專利名稱：Npm1基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方法及診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外診斷檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及NPMl基因突變的液相芯片聯(lián)合檢 測(cè)方法及其診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
核磷蛋白(nucleophosmiiNPM)基因定位于人類染色體5q35，含有12個(gè)外顯子， 編碼由294個(gè)氨基酸組成的NPM蛋白。NPMl參與核糖體的合成和中心體復(fù)制以調(diào)控細(xì)胞增 殖和周期進(jìn)程。NPMl突變僅累及第12號(hào)外顯子，目前有超過(guò)40種不同的突變亞型，其中 絕大多數(shù)包含了 12號(hào)外顯子4個(gè)堿基的插入。其中最常見(jiàn)的是NPMl-mutA，占所有突變的 75% -80%，它是在野生型NPMl核苷酸序列上第956-959位上插入1個(gè)TCTG4個(gè)核苷酸而 形成串聯(lián)重復(fù)序列。NPMl-mutB和NPMl-mutD各占10%和5%，分別插入的是CATG和CCTG ； 其余突變較少見(jiàn)。NPMl基因突變是目前急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中最常見(jiàn) 的突變形式，約占所有AML的35 %，而在正常核型的AML中可占46 % -62 %。AML是一組高 度異質(zhì)性疾病，正常核型AML約占成人原發(fā)AML患者的40% -50%,是中危組細(xì)胞遺傳學(xué) 分類中人數(shù)最多的一個(gè)亞型，也是目前研究的熱點(diǎn)之一。最近國(guó)外幾個(gè)大規(guī)模的多中心研 究相繼顯示，在具有分子異質(zhì)性的正常核型AML患者中，46% -62%可檢測(cè)到核磷蛋白成員 NPMl基因突變及(或)表達(dá)的改變，它在AML的診斷、分型及判斷預(yù)后與監(jiān)測(cè)微小殘留病灶 等方面有重要價(jià)值。另外，近來(lái)有報(bào)道顯示在骨髓增生異常綜合癥(MDS)患者中，也存在著NPMl突變。目前，白血病和骨髓增生異常綜合癥主要是依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳 學(xué)、分子生物學(xué)等檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行診斷和檢測(cè)分型。細(xì)胞形態(tài)學(xué)受主觀因素影響，臨床診斷 的一致率僅為70%左右。核型分析和顯帶技術(shù)等細(xì)胞遺傳學(xué)方法是在全基因組水平篩查 染色體易位，容易漏檢許多染色體的微小異常。免疫學(xué)方法具有較高的假陽(yáng)性率和假陰性 率，并且無(wú)法做到早期診斷。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的分子生物學(xué)檢測(cè)白血病基因突變的方 法中，熒光原位雜交技術(shù)(FISH)只能進(jìn)行定性檢測(cè)、操作復(fù)雜；熒光定量PCR存在著檢測(cè)通 量的局限性，所以都還不能真正滿足臨床診斷檢測(cè)的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片(Biochip) 技術(shù)存在著可重復(fù)性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點(diǎn)。因此臨床上需要有一種 檢測(cè)方法，能夠迅速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地對(duì)白血病的多種基因突變進(jìn)行聯(lián)合并行檢測(cè)，液相芯片 (xMAP)技術(shù)正是這樣一種新型檢測(cè)技術(shù)。液相芯片能夠?qū)ι倭繕颖具M(jìn)行定性、定量檢測(cè)，具有高通量、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、 靈敏度高、線性范圍寬等突出優(yōu)點(diǎn)。該系統(tǒng)是由許多微球?yàn)橹饕|(zhì)構(gòu)成的，在微球的制造 過(guò)程當(dāng)中，摻入了兩種不同的紅色分類熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例不同，把球形基質(zhì)分為 100種，可以標(biāo)記上100種不同的探針?lè)肿樱芡瑫r(shí)對(duì)一個(gè)樣品中多達(dá)100種不同的目標(biāo)分 子進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)物的不同，微球表面可以共價(jià)結(jié)合各種各樣的核酸檢測(cè)探針，在雜交 反應(yīng)進(jìn)行時(shí)再加上熒光標(biāo)記。在同一反應(yīng)體系中可以同時(shí)加入不同的檢測(cè)微球，這樣就可
