專利名稱：5ˊ－核苷酸酶活性測定方法及5ˊ－核苷酸酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定5′-核苷酸酶活性的方法，同時本發(fā)明還涉及用于實現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因為5′-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5′-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。
5′-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強酸測磷法(1925年)。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法為5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應(yīng)后，通過離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5′-核苷酸酶活性?；蛘呃?′-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無機磷，再用化學(xué)強酸法分析無機磷含量得以計算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此難以切實推廣應(yīng)用。無機磷測定法是1925年發(fā)明的方法，準(zhǔn)確度不好，強酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點的5′-核苷酸酶活性的測定方法，同時給出用以實現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行5′-核苷酸酶活性測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測定5′-核苷酸酶活性的步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷單磷酸、2-酮戊二酸酯、還原性輔酶、腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
這種方法應(yīng)用5′-核苷酸酶偶聯(lián)腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。5′-核苷酸酶水解腺苷單磷酸產(chǎn)生腺苷，然后腺苷脫氨酶再水解腺苷產(chǎn)生氨，再通過偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(NADH、NADPH或其它類似物——在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(NAD+、NADP+或其它類似物——在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算5′-核苷酸酶的活性大小。
用以實現(xiàn)本發(fā)明方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l2-酮戊二酸酯0.5--50mmol/l還原性輔酶 0.15--0.3mmo/l腺苷脫氨酶 5000--500000U/l谷氨酸脫氫酶50000--500000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源腺苷及氨的污染試劑I緩沖液 40--200mmol/l2-酮戊二酸酯0.5--50mmol/l還原型輔酶 0.15--0.3mmo/l谷氨酸脫氫酶50000--500000U/l腺苷脫氨酶 5000--500000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑II緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmo/l
雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，2-酮戊二酸酯、谷氨酸脫氫酶、腺苷脫氨酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，腺苷單磷酸也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源腺苷及氨的污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40--200mmol/l2-酮戊二酸酯0.5--50mmol/l還原型輔酶 0.15--0.3mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l試劑II緩沖液 40--200mmol/l谷氨酸脫氫酶50000--500000U/l腺苷脫氨酶 5000--500000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，2-酮戊二酸酯等可以放在試劑II或試劑III中，試劑II其中的成分，谷氨酸脫氫酶、腺苷脫氨酶等也可以放在試劑I或試劑III中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10-80％或者10-50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺、鹽或腺苷二磷酸等中的一種或一種以上。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明5′-核苷酸酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l腺苷單磷酸 5--20mmol/l2-酮戊二酸酯5--20mmol/l還原性輔酶 0.15--0.3mmo/l腺苷脫氨酶 10000--20000U/l谷氨酸脫氫酶100000--200000U/l穩(wěn)定劑 20--50％由于本發(fā)明完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源腺苷及氨的污染，消除內(nèi)、外源腺苷及氨的作用發(fā)生在整個反應(yīng)時間段的前半部分，在后半段時間受污染的內(nèi)、外源腺苷及氨已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時間測試5′-核苷酸酶活性所需要的腺苷及氨都是產(chǎn)生于5′-核苷酸酶的活性。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l腺苷單磷酸 5mmol/l2-酮戊二酸酯5mmol/l還原性輔酶 0.15mmo/l腺苷脫氨酶 10000U/l谷氨酸脫氫酶100000U/l穩(wěn)定劑 30％(總體積)在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
這種方法應(yīng)用5′-核苷酸酶偶聯(lián)腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。5′-核苷酸酶水解腺苷單磷酸產(chǎn)生腺苷，然后腺苷脫氨酶再水解腺苷產(chǎn)生氨，再通過偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(NADH、NADPH或其它類似物——在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(NAD+、NADP+或其它類似物——在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算5′-核苷酸酶的活性大小。
實施例二(雙劑)本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l2-酮戊二酸酯12mmol/l還原性輔酶 0.2mmol/l腺苷脫氨酶 15000U/l谷氨酸脫氫酶150000U/l穩(wěn)定劑 40％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l腺苷單磷酸 12mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l測定5′-核苷酸酶活性時，溫度控制在30℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在10分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 120mmol/l2-酮戊二酸酯20mmol/l還原性輔酶 0.3mmo/l穩(wěn)定劑 50mmol/l試劑II緩沖液 120mmol/l腺苷脫氨酶 20000U/l谷氨酸脫氫酶200000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 120mmol/l腺苷單磷酸 20mmol/l穩(wěn)定劑 50mml/l
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在10分鐘。
實施例四本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液 120mmol/l腺苷單磷酸 20mmol/l2-酮戊二酸酯20mmol/l還原性輔酶 0.3mmo/l谷氨酸脫氫酶200000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 120mmol/l腺苷單磷酸 5mmol/l腺苷脫氨酶 10000U/l
穩(wěn)定劑 50％(總體積)在生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負(fù)反應(yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性。
權(quán)利要求
1.一種5′-核苷酸酶活性測定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷單磷酸、2-酮戊二酸酯、還原性輔酶、腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述5′-核苷酸酶活性測定方法，其特征在于所述步驟2)為，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm，吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述5′-核苷酸酶活性測定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述5′-核苷酸酶活性測定方法，其特征在于被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
5.一種5′-核苷酸酶診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l2-酮戊二酸酯 0.5--50mmol/l還原性輔酶 0.15--0.3mmo/l腺苷脫氨酶 5000--500000U/l谷氨酸脫氫酶 50000--500000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨、鹽或腺苷二磷酸中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑為三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶為NADPH、NADH、thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定5′－核苷酸酶活性的方法，同時本發(fā)明還涉及5′－核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、腺苷單磷酸、2－酮戊二酸酯、還原性輔酶、腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶、穩(wěn)定劑等。通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/32GK1749406SQ20041004196
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中