專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物鼠疫疫情監(jiān)測(cè)與鼠疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，是一種檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒。
背景技術(shù)：
鼠疫是我國(guó)《傳染病法》規(guī)定的甲類(lèi)傳染病之一，是由鼠疫桿菌引起的一種動(dòng)物源性烈性傳染病，嚙齒類(lèi)是鼠疫的主要宿主動(dòng)物和傳染源。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)鼠疫自然疫源地12個(gè)類(lèi)型，分布于19個(gè)省區(qū)、近300個(gè)縣(市)，面積130多萬(wàn)km2，動(dòng)物間鼠疫處于持續(xù)活躍狀態(tài)，人間鼠疫連年發(fā)生，遠(yuǎn)距離傳播的危險(xiǎn)性增加。我國(guó)在疫源地內(nèi)設(shè)有專(zhuān)業(yè)鼠疫監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)，監(jiān)測(cè)結(jié)果是實(shí)施鼠疫控制措施的重要依據(jù)，免疫學(xué)方法檢測(cè)鼠疫Fl抗體是鼠疫監(jiān)測(cè)工作的重要內(nèi)容，并己列入了《鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)》WS279-2008。鼠疫監(jiān)測(cè)工作中檢測(cè)Fl抗體的標(biāo)本主要是釆自野生動(dòng)物，多數(shù)是各種小型嚙齒類(lèi)動(dòng)物，野外工作條件差，很難保證標(biāo)本質(zhì)量，腐敗變質(zhì)的標(biāo)本也要進(jìn)行檢驗(yàn)，間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)腐敗變質(zhì)標(biāo)本常出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，有時(shí)高滴度非特異性凝集反應(yīng)掩蓋陽(yáng)性反應(yīng)，導(dǎo)致陽(yáng)性標(biāo)本出現(xiàn)陰性結(jié)果；膠體金試驗(yàn)檢測(cè)鼠疫抗體不能定量，只有定性的意義；已知200余種動(dòng)物可自然感染鼠疫，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接法一種酶標(biāo)第二抗體只能檢測(cè)一種動(dòng)物的抗體，全面監(jiān)測(cè)疫源地內(nèi)的動(dòng)物，就要制備多種酶標(biāo)第二抗體，不僅工作量大，而且不同種動(dòng)物的酶標(biāo)第二抗體間效價(jià)差異大，很難比較不同種動(dòng)物間的鼠疫抗體含量，影響疫情監(jiān)測(cè)工作中對(duì)動(dòng)物鼠疫流行強(qiáng)度的評(píng)估。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒，克服了現(xiàn)有鼠疫監(jiān)測(cè)與診斷技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法(以下簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA夾心法)，用于檢測(cè)各種動(dòng)物血清、胸腔心血洗液、臟器組織浸液中的鼠疫菌的Fl抗體的方法，經(jīng)多次改進(jìn)，現(xiàn)己制成具體有效的檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的ELISA夾心法試劑盒，為動(dòng)物鼠疫監(jiān)測(cè)和診斷提供了準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便的檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的ELISA夾心法試劑盒，其包括酶標(biāo)記鼠疫抗原1支、鼠疫Fl抗原包被板1塊、抑制用凍干鼠疫Fl抗原 1支、酶標(biāo)記物保存液2ml X 1支、10 XPBS. T20ml X 1支、鼠疫Fl抗體陽(yáng)性對(duì)照2ml X 1支、 陰性對(duì)照2ml X 1支、顯色液A液6ml X 1支、顯色液B液6ml X 1支、顯色終止液6ml X 1支、
硫柳汞2mlXl支；所述抗原包被板為鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)記抗原為凍干辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原。
對(duì)上述本發(fā)明的技術(shù)方案可進(jìn)一步進(jìn)行如下的選擇或/和優(yōu)化 上述鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板按下述方法得到
