專利名稱：腺苷脫氨酶活性測定方法及腺苷脫氨酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定腺苷脫氨酶活性的方法，同時本發(fā)明還涉及用以實現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標(biāo)志。
腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H2O)腺苷脫氨酶肌苷(Inosine)+氨離子(NH4+)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫(yī)院的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣應(yīng)用。
檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?3128092.7、申請日為2003.05.29、名稱為《一種測定腺苷脫氨酶的試劑及其制法》的中國專利申請公開了應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰氨輔酶配制的測定試劑。該發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測定反應(yīng)所需的還原型煙酰氨輔酶或其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰氨輔酶或其類似物，及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰氨輔酶或其類似物，當(dāng)被還原的還原型煙酰氨輔酶或其類似物達(dá)到一定的濃度時，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達(dá)到測定樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的目的。該發(fā)明的特點在于為腺苷脫氨酶的測試提供一個內(nèi)源合成腺苷脫氨酶反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的腺苷脫氨酶試劑。其缺點之一為，這個系統(tǒng)在生成反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時，也抵消了部分腺苷脫氨酶試劑(腺苷脫氨酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)必定將還原型煙酰氨輔酶氧化成氧化型煙酰氨輔酶)的活性，造成試劑測試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點之二是，該試劑在正式測試前必須事先反應(yīng)一段時間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟急的結(jié)果，給測試帶來很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點的腺苷脫氨酶活性的測定方法，同時給出用以實現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進(jìn)行腺苷脫氨酶活性測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測定腺苷脫氨酶活性的方法步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷、單價磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化物酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化物酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度上升的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
通常步驟2)是將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，以測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
這種方法應(yīng)用腺苷脫氨酶偶聯(lián)核苷磷酸酶生成次黃嘌呤，再偶聯(lián)黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤氧化生成尿酸鹽及過氧化氫，再偶聯(lián)經(jīng)過氧化物酶反應(yīng)生成乙醛，在氧化型輔酶的幫助下，醛脫氫酶將乙醛氧化成乙酸，同時氧化型輔酶還原成還原性輔酶，還原性輔酶在波長340nm處有吸收峰，因此從測定主波長340nm吸光度上升的速度，可以測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
用以實現(xiàn)本發(fā)明方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖劑 40--200mmol/l腺苷 0.2--20mmol/l單價磷酸鹽 0.2--10mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶500--50000U/l乙醇1--30mmol/l過氧化物酶 500--50000U/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l
醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--50％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)源肌苷、及次黃嘌呤的污染試劑I緩沖液40--200mmol/l單價磷酸鹽0.2--10mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型輔酶0.5--20mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l過氧化物酶500--50000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑10--50％(總體積)試劑II緩沖液40--200mmol/l腺苷 0.2--20mmol/l穩(wěn)定劑10--50％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，其中試劑I的成分，乙醇、氧化型輔酶、過氧化物酶及醛脫氫酶等可以放在試劑II，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除肌苷及次黃嘌呤的污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40--200mmol/l
單價磷酸鹽 0.2--10mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l試劑II核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l過氧化物酶 500--50000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--50％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l腺苷 0.2--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l三劑的配方不僅限于上述配方，其中試劑I的成分，乙醇、氧化型輔酶等可以單獨或同時放在試劑II或試劑III中，單價磷酸鹽可以放在試劑II中；試劑II中的成分，核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶及醛脫氫酶等中任何單獨或任何組合也可以放在試劑I；過氧化物酶及醛脫氫酶等中單獨或二者可以放在試劑III中，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
