar R，sakano S，等Detecting homozygous deletios in theCDK2A(p16INK4a)/ARF(p14ARF)gene in urinary bladder cancer using real-timequantitative PCR.Clin Cancer Res，2003，9235-24220.He L，Chinnery PF，Durham SE，等Detection and quantification ofmitochondrial DNA deletions in individuall cells by real-time PCR.Nucleic AcidsRes，2002，30e6821.Sasaki H，Endo K，Konishi A，等EGFR mutation status in japanese lungcancer patientsgenotyping analysis using Lightcycler.Clin cancer ReS，2005，112924-292922.Mu XL，Li LY，Zhang XT，等Gefitinib-sensitive mutations of the epidermal growthfactor receptor tyrosine kinase domain in Chinese patients with non-small cell lung cancer.ClinCancer Res，2005，114289-4294
序列表<110>上海奇諾腫瘤生物高新技術(shù)有限公司<120>上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒和方法<130>054722<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1aacgtcttcc ttctctctct gtca 24<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2ccacacagca aagcagaaac t 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cacggtgtat aagggactct g 21<210>4<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ggcttccttg ggaaagaagt20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5actctggatc ccagaaggtg ag 22<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6gatttccttg ttggctttcg g 21<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>7tgcttctctt aattccttga tagcgacggg a 3權(quán)利要求
1.一種通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由以下組成(a)上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19基因標(biāo)準(zhǔn)品；(b)第一試劑組，該試劑組含有一對(duì)引物和Taqman探針，所述引物對(duì)是對(duì)上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19編碼的ATP結(jié)合囊序列有特異性的引物，所述Taqman探針具有對(duì)應(yīng)于野生型上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19第746位至752位密碼子的編碼序列的核苷酸序列，其5′端與熒光報(bào)告基團(tuán)相連，3′端與熒光淬火基團(tuán)相連；(c)第二試劑組，該試劑組包含一對(duì)引物和DNA染料，其中所述引物對(duì)與第一試劑組中的引物對(duì)相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19基因標(biāo)準(zhǔn)品具有人上皮生長(zhǎng)因子受體cDNA序列X00588的2358至3729位核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述第一試劑組中的一對(duì)引物分別具有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述DNA染料是Syb Green I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述Tagman探針具有SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述二個(gè)試劑組均含有熱啟動(dòng)Taq酶。
7.一種通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)樣品中上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異的方法，該方法包括，(a)用權(quán)利要求1所述的第一試劑組對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，獲得樣品中野生型上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19的基因拷貝數(shù)；(b)用權(quán)利要求1所述的第二試劑組對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，獲得樣品中擴(kuò)增產(chǎn)物的總拷貝數(shù)；根據(jù)步驟(a)和(b)獲得的拷貝數(shù)的比值判斷樣品中是否存在上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異的試劑盒。本發(fā)明涉及一種通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)樣品中上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異的方法，該方法包括，(a)用第一試劑組對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，獲得樣品中野生型上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19的基因拷貝數(shù)；(b)用第二試劑組對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，獲得樣品中擴(kuò)增產(chǎn)物的總拷貝數(shù)；根據(jù)步驟(a)和(b)獲得的拷貝數(shù)的比值判斷樣品中是否存在上皮生長(zhǎng)因子受體外顯子19缺失變異。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1749417SQ20051002816
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者董強(qiáng)剛 申請(qǐng)人:上海奇諾腫瘤生物高新技術(shù)有限公司