(1)包被用試劑包被緩沖液0. 05mol/LNa2C03溶液4份與0. 05mol/LNaHC036份混合；
包被液含鼠疫Fl抗原濃度0. 1-0. 5 μ g/ml (即微克/毫升)的包被緩沖液；飽和包被液包被緩沖液1000ml，加牛血清白蛋白0. Ig或新生小牛血清20ml ； PBS. T 10XPBS. T 用 0. 9% NaCl 稀釋 10 倍；
(2)鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板測(cè)定包被液適用鼠疫Fl抗原濃度，每管加包被液200μ 1 (即微升)，28-37°C濕盒放置4小時(shí)，4-10°C放置4_16小時(shí)；
(3)飽和包被甩棄酶標(biāo)板管內(nèi)的包被液，每管加飽和包被液200μ1(即微升)，28-37°C 濕盒放置3小時(shí)；
(4)甩棄酶標(biāo)板管內(nèi)飽和包被液，在吸水紙上拍去管中水珠；每管加PBS.T200 μ 1 (即微升)浸洗，28-37°C濕盒放置3小時(shí)；甩棄PBS. T，流水沖洗5次，在吸水紙上用力拍打酶標(biāo)板，直到酶標(biāo)板管內(nèi)外無(wú)可見(jiàn)水珠；
(5)酶標(biāo)板直立放入37°C溫箱，每30分鐘鼓風(fēng)或開(kāi)門(mén)通風(fēng)1次，6-12小時(shí)干燥后取出， 酶標(biāo)板經(jīng)上述處理后即為鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板；
(6)將鼠疫Fl抗原板裝入塑料袋，封口；4-10°C干燥保存； 在上述方法中溶液濃度除注明外均為重量/容量。
上述凍干辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原即HRP-Fl按下述方法得到
(1)過(guò)碘酸鈉活化辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶的RZ> 3. 0簡(jiǎn)稱(chēng)HRP，稱(chēng)取HRP5mg 裝入12X 120mm試管，加入蒸溜水1ml，搖動(dòng)使HRP溶解；加入新鮮配制的1. 3%過(guò)碘酸鈉水溶液0. 5ml，混勻置4-10°C30分鐘；加入濃度按容量/容量的的乙二醇水溶液0. 5ml，室溫20-37°C放置30分鐘；
(2)透析法標(biāo)記鼠疫Fl抗原純化的5mg/ml鼠疫Fl抗原溶液1ml，與活化的HRP混勻，裝入透析袋，用0. 05mol/LpH9. 6碳酸鹽緩沖液4-10°C透析12-16小時(shí)；加入0. 5%硼氫化鈉溶液0. 2ml,置4-10°C冰箱中2小時(shí)；
(3)純化酶標(biāo)記物透析袋移入0.01mol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液即PBS200ml中透析 6-12小時(shí)，換PBS液2次；3000 X g離心10分鐘取上清，上清即為酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原溶液， ELISA夾心法測(cè)定效價(jià)，效價(jià)應(yīng)在1 :6000以上；
(4)分裝凍干酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原溶液用容量/容量含50%新生小牛血清的0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀釋到效價(jià)1 :100，分裝，凍干，_20°C保存；
在上述方法中溶液濃度除注明外均為重量/容量。
本發(fā)明的有益效果間接法一種酶標(biāo)記第二抗體只能檢測(cè)一種動(dòng)物的抗體；本發(fā)明檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體ELISA夾心法試劑盒的有益效果是，被測(cè)物是鼠疫Fl抗體，標(biāo)本經(jīng)高濃度殺菌劑殺菌，檢測(cè)過(guò)程安全；被測(cè)抗體經(jīng)包被抗原和酶標(biāo)抗原兩次特異性選擇結(jié)合，提高了檢測(cè)的特異性；酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值具有定量的意義，目測(cè)判定結(jié)果，可在無(wú)電源的野外現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用；增加了抑制試驗(yàn)程序，排除了非特異性反應(yīng)對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的干擾，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。ELISA夾心法檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體，酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原替代酶標(biāo)記第二抗體，一種酶標(biāo)記物可以檢測(cè)各種動(dòng)物的鼠疫Fl抗體，減少了制備多種酶標(biāo)第二抗體的麻煩及其質(zhì)量差異對(duì)結(jié)果的影響，特別適用于鼠疫疫源地調(diào)查和疫情監(jiān)測(cè)。
