專利名稱：沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌多重pcr快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種鑒定細(xì)菌，特別是鑒定沙門氏菌(Salmonella)、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)的檢測方法。
背景技術(shù)：
沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌是重要的人獸共患病原菌，是世界衛(wèi)生組織(WHO)所列最主要的兩種食源性病原細(xì)菌。沙門氏菌不僅能導(dǎo)致動物疾病，還能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例占首位或第二位；李斯特菌是一種能引起動物和人類流產(chǎn)、敗血癥和腦膜炎等疾病的食源性病原體，新生兒、老年人、孕婦及免疫缺陷病人是李斯特菌感染的高危人群。世界各國，包括美國等發(fā)達(dá)國家，沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌食物污染日益增多，我國也不例外，給國家經(jīng)濟(jì)造成巨大損失，同時嚴(yán)重威脅著人民的身體健康和生命安全。在發(fā)達(dá)國家臨床李斯特菌病的發(fā)病率大約為2～15/10萬，死亡率為13～34％。在美國每年大約有2500例李斯特菌病病例，其中500例死亡。因此，盡管李斯特菌病的病例不如其他食源性疾病來的常見，它仍然成為僅次于沙門氏菌感染的第二號致命的食源性感染性疾病。
沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌作為致病菌檢測的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在公共衛(wèi)生、食品安全、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗(yàn)檢疫中均是必需檢測的項(xiàng)目，有重要社會、經(jīng)濟(jì)的意義。傳統(tǒng)的沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌檢測常用分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法，分別采用不同的檢驗(yàn)程序、方法，分別報告，確診檢驗(yàn)結(jié)果至少需5～7天，檢驗(yàn)方法存在繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力、特異性低等缺陷，特別是我國已加入世界貿(mào)易組織(WTO)，國際貿(mào)易量與日俱增。因此，快速、準(zhǔn)確、簡便的細(xì)菌檢測方法將是發(fā)展的方向。建立一種能同時快速檢測沙門氏菌和產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的檢測方法具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于為人們提供一種能快速鑒定出樣本是否被沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌污染的檢測方法。
本發(fā)明提供的方法是將沙門氏菌和大腸桿菌(YZU_DSL1)分別采用熱裂解法提取各自DNA模板、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌采用酶解法提取DNA模板，然后進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個基因，最后經(jīng)電泳鑒定。
由于單個疑似樣本中的特征基因數(shù)量極少，本發(fā)明通過將樣本的DNA，一次性同時對可能存在的沙門氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因、產(chǎn)單核細(xì)胞溶血素基因擴(kuò)增和一定存在的大腸桿菌(YZU_DSL1)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的基因復(fù)制片段，比較方便，一次就能鑒定是否為沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌，并對陰性結(jié)果的反應(yīng)體系的正確性作出判斷。本發(fā)明較經(jīng)典方法的細(xì)菌分離、鑒定和血清學(xué)分型試驗(yàn)方法快速、準(zhǔn)確。
該檢測系統(tǒng)具有可監(jiān)測性。擴(kuò)增結(jié)果無任何條帶時，表明檢測系統(tǒng)無效；擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)300bp、495bp、850bp三條帶中的任一條帶時，表明檢測系統(tǒng)有效。擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)300bp、495bp或495bp時，表明結(jié)果為沙門氏菌；擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)300bp、850bp或850bp時，表明結(jié)果為產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌；擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)300bp、495bp、850bp、或495bp、850bp時，表明結(jié)果為沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌。
另外，本發(fā)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，采用引物I、II，對沙門氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物I5’-[ACT GGC GTT ATC CCTTTC TCT GCT G]-3’；引物II5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAAGAG A]-3’。
進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，采用引物hly P1和hly P2對產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌溶血素基因(hly)進(jìn)行擴(kuò)增，所述hly P15’-[CCT AAG ACG CCA ATC GAAAAG AAA]-3’；所述hly P25’-[TAG TTC TAC ATC AAC TGA GAC AGA]-3’。
進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，采用引物I、II，對大腸桿菌(YZU_DSL1)進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物I5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G]-3’；引物II5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A]-3’。
具體實(shí)施例一、引物根據(jù)沙門氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因高度保守序列和產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌溶血素基因(hly)高度保守序列設(shè)計(jì)二對特異性引物(引物I、引物II；hly-P1、hly-P2)，上述二對特異性引物由上海博亞生物有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增出的目的片段大小分為沙門氏菌495bp；產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌850bp；指示帶(大腸桿菌)300bp。
沙門氏菌引物I5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G]-3’引物II5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A]-3’產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌hly-P15’-[CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA]-3’hly-P25’-[TAG TTC TAC ATC AAC TGA GAC AGA]-3’大腸桿菌(指示菌)引物I5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G]-3’引物II5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A]-3’二、多重PCR1、DNA模板制備1)沙門氏菌DNA模板制備將沙門氏菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h，取細(xì)菌培養(yǎng)液0.5ml，置于Eppendorf管中，2000rpm離心20min，用滅菌蒸餾水洗滌兩次，最后用1ml蒸餾水懸浮，隔水煮沸15min，8000rpm離心15min，取上清，即成沙門氏菌DNA模板溶液。