4以利用少量的樣本進(jìn)行快速、高通量的檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)微流體技術(shù)將微球排成單列 快速流經(jīng)液相芯片檢測(cè)儀，每個(gè)微球可同時(shí)被兩束激光檢測(cè)到，紅色激光激發(fā)微球上的紅 色分類熒光，將各個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)分開(kāi)來(lái)而定性；綠色激光則激發(fā)結(jié)合在待測(cè)樣本上的熒 光標(biāo)記進(jìn)行定量。當(dāng)標(biāo)記好的待測(cè)樣本與特定微球上的探針結(jié)合在一起時(shí)，兩束激光所激 發(fā)的光均可被檢測(cè)到。最后，通過(guò)計(jì)算機(jī)的高速數(shù)字信號(hào)處理器，可以自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析得出特 定微球上的平均熒光強(qiáng)度，從而確定檢測(cè)物的種類和數(shù)量。本發(fā)明基于液相芯片技術(shù)的高通量、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、靈敏度高、線性范圍寬 等突出優(yōu)點(diǎn)，對(duì)NPMl的多種基因突變進(jìn)行聯(lián)合并行檢測(cè)，能夠在臨床檢測(cè)上得到更好的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種NPMl基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方法及診斷 試劑盒。該方法及試劑盒包含對(duì)多種NPMl基因突變的聯(lián)合檢測(cè)，可以對(duì)急性髓系白血病 (AML)和骨髓增生異常綜合癥(MDS)的早期診斷提供重要的參考依據(jù)，同時(shí)對(duì)患者進(jìn)行療 效觀察、預(yù)后及微小殘留疾病進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。本檢測(cè)方法及診斷試劑盒具有高靈敏度、高特 異性、高準(zhǔn)確度、檢測(cè)迅速等優(yōu)點(diǎn)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下在本發(fā)明的一方面，提供一種NPMl基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)包含多種不同熒光編碼的羧基微球beads ；每種微球上分別共價(jià)結(jié)合針對(duì) NPMl的多種突變基因的mRNA所設(shè)計(jì)的特異性核酸探針；所述NPMl的多種突變基因包含以 下任意一種基因或任意組合的多種基因NPMl-mutA(SPNPMl mutation ·Α)、NPMl_mutB (即 NPMl mutation B)、NPMl-mutD (艮口 NPMl mutation D)，即所述 NPMl 的多種突變基因可以 是NPMl-mutA、NPMl-mutB、NPMl-mutD中的任意一種或加上其它基因，也可以是NPMl_mutA、 NPMl-mutB、NPMl-mutD中的任意兩種基因組合或加上其它基因，也可以是NPMl_mutA、 NPMl-mutB和NPMl-mutD三種基因組合或加上其它基因；(2)針對(duì)多種不同的NPMl突變基因的mRNA，分別設(shè)計(jì)上下游引物，對(duì)不同的突變 基因的mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物；(3)含有特異性核酸探針的微球與NPMl突變基因mRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后， 加入鏈霉親和素_藻紅蛋白(Str印tavidin-PE)，通過(guò)液相芯片xMAP法檢測(cè)熒光信號(hào)；(4)將檢測(cè)到的熒光信號(hào)與內(nèi)參基因的熒光信號(hào)進(jìn)行比較，從而確定檢測(cè)樣品中 是否含有NPMl突變基因，和/或樣品中突變基因的表達(dá)狀況。以上檢測(cè)方法的步驟(1)中，所述的微球是平均直徑為5.6μπι，結(jié)合了不同熒光 染料的聚苯烯微球，即色彩編碼微球(color-coded beads)。步驟(1)中，所述的共價(jià)結(jié)合于微球上的針對(duì)NPMl的多種突變基因的特異性核酸 探針，包括如下序列(其中5’端含氨基修飾)NPMl-mutA :5，-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 1 所 示；NPMl-mutB :5，-AminolinkerC12 CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID N0. 2 所 示；
NPMl-mutD 5' -AminolinkerC12 TCCACTGCCAGGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 3 所 示；或者包含有上述序列(含互補(bǔ)序列)的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；或者與上述序列(含互補(bǔ)序列)同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。步驟(2)中，所述的針對(duì)NPMl不同突變基因的mRNA所設(shè)計(jì)的上下游引物，包括如 下序列(其中上游引物5’端含生物素標(biāo)簽)NPMl-mutA 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 5 所示；NPMl-mutB 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3',如 SEQ ID NO. 6 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 7 所示；NPMl-mutD 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3',如 SEQ ID NO. 8 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID N0. 9 所示；或者包含有上述序列(含互補(bǔ)序列)的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；或者與上述序列(含互補(bǔ)序列)同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。