具體實(shí)施例方式 本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案和實(shí)際情況來(lái)確定具體的實(shí)施方式。
下述實(shí)施例中，無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法；溶液濃度除注明外均為重量/容量。
實(shí)施例1 檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒制備一、檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒制備
(一)檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒的組成
1.鼠疫Fl抗原板8管X 12條 1塊
2.酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原凍干 1支 3.抑制用鼠疫Fl抗原凍干 1支
4.酶標(biāo)記物保存液2ml 1支
5.10 X PBS. T20ml 1 瓶
6.鼠疫Fl抗體陽(yáng)性對(duì)照2ml 1支
7.鼠疫Fl抗體陰性對(duì)照2ml 1支
8.TMB顯色液A液6ml 1瓶B液6ml 1瓶
9.顯色終止液6ml 1瓶
10.硫柳汞2ml 1瓶
(二)各組分的制備方法 1.鼠疫Fl抗原板制備
(1)包被用試劑包被緩沖液0. 05mol/LNa2C03溶液4份與0. 05mol/LNaHC036份混合。
包被液含鼠疫Fl抗原濃度0. 1-0. 5 μ g/ml (即微克/毫升)的包被緩沖液； 飽和包被液包被緩沖液1000ml，加牛血清白蛋白0. Ig或新生小牛血清20ml ； PBS. T 10XPBS. T 用 0. 9% NaCl 稀釋 10 倍。
(2)鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板測(cè)定包被液適用鼠疫Fl抗原濃度，每管加包被液 200 μ 1 (即微升)，28-37°C濕盒放置4小時(shí)，4_10°C放置4-16小時(shí)；
(3)飽和包被甩棄酶標(biāo)板管內(nèi)的包被液，每管加飽和包被液200μ1(即微升)，28-37°C 濕盒放置3小時(shí)；
(4)甩棄酶標(biāo)板管內(nèi)飽和包被液，在吸水紙上拍去管中水珠；每管加PBS.T200 μ 1 (即微升)浸洗，28-37°C濕盒放置3小時(shí)；甩棄PBS. T，流水沖洗5次，在吸水紙上用力拍打酶標(biāo)板，直到酶標(biāo)板管內(nèi)外無(wú)可見(jiàn)水珠；
(5)酶標(biāo)板直立放入37°C溫箱，每30分鐘鼓風(fēng)或開(kāi)門(mén)通風(fēng)1次，6-12小時(shí)干燥后取出， 酶標(biāo)板經(jīng)上述處理后即為鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板；
(6)將鼠疫Fl抗原板裝入塑料袋，封口；4-10°C干燥保存； 在上述方法中溶液濃度除注明外均為重量/容量。
2.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原即HRP-Fl制備
(1)過(guò)碘酸鈉活化辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶的RZ> 3. 0簡(jiǎn)稱(chēng)HRP，稱(chēng)取HRP5mg 裝入12X 120mm試管，加入蒸溜水1ml，搖動(dòng)使HRP溶解；加入新鮮配制的1. 3%過(guò)碘酸鈉水溶液0. 5ml，混勻置4-10°C30分鐘；加入濃度按容量/容量的的乙二醇水溶液0. 5ml，室溫20-37°C放置30分鐘；
(2)透析法標(biāo)記鼠疫Fl抗原純化的5mg/ml鼠疫Fl抗原溶液1ml，與活化的HRP混勻，裝入透析袋，用0. 05mol/LpH9. 6碳酸鹽緩沖液4-10°C透析12-16小時(shí)；加入0. 5%硼氫化鈉溶液0. 2ml,置4-10°C冰箱中2小時(shí)；
(3)純化酶標(biāo)記物透析袋移入0.01mol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液即PBS200ml中透析 6-12小時(shí)，換PBS液2次；3000 X g離心10分鐘取上清，上清即為酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原溶液， ELISA夾心法測(cè)定效價(jià)，效價(jià)應(yīng)在1 :6000以上；
(4)分裝凍干酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原溶液用容量/容量含50%新生小牛血清的0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀釋到效價(jià)1 :100，分裝，凍干，_20°C保存；
