專利名稱：5'－核苷酸酶活性測定方法及5'－核苷酸酶診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種測定5′-核苷酸酶活性的方法，同時本發(fā)明還涉及用于實現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
醫(yī)學研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因為5′-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5′-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。
5′-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學強酸測磷法(1925年)。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法為5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應后，通過離子交換層析柱分析結果，求得5′-核苷酸酶活性。或者利用5′-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無機磷，再用化學強酸法分析無機磷含量得以計算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此難以切實推廣應用。無機磷測定法是1925年發(fā)明的方法，準確度不好，強酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應用。

發(fā)明內容
提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術缺點的5′-核苷酸酶活性的測定方法，同時給出用以實現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行5′-核苷酸酶活性測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明測定5′-核苷酸酶活性的步驟如下1)、將樣品與主要由尿苷單磷酸、還原型輔酶、尿苷核苷酶、二氫胸腺嘧啶脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+還原型輔酶二氫胸腺嘧啶脫氫酶二氫尿嘧啶+氧化型輔酶2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
通常步驟2)將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應時間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應用5′-核苷酸酶偶聯(lián)尿苷核苷酶(EC 3.2.2.3)、二氫胸腺嘧啶脫氫酶(EC 1.3.1.2)反應連續(xù)監(jiān)測法。5′-核苷酸酶水解尿苷單磷酸產(chǎn)生尿苷，然后尿苷核苷酶催化尿苷產(chǎn)生尿嘧啶，尿嘧啶再通過偶聯(lián)二氫胸腺嘧啶脫氫酶的作用，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算5′-核苷酸酶的活性大小。
實現(xiàn)本發(fā)明方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40——200mmol/l尿苷單磷酸 0.5——50mmol/l還原型輔酶 0.15——0.3mmo/l尿苷核苷酶 500——50000U/l二氫胸腺嘧啶脫氫酶 500——50000U/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內、外源尿苷、尿嘧啶污染試劑I緩沖液 40——200mmol/l還原型輔酶 0.15——0.3mmo/l尿苷核苷酶 500——50000U/l二氫胸腺嘧啶脫氫酶 500——50000U/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)試劑II緩沖液 40——200mmol/l尿苷單磷酸 0.5——50mmol/l穩(wěn)定劑 10——50mmol/l雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，還原型輔酶、尿苷核苷酶、二氫胸腺嘧啶脫氫酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，尿苷單磷酸也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內、外源尿苷、尿嘧啶污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液40——200mmol/l還原型輔酶0.15——0.3mmo/l穩(wěn)定劑10——50mmol/l試劑II緩沖液40——200mmol/l尿苷核苷酶500——50000U/l二氫胸腺嘧啶脫氫酶500——50000U/l穩(wěn)定劑10——80％(總體積)試劑III緩沖液40——200mmol/l尿苷單磷酸0.5——50mmol/l穩(wěn)定劑10——50mmol/l三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，還原型輔酶可以放在試劑II或試劑III中。試劑II其中的成分，尿苷核苷酶、二氫胸腺嘧啶脫氫酶等也可以放在試劑I或試劑III中。試劑III其中的成分，尿苷單磷酸也可以放在試劑I或試劑II中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-l-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液(例如還可以是咪唑/鹽酸緩沖液6.2-7.8；磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液5.0-8.0；檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液5.0-6.6；磷酸鹽緩沖液6.0-8.0；磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液6.0-8.0；磷酸二氫鉀氫氧化鈉緩沖液6.0-8.0；巴比妥鈉-鹽酸緩沖液6.8-9.6；Tris鹽酸緩沖液7.0-9.0；硼酸硼砂緩沖液7.4-9.0；甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液8.6-10.6；砂-氫氧化鈉緩沖液9.2-10.0；碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液8.8-10.6(Ca2+、Mg2+存在時不得使用)；PBS緩沖液7.0-7.6等)。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上，還可以在硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、葡萄糖、谷氨酸鹽、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、丁二酸鹽等中選擇。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關系的本發(fā)明5′-核苷酸酶診斷試劑盒較為理想緩沖液80——120mmol/l尿苷單磷酸2——10mmol/l還原型輔酶0.2——0.3mmo/l尿苷核苷酶5000——10000U/l