步驟⑷中，所述的內(nèi)參基因Abelson基因的引物和探針序列如下上游引物5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；下游引物5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 11 所示；探針5，-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID N0. 12 所示；或者包含有上述序列(含互補(bǔ)序列)的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列；或者與上述序列(含互補(bǔ)序列)同源性大于85%的序列；或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)多種NPMl基因突變的診斷試劑盒，包含共價(jià) 結(jié)合了 NPMl突變基因mRNA特異性探針的微球混合物、結(jié)合了 Abelson基因探針的微球、 NPMl突變基因mRNA的上下游引物、Abelson基因的上下游引物、鏈霉親和素-藻紅蛋白 Str印tavidin-PE、質(zhì)控品(陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照)。以上試劑盒中所述的質(zhì)控品包含陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中陽(yáng)性對(duì)照為含有各種 突變基因質(zhì)粒的混合液(包括含Abelson基因的質(zhì)粒)，陰性對(duì)照品為不含有突變基因及 Abelson基因的質(zhì)粒溶液；所述的微球混合物，根據(jù)不同檢測(cè)樣品的需要自由組合。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)多種NPMl基因突變的診斷試劑盒在檢測(cè)體 外樣品，對(duì)急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合癥(MDS)的早期診斷、復(fù)發(fā)、治療方 案的確定以及預(yù)后判斷中的應(yīng)用。由于本發(fā)明利用了液相芯片技術(shù)，使檢測(cè)方法及試劑盒具有高靈敏度、高特異性、 高通量、穩(wěn)定性好、檢測(cè)迅速、準(zhǔn)確等突出優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)PMl突變基因進(jìn)行定性和定量檢 測(cè)，能在臨床檢測(cè)上得到更好的應(yīng)用。此外，本發(fā)明可以對(duì)急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合癥(MDS)的早期診斷提供重要的參考依據(jù)，同時(shí)對(duì)患者進(jìn)行療效觀察，預(yù)后與 微小殘留疾病的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供重要的依據(jù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但并不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。所述的 實(shí)施例只提供闡明核酸探針、試劑盒及其制作和應(yīng)用方法而不為其所限制。期間各種變化 形式在本發(fā)明和所述的權(quán)項(xiàng)的范圍內(nèi)是可預(yù)期的。實(shí)驗(yàn)材料引物和探針均由invitrogen公司合成；Trizol購(gòu)自invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄 cDNA合成試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；多重PCR試劑盒、不同編號(hào)的微球(表面羧基修飾)、 鏈霉親和素_藻紅蛋白均購(gòu)置于QIAGEN公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳 二亞胺鹽酸鹽(EDC)購(gòu)置于Pierce公司；2-(N-嗎啉)-乙磺酸(MES)、N_月桂酰基氨酸鈉 (Sarkosyl)、四甲基氯化銨(TMAC)均購(gòu)置于sigma公司。緩沖液和雜交液的配置偶聯(lián)緩沖液，PH4.5250mlMES4. 88g ；1.5 X TMAC 雜交溶液250ml5M TMAC225ml20% Sarkosyl1.88mlIM Tris-HCl, ΡΗ8. O18.75ml0. 5Μ EDTA, ΡΗ8. 03. OmldH201. 37ml ；1.5 X TMAC 雜交溶液250ml5M TMAC150ml20% Sarkosyl1.25mlIM Tris-HCl, PH8. 012.5ml0. 5M EDTA, PH8. 02. OmldH2084.25ml;TE 緩沖液，PH8. 0500mlIM Tris-HCl, PH8. 05ml0. 5M EDTA, PH8. 0ImldH20444ml實(shí)施例1 1種NPMl基因突變的液相芯片檢測(cè)方法具體的檢測(cè)方法包括如下步驟一 .檢測(cè)NPMl-mutA突變基因的微球混合液的制備1.按照以下序列合成寡核苷酸探針NPMl-mutA :5，-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 1 所 示；Abelson 基因:5，_AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 12所示；2.將以上含有氨基修飾的寡核苷酸探針?lè)謩e與編號(hào)為11、21號(hào)的2種羧基微球偶 聯(lián)2. 1取出一小份_20°C保存的新鮮干粉狀EDC平衡到室溫；2. 2用dH20分別溶解NPMl-mutA和Abelson的寡核苷酸探針，濃度為lmM(lnmol/ μ 1)；2. 