緩沖劑的pH范圍為6.5-10.5。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上氧化型輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑為總體積的10-80％(或者10--50mmol/l)，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺、鹽或腺苷二磷酸等中的一種或一種以上。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l腺苷1--5mmol/l單價磷酸鹽 2--10mmol/l核苷磷酸酶 5000--20000U/l黃嘌呤氧化酶5000--20000U/l乙醇5--10mmol/l過氧化物酶 10000--20000U/l氧化型輔酶 1--2mmol/l醛脫氫酶10000--20000U/l由于本發(fā)明完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)源肌苷、次黃嘌呤及過氧化氫的污染，消除內(nèi)源肌苷、次黃嘌呤及過氧化氫的作用發(fā)生在整個反應(yīng)時間段的前半部分，在后半段時間受污染的內(nèi)源肌苷、次黃嘌呤及過氧化氫已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時間測試腺苷脫氨酶活性所需要的肌苷都是產(chǎn)生于腺苷脫氨酶的活性。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑盒包括緩沖液 100mmol/l腺苷1mmol/l單價磷酸鹽 2mmol/l核苷磷酸酶 10000U/l黃嘌呤氧化酶10000U/l乙醇5mmol/l過氧化物酶 20000U/l氧化型輔酶 1mmol/l醛脫氫酶10000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子肌苷+單價磷酸鹽 核苷磷酸酶 次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧 黃嘌呤氧化酶 尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇 過氧化物酶 乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
本實施例應(yīng)用腺苷脫氨酶偶聯(lián)核苷磷酸酶生成次黃嘌呤，再偶聯(lián)黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤氧化生成尿酸鹽及過氧化氫，再偶聯(lián)經(jīng)過氧化物酶反應(yīng)生成乙醛，在氧化型輔酶的幫助下，醛脫氫酶將乙醛氧化成乙酸，同時氧化型輔酶還原成還原性輔酶，還原性輔酶在波長340nm處有吸收峰，因此從測定主波長340nm吸光度上升的速度，可以測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
實施例二(雙劑)本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有試劑I緩沖液120mmol/l單價磷酸鹽8mmol/l乙醇 8mmol/l氧化型輔酶2mmol/l核苷磷酸酶20000U/l黃嘌呤氧化酶 20000U/l過氧化物酶10000U/l醛脫氫酶 20000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II
緩沖液 120mmol/l腺苷 5mmol/l穩(wěn)定劑 50mmol/l測定腺苷脫氨酶活性時，溫度控制在30℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子肌苷+單價磷酸鹽 核苷磷酸酶 次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧 黃嘌呤氧化酶 尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇 過氧化物酶 乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在10分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 80mmol/l單價磷酸鹽 5mmol/l乙醇 7mmol/l氧化型輔酶 2mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l試劑II
緩沖液 80mmol/l核苷磷酸酶 5000U/l黃嘌呤氧化酶5000U/l過氧化物酶 15000U/l醛脫氫酶15000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 80mmol/l腺苷3mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度30℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子肌苷+單價磷酸鹽 核苷磷酸酶 次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧 黃嘌呤氧化酶 尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇 過氧化物酶 乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在10分鐘。
實施例四本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有
試劑I緩沖液 120mmol/l單價磷酸鹽 6mmol/l乙醇 8mmol/l氧化型輔酶 2mmol/l核苷磷酸酶 15000U/l黃嘌呤氧化酶 15000U/l過氧化物酶 15000U/l醛脫氫酶 15000U/l穩(wěn)定劑 40％(總體積)試劑II緩沖液 120mmol/l腺苷 3mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l在生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測樣品與試劑的體積比例為2/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-2170。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨離子肌苷+單價磷酸鹽 核苷磷酸酶 次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧 黃嘌呤氧化酶 尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇 過氧化物酶 乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在10分鐘。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種測定腺苷脫氨酶活性的方法，步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷、單價磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化物酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單價磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化物酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度上升的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于所述步驟2)為，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm，測試副波長405nm以上，吸光度上升的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于被測樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
5.一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，包括緩沖劑40——200mmol/l腺苷 0.2——20mmol/l單價磷酸鹽0.2——10mmol/l核苷磷酸酶 500——50000U/l黃嘌呤氧化酶500——50000U/l乙醇1——30mmol/l過氧化物酶 500——50000U/l氧化型輔酶 0.5——20mmol/l醛脫氫酶500——50000U/l穩(wěn)定劑 10——50％
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨、鹽或腺苷二磷酸中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑緩沖劑為三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種，pH范圍為6.5-10.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述氧化型輔酶為NADP+、NAD+、thio-NAD+還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定腺苷脫氨酶活性的方法，同時本發(fā)明還涉及腺苷脫氨酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、腺苷、單價磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化物酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶及穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/32GK1746316SQ20041004190
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月8日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中