專利名稱：單胺氧化酶活性測定方法及單胺氧化酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶法測定單胺氧化酶活性的方法，以及應用該方法配制而成的單胺氧化酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免疫抑制法和化學分光光度法。熒光法是以β-苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化酶，其依據(jù)是β-苯乙胺在10～100mg時反應速度最大，高于芐胺和5-羥色胺的反應速度。免疫學方法則利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應，測定反應后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應用較多的單克隆抗體有MAO-A3C9、MAO-A4F10、MAO-A7B10、MAO-A7E10和MAO-B1C2等。
相對而言，化學分光光度法應有更為普遍?？梢杂脝伟费趸复呋奉愥尫懦龅倪^氧化氫(H2O2)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)等發(fā)色劑進行測定，也可以應用芐胺(Benzylamine)、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、β-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine，又稱“3-對羥基苯乙胺”，3-parahdroxyphenylethylamine)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine)等作為反應底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應用苯甲胺類型底物測得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺作底物測得的活性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30％。目前，單胺氧化酶測定多用芐胺和對苯甲胺-β-偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛，然后在強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應，生成醛苯腙，這在生化儀上測定較困難；對苯甲胺-β-偶氮萘酚方法則需要用環(huán)乙烷提取，限制了該方法的實用性，且不能應用全自動生化儀分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以克服現(xiàn)有技術(shù)缺點的測定單胺氧化酶活性的方法，以及應用該方法配制而成的單胺氧化酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑，能夠利用紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀進行單胺氧化酶活性測定，而且測定速度快、準確度高，為在醫(yī)學檢測領(lǐng)域切實推廣單胺氧化酶活性測定方法及其診斷試劑盒提供技術(shù)支撐。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種測定單胺氧化酶活性的方法，采用以下步驟進行首先，將需要測定的樣品與含有胺類化合物、2-酮戊二酸酯、谷氨酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應，
然后，將反應混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm的吸光度的下降速度，進而測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。
上述測定單胺氧化酶活性的方法中，所述胺類化合物是以下物質(zhì)之一，芐胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物。
測定過程中，被測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500，反應溫度控制在20℃～50℃，反應時間控制在2～30分鐘，檢測時設定副波長在405nm以上。
實現(xiàn)本發(fā)明單胺氧化酶活性測定方法的診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成
緩沖液40～200mmol/l，胺類化合物0.5～20mmol/l，2-酮戊二酸酯 0.5～50mmol/l，還原型輔酶0.15～0.3mmol/l，谷氨酸脫氫酶 10000～500000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積 10～80％。
也可以將以上單劑中的各種成分進行組合配制成雙劑，以利于消除內(nèi)、外源氨污染，比如 雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分2-酮戊二酸酯、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶等，可以放在試劑II；試劑II中的胺類化合物也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源氨污染，還有利于試劑更穩(wěn)定

與雙劑類似，三劑的配方也不僅僅限于上述配方，其中試劑I中的2-酮戊二酸酯和還原型輔酶可以放在試劑II或試劑III中，試劑II中的谷氨酸脫氫酶可以放在試劑I或試劑III中，試劑III中的胺類化合物也可以放到試劑I或者試劑II中，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。
本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當中，所述胺類化合物優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。
配制診斷試劑盒時，選擇緩沖液的基本要求是PH值在6.0～11.0范圍之內(nèi)，可以是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸(Tris-HCl)緩沖液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液”、“咪唑～鹽酸(Imidazole-HCl)緩沖液”、“雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“碳酸鈉～碳酸氫鈉緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸(Phosphate)緩沖液”或者“磷酸鹽(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)緩沖液”中的至少一種，但緩沖液的選擇范圍并不受這些列舉所限制。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II、三劑的試劑I/試劑II/試劑III當中通常加入穩(wěn)定劑，其用量約占所在試劑總體積的10～80％(或者濃度在10～50mmol/l范圍之內(nèi))。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
上述診斷試劑盒的成分當中，所述氧化型輔酶是——氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD+)或者氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP+)；所述還原型輔酶是——還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。
研究表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的診斷試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液 80～120mmol/l，胺類化合物 1～10mmol/l，2-酮戊二酸酯 3～20mmol/l，還原型輔酶 0.2～0.3mmol/l，谷氨酸脫氫酶 50000～200000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積20～50％。
本發(fā)明技術(shù)路線上采取單胺氧化酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應連續(xù)監(jiān)測單胺氧化酶的活性，具體為單胺氧化酶水解芐胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺等胺類化合物產(chǎn)生氨，再通過偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶反應成氧化型輔酶。由于還原型輔酶在340nm有非常明顯的吸收峰，而它們對應的氧化型輔酶在340nm沒有吸收峰，反應所產(chǎn)生的吸光度的變化與樣品中單胺氧化酶的活性成正比。因此，在固定時間間隔內(nèi)測定主波長340nm處吸光度的下降速度，便能很好地反映出樣品中單胺氧化酶的活性大小。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，通過將還原型輔酶反應成氧化型輔酶，定量反映出被測樣品中單胺氧化酶的活性，測試結(jié)果準確；(2)參與酶偶聯(lián)反應的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結(jié)果，而且反應是在緩沖液條件下進行，不會污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應用；(5)應用本發(fā)明提供的測定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑、干試劑等多種形式的試劑，用于測定各種樣品中單胺氧化酶的活性大??；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)單胺氧化酶活性診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，存在于其中的各種酶的三維空間結(jié)構(gòu)保持完整，很好地保證了應用測試效果。配成雙劑或者三劑以后，能夠進一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長時間儲存。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進一步說明。這些例子僅是一些應用范例，不能理解為對本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍的一種限制。