3分別全速渦旋編號(hào)為11、21號(hào)的2種羧基微球儲(chǔ)存懸液至少3min，產(chǎn)生均一 的微球懸液；2. 4分別取2. 5 X IO6微球儲(chǔ)存懸液到2個(gè)離心管中；2. 5 10，OOOg,離心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶聯(lián)緩沖液，重懸微球，渦旋震蕩20 秒；2. 7將2種濃度為ImM寡核苷酸探針?lè)謩e用dH20以1 10的比例稀釋，使其濃度 為 0. Inmol/μ 1 ；2. 8每種探針各加入2 μ 1 (濃度為0. Inmol/μ 1)到混勻的相應(yīng)的微球里，渦旋混 合；2. 9用dH20配置10mg/ml的新鮮EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC 的使用)； 2. 10加入2. 5μ 1 10mg/ml EDC的新鮮EDC溶液分別到2種微球中(25 μ g終濃度 約為0. 5 μ g/ μ 1)渦旋混勻；2. 11室溫避光孵育30min ；2. 12用dH20配置第二份10mg/ml的EDC新鮮溶液(注意EDC粉末如果潮解，則 應(yīng)丟棄，建議每一步偶聯(lián)過(guò)程都使用新鮮的EDC粉末)；2. 13 2種微球中各加入2. 5 μ 1 10mg/ml的EDC新鮮溶液，渦旋混勻；2. 14室溫避光孵育30min ；2. 15 2 種偶聯(lián)微球中各加入 Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 16 10，OOOg,離心，l_2min ；2. 17移除上清，分別用Iml 0. 1 % SDS重懸2種偶聯(lián)微球，振蕩混勻；2. 18 10，OOOg,離心，l_2min ；2. 19移除上清，分別加入100 μ 1 TE, ΡΗ8. 0，渦旋混合20s,重懸微球；2. 20用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)2種偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球；a.用dH20將偶聯(lián)微球以1 100稀釋；b.渦旋震蕩充分混勻；c.取10 μ 1到細(xì)胞計(jì)數(shù)器上；d.數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)器上4個(gè)角大格的微球總量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球總量)X 2. 5 X 100 (稀釋倍數(shù))。3.微球混合液的配置將上述偶聯(lián)了寡核苷酸探針的微球，如下列NPMl-mutA探針微球11和Abelson 探針微球21，等比例混合，各種微球的終濃度為1500個(gè)/μ 1，2-8°C避光保存。二 .樣本的制備
取1-5號(hào)AML或MDS患者的臨床樣本，分別按照下面的步驟提取RNA 1.淋巴細(xì)胞提取取新鮮全血2ml加Iml 3%檸檬酸鈉，混勻后3000r/min離心， 10min，4°C，取血球?qū)由蠝\黃色層即為淋巴細(xì)胞；2.取1個(gè)離心管(經(jīng)DEPC水處理)加入淋巴細(xì)胞液150 μ 1.然后加Iml TRIZ0L， 室溫放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 離心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min ；5. 40C 12，OOOg 離心 15min ；6.吸取上層水相，至另一離心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1異丙醇混勻，室溫放置5-lOmin ；8. 40C 12，OOOg 離心 IOmin,棄上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；10. 40C 8，OOOg 離心 5min，盡量棄上清；11.室溫晾干或真空干燥5-lOmin ；12.用 50ul RNase-free dH20 溶解 RNA 樣品，55_60°C，5-lOmin ；13.測(cè)OD值定量RNA濃度。三.多重RT-PCR按照如下方法對(duì)上述的1-5號(hào)樣本的mRNA進(jìn)行多重逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增l.cDNA第一鏈的合成①取一經(jīng)DEPC處理過(guò)的微量離心管，置于冰上，建立下列反應(yīng)體系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ 1) 1 μ 1RNase-free water forward to 12 μ 1輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機(jī)稍微離 心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應(yīng)液；5 X react ion buffer4 μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1)1 μ 1IOmMdNTPsMix2μ 1輕輕混勻反應(yīng)液，用冷凍離心機(jī)稍微離心收集管壁上的反應(yīng)液到管底；④離心管于37°C溫育5分鐘；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，終體積為 20 μ 1 ；⑥離心管于42°C反應(yīng)60分鐘；⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應(yīng)，之后迅速取出置于冰中冷卻；2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物NPMl-mutA 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID N0. 4 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID N0. 5 所示；
Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID NO. 11 所示。2. 2 多重 PCR 反應(yīng)采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR試劑盒，體系如下終體積為50 μ 1(2 X QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 中含熱啟動(dòng) TaqDNA 酶、MgCl2 和 dNTPMix。)PCR 擴(kuò)增程序:95 V 15min ；94°C 30s，55°C 90s, 72°C 90s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ； 4°C保溫。四.寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物的雜交1.選取步驟一中配置的寡核苷酸探針微球混合物；2.渦旋震蕩20s，混勻微球；3.制備微球工作液，用1. 5 X TMAC雜交溶液稀釋偶聯(lián)微球至濃度為150個(gè)微球/ μ 1。(注每個(gè)反應(yīng)需要33μ 1的微球工作液)；4.渦旋震蕩20s，混勻微球工作液；5.向樣本孔、陽(yáng)性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔內(nèi)分別加入33μ 1微球工作液；6.向每個(gè)樣品孔內(nèi)分別加入1-5號(hào)患者樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和TE溶液(PH為 8. 0)，總體積為17 μ 1 ；7.用排槍上下吸打，溫柔混勻反應(yīng)液；8.蓋上反應(yīng)蓋避免蒸發(fā)，在95-100°C下孵育l_3min，使樣品中的寡核苷酸去掉二 級(jí)結(jié)構(gòu)；9.在雜交溫度下孵育反應(yīng)板15min ；10.制備新鮮的檢測(cè)混合液，用IXTMAC雜交溶液稀釋鏈霉親和素藻紅蛋白溶液 至10 μ g/ml (每個(gè)反應(yīng)需要25 μ 1的檢測(cè)混合液)；11.向每孔加入25μ 1的檢測(cè)混合液，用排槍上下吸打，溫柔混勻；12.在雜交溫度下孵育5min ；上述步驟可以通過(guò)PCR儀按以下方案編程將其合并95°C, l-3min ；雜交溫度，forever；13.在液相芯片儀(LiquiChip 200，QIAGEN和Luminex公司)上，保持雜交溫度， 對(duì)各反應(yīng)孔進(jìn)行檢測(cè)分析，測(cè)定熒光MFI值。五.檢測(cè)結(jié)果及分析檢測(cè)結(jié)果(熒光MFI值)如表1所示表 1
0138]Template cDNA
0139]2 X QIAGEN Multiplex PCR Master Mix
0140]IOXPrimer mix
0141]RNase-free water
10 μ 1 25 μ 1 5 μ 1 10 μ 權(quán)利要求
一種NPM1基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)包含多種不同熒光編碼的羧基微球Beads，每種微球上分別共價(jià)結(jié)合針對(duì)NPM1的多種突變基因的mRNA所設(shè)計(jì)的特異性核酸探針；所述的NPM1的多種突變基因包含以下任意一種基因或任意組合的多種基因NPM1 mutA、NPM1 mutB和NPM1 mutD；(2)針對(duì)NPM1的多種突變基因的mRNA，分別設(shè)計(jì)上下游引物，對(duì)不同的突變基因的mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物；(3)含有特異性核酸探針的微球與NPM1突變基因mRNA的逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物混合雜交，加入鏈霉親和素 藻紅蛋白Streptavidin PE后，通過(guò)液相芯片xMAP方法檢測(cè)熒光信號(hào)；(4)將檢測(cè)到的熒光信號(hào)與內(nèi)參基因的熒光信號(hào)進(jìn)行比較，從而確定檢測(cè)樣品中是否存在NPM1突變基因，和/或樣品中突變基因的表達(dá)狀況。
2.如權(quán)利要求1所述的NPM1基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中， 所述的微球是平均直徑為5. 6 y m，結(jié)合了不同熒光染料的聚苯烯微球，即色彩編碼微球 Color-coded beads0
3.如權(quán)利要求1所述的NPM1基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中，所述 的共價(jià)結(jié)合于微球上的針對(duì)NPM1的多種突變基因的特異性核酸探針，包括如下序列，其中 5’端含氨基修飾NPMl-mutA :5，-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示； NPMl-mutB :5，-AminolinkerC12 CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示； NPMl-mutD :5，-AminolinkerC12 TCCACTGCCAGGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 3 所示； 或者包含有上述序列或其互補(bǔ)序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列； 或者與上述序列或其互補(bǔ)序列的同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