在上述方法中溶液濃度除注明外均為重量/容量。
3.抑制用鼠疫Fl抗原0. lmol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液30ml，加硫柳汞0. lg，新生小牛血清20ml，加鼠疫Fl抗原2. 5mg，混勻，分裝，每支0. 2ml，凍干，_20°C保存。
4.酶標(biāo)記物保存液即甘油.PB制備0. lmol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液與等量丙三醇混合。
5. 10 X PBS. T 制備0· lmol/LNa2HP048 份和 0. lmol/LNaH2P042 份混合，每 1000ml， 加吐溫-200. 5ml，新生小牛血清10ml，硫柳汞0. lg。
6.鼠疫Fl抗體陽(yáng)性對(duì)照制備0. 01mol/LpH7. 2PBS480ml，加新生小牛血清10ml， 效價(jià)1 8000鼠疫Fl抗體血清10ml，硫柳汞0. lg。
7.陰性對(duì)照制備0. 01mol/LpH7. 2PBS500ml，加新生小牛血清IOml,加硫柳汞 0. Ig0 8. TMB顯色液制備
A 液0. 2mol/LNa2HP04500ml 與 0. lmol/L 檸檬酸 500ml 混合，加 30%的雙氧水 0. 5ml, 硫柳汞0. Igo B液3. 3-5. 5_四甲基聯(lián)苯胺250mg，無(wú)水乙醇100ml，加水900ml，硫柳汞0. lg。
9.顯色終止液制備蒸餾水450ml加硫酸50ml。
10. 硫柳汞硫柳汞lg，NaCllg，加蒸餾水至100ml。
上述制備好的各種試劑定量分裝，裝入檢測(cè)鼠疫抗體的ELISA夾心法試劑盒。
(三)試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)按說(shuō)明書(shū)配制試劑，并按ELISA夾心法程序檢測(cè)，檢測(cè)0. 01 μ g/ml鼠疫Fl抗體液， OD值> 0. 2 ；檢測(cè)陰性標(biāo)本，OD值< 0. 1。
實(shí)施例2 檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒的應(yīng)用方法一、ELISA夾心法檢測(cè)鼠疫Fl抗體的器材準(zhǔn)備與試劑配制
1. PBS. T 10 XPBS. T 用 0. 9%NaCl 稀釋 10 倍。
2. HRP-Fl貯存液每支HRP-Fl (凍干劑)加酶標(biāo)記物保存液溶解，混勻，_20°C保存，有效期6個(gè)月。
HRP-Fl應(yīng)用液=HRP-Fl貯存液按說(shuō)明書(shū)規(guī)定的量用PBS. T稀釋?zhuān)?°C可保存10天， 室溫1天內(nèi)使用。
3.抑制用鼠疫Fl抗原按說(shuō)明書(shū)規(guī)定的量用PBS. T溶解混勻。
4.顯色液顯色液A液和B液等量混合，避光保存1小時(shí)內(nèi)使用。
二、ELISA夾心法檢測(cè)鼠疫抗體的標(biāo)本準(zhǔn)備
1.動(dòng)物采血，分離血清，加硫柳汞或升汞殺菌防腐。
2.死亡小型動(dòng)物，剪開(kāi)胸腔，剪碎心臟，吸出胸腔心血洗液，2000X g離心5分鐘或靜置1小時(shí)后取上清液，緊急情況下，可用注射器針頭插入棉球抽濾。加硫柳汞或升汞殺菌防腐；
3.裝血清、胸腔心血洗液試管封口后，用消毒液浸泡消毒試管外部，供免疫學(xué)檢驗(yàn)。
三、ELISA夾心法檢測(cè)鼠疫抗體初篩(定性)試驗(yàn)
1.排列鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板(蘭頭)反應(yīng)小管根據(jù)標(biāo)本和陽(yáng)性、陰性對(duì)照的數(shù)量，把小管安裝在編號(hào)的酶標(biāo)反應(yīng)板支架上，每管加PBS. T50 μ 1。
2.加標(biāo)本按登記編號(hào)位置每管加1份標(biāo)本50 μ 1，置于濕盒內(nèi)。適宜溫度為28°C， 靜置90分鐘，甩去反應(yīng)液。20-40°C均可進(jìn)行，低于28°C時(shí)，溫度每低1°C延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間2 分鐘，可獲得與適宜溫度基本相同的結(jié)果。
3.沖洗流水沖洗鼠疫Fl包被酶標(biāo)板，甩去反應(yīng)液，立即給每小管注滿水，甩去 7jC，再注滿水，再甩去水，如此反復(fù)沖洗5次；酶標(biāo)板管□向下，在吸水紙、濾紙上拍去鼠疫 Fl包被酶標(biāo)板孔內(nèi)與表面水珠。野外可用水壺、洗瓶裝煮沸冷卻澄清的泉水、河水沖洗反應(yīng)板，方法同上。
4.加酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原應(yīng)用液鼠疫Fl抗原板每小管加酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原應(yīng)用液ΙΟΟμΙ，加蓋、置于濕盒內(nèi)。反應(yīng)溫度同3. (2)，反應(yīng)時(shí)間60分鐘，沖洗方法同3。