實施例一(單劑)按以下成分和用量配制單胺氧化酶活性診斷試劑盒雙甘氨肽緩沖液80mmol/l，丁基胺1mmol/l，2-酮戊二酸酯 3mmol/l，thio-NADH 0.2mmol/l，谷氨酸脫氫酶 50000U/l，乙二醇50％(占試劑總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度37℃、反應時間10分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上，被測單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應方向為負反應(吸光度下降，下同)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和配成的單劑，兩者在分析儀內(nèi)部自動混勻，檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結(jié)果重復性好、精確度高。
實施例二(雙劑)按以下成分和用量配制單胺氧化酶活性診斷試劑盒試劑I——咪唑～鹽酸緩沖液100mmol/l，2-酮戊二酸酯12mmol/l，NADPH 0.25mmol/l，谷氨酸脫氫酶120000U/l，甘油50％(占試劑I總體積)；
試劑II——咪唑～鹽酸緩沖液100mmol/l，β-苯乙基胺 6mmol/l，乙二醇 20mmol/l。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度30℃、反應時間15分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上，被測單胺氧化酶樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內(nèi)部自動混勻，檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結(jié)果重復性好、精確度高。
實施例三(三劑)按以下成分和用量配制單胺氧化酶活性診斷試劑盒試劑I三乙醇胺緩沖液120mmol/l，2-酮戊二酸酯 20mmol/l，thio-NADPH0.3mmol/l，丙二醇20mmol/l；試劑II——三乙醇胺緩沖液120mmol/l，谷氨酸脫氫酶 200000U/l，丙二醇50％(占試劑II總體積)；試劑III——三乙醇胺緩沖液120mmol/l，
酪胺10mmol/l，乙二醇 20mmol/l。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度25℃、反應時間20分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上，被測樣品與試劑I、試劑II和試劑III的總體積之比為1∶25，試劑I、試劑II和試劑III的用量為8∶1∶1，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
先加入樣品和試劑I、試劑II，5分鐘之后加入試劑III，它們在分析儀內(nèi)部自動混勻，檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結(jié)果重復性好、精確度高。
實施例四(雙劑優(yōu)選例)按以下成分和用量配制單胺氧化酶活性診斷試劑盒試劑I——Tris-HCl緩沖液100mmol/l，2-酮戊二酸酯 7mmol/l，NADH 0.25mmol/l，谷氨酸脫氫酶 150000U/l，甘油 50％(占試劑I總體積)；試劑II——Tris-HCl緩沖液100mmol/l，芐胺 3mmol/l，甘油 50％(占試劑II總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度37℃、反應時間10分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上，被測樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應方向為負反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內(nèi)部自動混勻，發(fā)生以下原理性反應
檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結(jié)果重復性好、精確度高。
本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源氨的污染。消除內(nèi)、外源氨的作用發(fā)生在整個反應時間段的前半部分，在后半段時間，受污染的內(nèi)、外源氨已經(jīng)被消耗殆盡，而后半段時間檢測所需要的氨都是產(chǎn)生于單胺氧化酶的活性。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法，完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀器，測定出單胺氧化酶樣品的活性大小，測試靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。而且，本發(fā)明提供的單胺氧化酶活性診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，長時間存放之后仍然能夠準確檢測各種類型樣品中單胺氧化酶的活性。
權(quán)利要求
1.一種測定單胺氧化酶活性的方法，包括以下步驟①將待測樣品與含有胺類化合物、2-酮戊二酸酯、谷氨酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應，②將反應混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm的吸光度的下降速度，測算出樣品中單胺氧化酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定單胺氧化酶活性的方法，其特征在于所述胺類化合物是以下物質(zhì)之一，芐胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定單胺氧化酶活性的方法，其特征在于待測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500，反應溫度控制在20℃～50℃，反應時間控制在2～30分鐘，檢測時設定副波長在405nm以上。
4.一種單胺氧化酶診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液 40～200mmol/l，胺類化合物 0.5～20mmol/l，2-酮戊二酸酯0.5～50mmol/l，還原型輔酶 0.15～0.3mmol/l，谷氨酸脫氫酶10000～500000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積 10～80％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于所述胺類化合物是以下物質(zhì)之一，芐胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液的PH范圍是6.0～11.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸緩沖液”、“三乙醇胺緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液”、“咪唑～鹽酸緩沖液”、“雙甘氨肽緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“碳酸鈉～碳酸氫鈉緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸緩沖液”或者“磷酸鹽緩沖液”中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于所述氧化型輔酶是——氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸t(yī)hio-NAD+或者氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸t(yī)hio-NADP+；所述還原型輔酶是——還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸t(yī)hio-NADH或者還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸t(yī)hio-NADPH。
10.權(quán)利要求4～9中任意一種單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或者三劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及單胺氧化酶活性的測定方法及其診斷試劑盒。利用單胺氧化酶水解芐胺、對苯甲胺－β－偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β－苯乙基胺、酪胺等胺類化合物產(chǎn)生氨，再偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應，將還原型輔酶反應成氧化型輔酶，通過測定主波長340nm處吸光度的下降速度定量反映出樣品中單胺氧化酶的活性大小。該方法特異性高，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試結(jié)果精確、準確性好。將診斷試劑盒制成雙劑或三劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩(wěn)定性，便于長期儲存。該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應用。
文檔編號C12Q1/32GK1789428SQ20041006619
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司