4.如權(quán)利要求1所述的NPM1基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中，所 述的針對(duì)不同NPM1突變基因的mRNA所設(shè)計(jì)的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’ 端含生物素標(biāo)簽NPMl-mutA 上游引物 5，-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示；下游 引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 5 所示；NPMl-mutB 上游引物 5，-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 6 所示；下游 引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 7 所示；NPMl-mutD 上游引物 5，-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 8 所示；下游 引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 9 所示；或者包含有上述序列或其互補(bǔ)序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列； 或者與上述序列或其互補(bǔ)序列的同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
5.如權(quán)利要求1所述的NPM1基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)中，所述 的內(nèi)參基因?yàn)锳belson基因，其引物和探針序列如下上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；2下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 11 所示； 探針 5，-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 12 所示； 或者包含有上述序列或其互補(bǔ)序列的向5’端或/和3’端延長(zhǎng)的序列； 或者與上述序列或其互補(bǔ)序列的同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
6.一種檢測(cè)NPM1基因突變的診斷試劑盒，其特征在于，包含了權(quán)利要求1中所述的共 價(jià)結(jié)合了 NPM1突變基因特異性探針的微球混合物及結(jié)合了 Abelson基因探針的微球、權(quán)利 要求1中所述的NPM1突變基因mRNA的上下游引物及Abelson基因的上下游引物、鏈霉親 和素-藻紅蛋白和質(zhì)控品。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)NPM1基因突變的診斷試劑盒，其特征在于，所述的微球混 合物，根據(jù)不同檢測(cè)樣品的需要自由組合。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)NPM1基因突變的診斷試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品 包含陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中陽(yáng)性對(duì)照為含有各種NPM1突變基因質(zhì)粒的混合液，包括含 Abelson基因的質(zhì)粒；陰性對(duì)照為不含有NPM1突變基因及Abelson基因的質(zhì)粒溶液。
9.一種如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)NPM1基因突變的診斷試劑盒在檢測(cè)體外樣品，對(duì)急性 髓系白血病和骨髓增生異常綜合癥的早期診斷、復(fù)發(fā)、治療方案的確定以及預(yù)后判斷中的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種核磷蛋白NPM1基因突變的聯(lián)合檢測(cè)方法及診斷試劑盒，通過(guò)對(duì)NPM1突變基因NPM1-mutA、NPM1-mutB、NPM1-mutD設(shè)計(jì)引物和探針，將探針與微球共價(jià)結(jié)合形成的探針微球混合物，與逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，加入鏈霉親和素藻紅蛋白后，可檢測(cè)出不同微球的熒光信號(hào)，從而確定待檢測(cè)樣品中是否含有NPM1基因突變及突變基因的表達(dá)狀況。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高靈敏度、高通量性、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)PM1基因突變進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，為急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合癥(MDS)的早期診斷、復(fù)發(fā)、治療方案的確定以及預(yù)后的判斷提供重要的參考依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101955994SQ20101020265
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者邵棠, 陳鳴 申請(qǐng)人:江蘇邁迪基因生物科技有限公司