2)產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌DNA模板制備產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌在BHI(購自美國Difco公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；取250μl過夜培養(yǎng)物加入Eppendorf管，13000rpm離心10分鐘；棄上清液，用95μl 1×緩沖液混勻；加4μl溶菌酶(50mg/ml)，顛倒混勻；室溫孵育15分鐘；加1μl蛋白酶K(20mg/ml)，震蕩數(shù)秒鐘；58℃孵育，直至菌液變清；95℃加熱8分鐘，使酶失活；離心取上清液，即成產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌DNA模板溶液，備用。
3)大腸桿菌(YZU DSL1)DNA模板制備將大腸桿菌(YZU DSL1)接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h，取細(xì)菌培養(yǎng)液0.5ml，置于Eppendorf管中，2000rpm離心20min，用滅菌蒸餾水洗滌兩次，最后用1ml蒸餾水懸浮，隔水煮沸15min，8000rpm離心15min，取上清，即成DNA模板溶液。將DNA模板溶液用超純水作100倍稀釋后，即成大腸桿菌(YZU DSL1)DNA模板，備用。
2、多重PCR擴(kuò)增①10×PCR Buffer(含1.5mmol/LMg2+) 2.5μl②dNTP(2.5μmol/L) 1.5μl③沙門氏菌引物I和引物II(濃度均為5μmol/l)各1μl產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌引物hly-P1和hly-P2(濃度為20μmol/L) 各1μl④大腸桿菌(YZU_DSL1)DNA模板(100倍稀釋) 1μl⑤待檢測樣品模板沙門氏菌 1μl產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌 2μl⑥Taq聚合酶(即華美公司普通PCR擴(kuò)增酶) 1μl⑦滅菌超純水 12μl總體積 25μl擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性2min；95℃變性10s，60℃退火35s，72℃延伸40s，共32個循環(huán)；72℃延伸10min后，4℃保存。
三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μl，點(diǎn)樣于12g/L瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL溴化乙錠)，以1000bp Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子參照，以5V/cm的電場強(qiáng)度于1倍的TAE電泳緩沖液中電泳2小時，紫外線鑒定，凝膠成像系統(tǒng)拍照。
四、PCR產(chǎn)物的序列鑒定利用DNA回收試劑盒(大連寶生物公司)從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆(pGEM-T vector)和DNA序列測定。DNA序列測定由上海聯(lián)合基因公司完成。
五、總結(jié)本試驗(yàn)利用兩對特異性引物，采用優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)系統(tǒng)，成功地?cái)U(kuò)增出沙門氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌溶血素基因(hly)、大腸桿菌(YZU_DSL1)，PCR產(chǎn)物大小分別為沙門氏菌495bp；產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌850bp；指示帶(大腸桿菌)300bp。DNA序列測定結(jié)果與報道的三種基因序列一致。
權(quán)利要求
1.沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌多重PCR快速檢測方法，其特征在于先將沙門氏菌和大腸桿菌(YZU_DSL1)分別采用熱裂解法提取各自DNA模板、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌采用酶解法提取DNA模板，然后進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個基因，最后經(jīng)電泳鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌多重PCR快速檢測方法，其特征在于進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，采用引物I、II，對沙門氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物I5’-[ACT GGC GTT ATCCCT TTC TCT GCT G]-3’；引物II5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGGTAA GAG A]-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌多重PCR快速檢測方法，其特征在于進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，采用引物hly P1和hly P2對產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌溶血素基因(hly)進(jìn)行擴(kuò)增，所述hly P15’-[CCT AAGACG CCAATC GAA AAG AAA]-3’；hly P25’-[TAG TTC TAC ATC AACTGA GAC AGA]-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌多重PCR快速檢測方法，其特征在于進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，采用引物I、II，對大腸桿菌(YZU_DSL1)進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物I5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTCTCT GCT G]-3’；引物II5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAGA]-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定細(xì)菌，特別是鑒定沙門氏菌(Salmonella)、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)的檢測方法。先將沙門氏菌和大腸桿菌(YZU_DSL1)分別采用熱裂解法提取各自DNA模板、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌采用酶解法提取DNA模板，然后進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個基因，最后經(jīng)電泳鑒定。本發(fā)明通過將樣本的DNA，一次性同時對可能存在的沙門氏菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子基因、產(chǎn)單核細(xì)胞溶血素基因擴(kuò)增和一定存在的大腸桿菌(YZU_DSL1)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的基因復(fù)制片段，比較方便，一次就能鑒定是否為沙門氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌，并對陰性結(jié)果的反應(yīng)體系的正確性作出判斷。本發(fā)明較經(jīng)典方法的細(xì)菌分離、鑒定和血清學(xué)分型試驗(yàn)方法快速、準(zhǔn)確。
文檔編號C12Q1/68GK1603422SQ20041004161
公開日2005年4月6日 申請日期2004年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月2日
發(fā)明者焦新安, 黃金林, 潘志明, 文其乙, 劉秀梵, 周曉輝, 殷月蘭, 孫林 申請人:揚(yáng)州大學(xué)