5.顯色鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板每小管加TMB顯色液的A液和B液各50 μ 1，反應(yīng)20分鐘，陽(yáng)性反應(yīng)呈蘭色；陰性反應(yīng)為無(wú)色或顯色很淡。
6.終止顯色每小管加顯色終止液50 μ 1，顯色液蘭色變?yōu)辄S色，陰性仍為無(wú)色或顏色很淡。
7.觀測(cè)記錄試驗(yàn)結(jié)果目測(cè)平持反應(yīng)板，距白色背景15_20mm，從板的正上方向下觀察。陰性(一)無(wú)色或顏色很淡；陽(yáng)性(+ )顏色明顯可見(jiàn)，(++)淺黃棕色，(+++)與陽(yáng)性對(duì)照顏色相同，(++++)深棕黃色比陽(yáng)性對(duì)照顏色深。
比色計(jì)比色TMB顯色液用波長(zhǎng)450nm，陰性標(biāo)本為對(duì)照，標(biāo)本OD > 0. 20為陽(yáng)性。
8.登記檢驗(yàn)結(jié)果
四、檢測(cè)反應(yīng)滴度試驗(yàn)與抑制試驗(yàn)(復(fù)試)
檢測(cè)鼠疫Fl抗體初篩顯色(+ )、(++)、(+++)、(++++)標(biāo)本，全部要同步做檢測(cè)反應(yīng)滴度試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)。
(一 )檢測(cè)反應(yīng)滴度試驗(yàn)
1.陽(yáng)性標(biāo)本按(+ )、(++)、(+++)、(++++)分別排列，并詳細(xì)記錄。排列小管根據(jù)標(biāo)本數(shù)和反應(yīng)強(qiáng)弱排列小管，每小管加PBS. TlOOul。一般(+)，(++)用4個(gè)小管；(+++)用6-8 個(gè)小管；(++++)用8-12個(gè)小管，亦可將(++++)標(biāo)本稀釋32-64倍后再測(cè)反應(yīng)滴度。
2.每排首管加1份待檢標(biāo)本lOOul，吹吸3次，移入第2管，如此連續(xù)2倍稀釋到最末管；陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本同步稀釋?zhuān)由w、置于濕盒內(nèi)反應(yīng)。
3-8.操作步驟同初篩試驗(yàn)，(+ )為陽(yáng)性反應(yīng)滴度終點(diǎn)。
( 二)抑制試驗(yàn)
1.初篩陽(yáng)性的標(biāo)本都要做抑制試驗(yàn)，抑制試驗(yàn)和測(cè)反應(yīng)滴度試驗(yàn)同步進(jìn)行。
2.抑制試驗(yàn)與測(cè)反應(yīng)滴度試驗(yàn)的不同之處為PBS. T含鼠疫Fl抗原1_2 μ g/ml。
(三)觀測(cè)登記檢驗(yàn)結(jié)果 1.觀測(cè)檢驗(yàn)結(jié)果目測(cè)陽(yáng)性(+)顏色明顯可見(jiàn)的最高稀釋度為反應(yīng)滴度終點(diǎn)。
比色計(jì)比色標(biāo)本OD > 0. 20的最高稀釋度為反應(yīng)滴度終點(diǎn)。
2.檢測(cè)滴度試驗(yàn)、抑制試驗(yàn)反應(yīng)滴度用1 :2n表示，η為2的倍數(shù)。
3.標(biāo)本的抑制試驗(yàn)反應(yīng)滴度比檢測(cè)滴度試驗(yàn)反應(yīng)滴度低2個(gè)或2個(gè)以上滴度為抑制試驗(yàn)陽(yáng)性，抑制試驗(yàn)陽(yáng)性的標(biāo)本才能判定為檢測(cè)鼠疫Fl抗體試驗(yàn)陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒，其特征在于包括酶標(biāo) 記鼠疫抗原1支、鼠疫Fl抗原包被板1塊、抑制用凍干鼠疫Fl抗原1支、酶標(biāo)記物保存液 2ml X 1支、10 X PBS. T20ml X 1支、鼠疫Fl抗體陽(yáng)性對(duì)照2ml X 1支、陰性對(duì)照2ml X 1支、顯 色液A液6ml X 1支、顯色液B液6ml X 1支、顯色終止液6ml X 1支、1 %硫柳汞2ml X 1支； 所述抗原包被板為鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)記抗原為凍干辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 鼠疫Fl抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒，其特 征在于鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板按下述方法得到(1)包被用試劑包被緩沖液0.05mol/LNa2C03溶液4份與0. 05mol/LNaHC036份混合；包被液含鼠疫Fl抗原濃度0. 1-0. 5微克/毫升的包被緩沖液；飽和包被液包被緩沖液1000ml，加牛血清白蛋白0. Ig或新生小牛血清20ml ；PBS. T 10XPBS. T 用 0. 