二氫胸腺嘧啶脫氫酶5000——10000U/l穩(wěn)定劑20——50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，不易受到內、外源其他物質的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應的特異性促使測試結果精確。酶解反應都是在緩沖液條件下進行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準確性，更便于推廣應用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內、外源尿苷、尿嘧啶的污染，消除內、外源尿苷、尿嘧啶的作用發(fā)生在整個反應時間段的前半部分，在后半段時間受污染的內、外源尿苷、尿嘧啶已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時間測試5′-核苷酸酶活性所需要的尿苷、尿嘧啶都是產(chǎn)生于5′-核苷酸酶的活性。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l尿苷單磷酸 2mmol/l還原型輔酶 0.2mmo/l尿苷核苷酶 5000U/l二氫胸腺嘧啶脫氫酶 5000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+還原型輔酶二氫胸腺嘧啶脫氫酶二氫尿嘧啶+氧化型輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
本實施例應用5′-核苷酸酶偶聯(lián)尿苷核苷酶(EC 3.2.2.3)、二氫胸腺嘧啶脫氫酶(EC 1.3.1.2)反應連續(xù)監(jiān)測法。5′-核苷酸酶水解尿苷單磷酸產(chǎn)生尿苷，然后尿苷核苷酶催化尿苷產(chǎn)生尿嘧啶，尿嘧啶再通過偶聯(lián)二氫胸腺嘧啶脫氫酶的作用，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算5′-核苷酸酶的活性大小。
實施例二(雙劑)本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l還原型輔酶0.25mmo/l尿苷核苷酶8000U/l二氫胸腺嘧啶脫氫酶8000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II緩沖液100mmol/l
尿苷單磷酸6mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l測定5′-核苷酸酶活性時，溫度控制在30℃，反應時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+還原型輔酶二氫胸腺嘧啶脫氫酶二氫尿嘧啶+氧化型輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應步驟的反應時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l還原型輔酶0.3mmo/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液120mmol/l尿苷核苷酶10000U/l二氫胸腺嘧啶脫氫酶10000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)
試劑III緩沖液120mmol/l尿苷單磷酸10mmol/l穩(wěn)定劑20mmol/l在全自動生化分析儀上設定溫度25℃，反應時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+還原型輔酶二氫胸腺嘧啶脫氫酶二氫尿嘧啶+氧化型輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應步驟的反應時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液100mmol/l還原型輔酶0.3mmo/l穩(wěn)定劑20mmol/l試劑II緩沖液100mmol/l尿苷單磷酸3mmol/l
尿苷核苷酶6000U/l二氫胸腺嘧啶脫氫酶6000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+還原型輔酶二氫胸腺嘧啶脫氫酶二氫尿嘧啶+氧化型輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內、外源物質的污染。
權利要求
1.一種5′-核苷酸酶活性測定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由尿苷單磷酸、還原型輔酶、尿苷核苷酶、二氫胸腺嘧啶脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根尿苷+水尿苷核苷酶核糖+尿嘧啶尿嘧啶+還原型輔酶二氫胸腺嘧啶脫氫酶二氫尿嘧啶+氧化型輔酶2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根據(jù)權利要求1所述5′-核苷酸酶活性測定方法，其特征在于所述步驟2)為，將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根據(jù)權利要求1或2所述測定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應時間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權利要求1或2所述測定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
5.一種5′-核苷酸酶診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l尿苷單磷酸 0.5--50mmol/l還原型輔酶 0.15--0.3mmo/l尿苷核苷酶 500--50000U/l二氫胸腺嘧啶脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據(jù)權利要求5所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADPH、NADH或thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定5′－核苷酸酶活性的方法，同時本發(fā)明還涉及5′－核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。該試劑盒包括緩沖液、尿苷單磷酸、還原型輔酶、尿苷核苷酶、二氫胸腺嘧啶脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應，再將最終反應物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的污染，便于推廣應用。
文檔編號C12Q1/32GK1778950SQ20041006556
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權日2004年11月23日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司