9% NaCl 稀釋 10 倍；(2)鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板測(cè)定包被液適用鼠疫Fl抗原濃度，每管加包被液200微 升，28-37°C濕盒放置4小時(shí)，4-10°C放置4-16小時(shí)；(3)飽和包被甩棄酶標(biāo)板管內(nèi)的包被液，每管加飽和包被液200微升，28-37°C濕盒放 置3小時(shí)；(4)甩棄酶標(biāo)板管內(nèi)飽和包被液，在吸水紙上拍去管中水珠；每管加PBS.T200微升浸 洗，28-37°C濕盒放置3小時(shí)；甩棄PBS. T，流水沖洗5次，在吸水紙上用力拍打酶標(biāo)板，直到 酶標(biāo)板管內(nèi)外無(wú)可見(jiàn)水珠；(5)酶標(biāo)板直立放入37°C溫箱，每30分鐘鼓風(fēng)或開(kāi)門(mén)通風(fēng)1次，6-12小時(shí)干燥后取出， 酶標(biāo)板經(jīng)上述處理后即為鼠疫Fl抗原包被酶標(biāo)板；(6)將鼠疫Fl抗原板裝入塑料袋，封口；4-10°C干燥保存；在上述方法中溶液濃度除注明外均為重量/容量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法試劑盒，其特 征在于凍干辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原按下述方法得到(1)過(guò)碘酸鈉活化辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶的RZ> 3. 0簡(jiǎn)稱(chēng)HRP，稱(chēng)取HRP5mg 裝入12X 120mm試管，加入蒸溜水1ml，搖動(dòng)使HRP溶解；加入新鮮配制的1. 3%過(guò)碘酸鈉水 溶液0. 5ml，混勻置4-10°C30分鐘；加入濃度按容量/容量的的乙二醇水溶液0. 5ml，室 溫20-37°C放置30分鐘；(2)透析法標(biāo)記鼠疫Fl抗原純化的5mg/ml鼠疫Fl抗原溶液1ml，與活化的HRP混 勻，裝入透析袋，用0. 05mol/LpH9. 6碳酸鹽緩沖液4-10°C透析12-16小時(shí)；加入0. 5%硼氫 化鈉溶液0. 2ml,置4-10°C冰箱中2小時(shí)；(3)純化酶標(biāo)記物透析袋移入0.01mol/LpH7. 2磷酸鹽緩沖液200ml中透析6_12小 時(shí)，換PBS液2次；3000 Xg離心10分鐘取上清，上清即為酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原溶液，ELISA 夾心法測(cè)定效價(jià)，效價(jià)應(yīng)在1 :6000以上；(4)分裝凍干酶標(biāo)記鼠疫Fl抗原溶液用容量/容量含50%新生小牛血清的0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀釋到效價(jià)1 :100，分裝，凍干，-20°C保存；在上述方法中溶液濃度除注明外均為重量/容量。
全文摘要
本發(fā)明涉及動(dòng)物鼠疫疫情監(jiān)測(cè)與鼠疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，是一種檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)夾心法試劑盒，包括酶標(biāo)記抗原、抗原包被酶標(biāo)板、抑制用鼠疫F1抗原；所述抗原包被酶標(biāo)板為鼠疫F1抗原包被酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)記抗原為凍干辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠疫F1抗原。間接法一種酶標(biāo)記第二抗體只能檢測(cè)一種動(dòng)物的抗體；本發(fā)明檢測(cè)動(dòng)物鼠疫抗體ELISA夾心法試劑盒的有益效果是，被測(cè)物是鼠疫F1抗體，標(biāo)本經(jīng)高濃度殺菌劑殺菌，檢測(cè)過(guò)程安全；被測(cè)抗體經(jīng)包被抗原和酶標(biāo)抗原兩次特異性選擇結(jié)合，提高了檢測(cè)的特異性；酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值具有定量的意義，可在野外現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用；增加了抑制試驗(yàn)程序，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)G01N33/535GK101846682SQ20101020199
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者徐兵, 熱娜·吐?tīng)柕? 雷剛, 蔣衛(wèi), 丁雄杰, 唐建國(guó) 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心