專利名稱：酶法測定鈉離子含量的方法及鈉離子診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶法測定血清、血漿等樣品中鈉離子含量的方法，以及應用該方法配制而成的鈉離子診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
血清中鈉離子含量(簡稱“血鈉”)在臨床上有著非常重要的意義，醫(yī)學上有三個決定水平，依次為水平1——115mmol/l，水平2——135mmol/l，水平3——150mmol/l。當患者血鈉濃度等于或低于水平1時，可出現(xiàn)神志不清、疲勞、惡心、頭痛、嘔吐和厭食等癥狀，表明機體內水的比例大于鈉，應采用相應治療措施；當血鈉濃度低于水平2時，應查找低鈉血癥的原因，進一步測定血清滲透壓、血鉀并進行尿液分析，以確定診斷；當血鈉濃度高于水平3時，應檢查其它試驗項目，尋找導致高鈉血癥的原因。
現(xiàn)有技術中測定鈉離子含量的常用方法有火焰光度計法、離子選擇電極法、化學測定法、原子分光光度法、酶動力學法等。
火焰光度計法——1950年開始使用并一直沿用至今，可檢測血清、尿液、腦脊液及胸腹水中的Na+和K+，是一種發(fā)射光譜分析法，其結果準確可靠，廣為臨床采用。該方法分為內標準法和外標準法兩種。外標準法操作誤差較大，一般不采用?，F(xiàn)在主要使用內部標準法，即向標本及標準液中加進相同濃度的內部標準元素鋰或銫進行測定，操作時，將含鋰的溶液作為稀釋液，同時測定K+、Na+和Li+的濃度，以標本與標準液的Na+/Li+與K+/Li+比值，計算Na+、K+濃度。由于血清稀釋倍數(shù)大，血清蛋白質粘性的影響幾乎可以忽略不計。
離子選擇電極法——簡稱ISE法，是采用靈敏的特定專用電極，在專用儀器上進行血清和尿等體液中的K+、Na+的測定，因標本用量少，快速準確，幾乎有取代其它方法的趨勢。其測定原理是，用離子選擇電極與參比電極組合起來，浸泡在待測標本溶液中進行檢測。目前已有的電極種類有□玻璃膜電極，感應材料為玻璃薄膜，有PH電極、K+電極和Na+電極；□固相膜電極，由難溶性金屬物質加壓成型，以固體膜或單日膜作為感應膜，有Cl-電極和F-電極；□液態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內裝聚氯乙稀作為感應膜，有Ca2+電極；□用纈氨霉素膜制成的K+電極。上述電極均有一定的使用壽命，因為電極使用一段時間后就會自動老化，有效期長短不一。目前離子選擇電極法應用也較為普遍，但是電極成本昂貴。
此外，化學測定法主要利用復環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，作為離子載體進行測定。由于大環(huán)結構內有空穴，分子內部的氧原子有未共用電子對可與金屬離子結合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結合不同直徑的金屬離子，從而達到測出離子濃度的目的；原子分光光度法也可用于檢測血清中K+、Na+，但操作繁雜，誤差較大，不及火焰光度法簡便。
酶法測定鈉離子含量的方法，與火焰光度計法或離子選擇電極法都有較好的一致性，這種方法抗干擾性強、穩(wěn)定性好，但用生化分析儀不能同時測定鈉離子和鉀離子各自的含量，導致這種方法不能得到推廣應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種可以克服現(xiàn)有技術缺陷的酶法測定鈉離子含量的方法，以及應用該方法配制而成的鈉離子診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑，能夠利用紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀測定出血清、血漿等樣品中鈉離子含量，測定過程不受鉀離子的影響，測定速度快、準確度高，為臨床及化學分析中推廣酶法檢測鈉離子含量提供技術支撐。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的之一，一種酶法測定鈉離子含量的方法，采用以下步驟進行
首先，將需要測定的樣品與含有o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和β-半乳糖苷酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應，
然后，將反應混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長405nm的吸光度的上升速度，進而測算出樣品中鈉離子的含量。
測定過程中，被測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500，反應溫度控制在20℃～50℃，反應時間控制在2～30分鐘，檢測時設定副波長在505nm以上。
實現(xiàn)本發(fā)明另外一個目的——鈉離子診斷試劑盒，可以是由以下成分組成的單劑緩沖液40～200mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖1～10mmol/l，β-半乳糖苷酶 4000～60000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積 10～80％。
也可以將以上單劑中的成分進行組合配制成雙劑，使試劑更為穩(wěn)定，比如
雙劑配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I和試劑II中成分可以互換，從而形成多種配方。
以上配制鈉離子診斷試劑盒時，選擇緩沖液的基本要求是PH值在6.0～11.0范圍之內，可以是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸(Tris-HCl)緩沖液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液”、“咪唑～鹽酸(Imidazole-HCl)緩沖液”、“雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鉀緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“碳酸鉀～碳酸氫鉀緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鉀緩沖液”、“硼砂～氫氧化鉀緩沖液”或者“磷酸鉀(Potassium Phosphate)緩沖液”中的至少一種，但緩沖液的選擇范圍并不受這些列舉所限制。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II當中通常加入穩(wěn)定劑，其用量約占所在試劑總體積的10～80％(或者濃度在10～50mmol/l范圍之內)。用作穩(wěn)定劑的物質可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇或者丁二酸鹽中的至少一種，但選擇范圍同樣不受這些列舉所限制。
研究表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑還是雙劑，如下配方成分關系的診斷試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液80～120mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖2～8mmol/l，β-半乳糖酶 10000～30000U/l，
穩(wěn)定劑/試劑總體積20～50％。
本發(fā)明應用半乳糖苷酶反應比色法，在鈉離子的激活下，β-半乳糖苷酶酶解o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖成為o-硝基酚和半乳糖，使得405nm處的吸光度上升，反應所引起的吸光度變化與樣品中鈉離子的含量成正比。這樣，通過在固定時間間隔內測定主波長405nm處吸光度的上升速度，便能定量反映出樣品中鈉離子的含量。
本發(fā)明技術方案的突出的實質性特點和顯著的進步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，通過鈉離子激活β-半乳糖苷酶的特性，定量反映出被測樣品中鈉離子的含量，測試結果準確，不受樣品中是否存在鉀離子的影響；(2)參與酶反應的成分都是外加的，不受內、外源物質的污染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結果，而且反應是在緩沖液條件下進行，不會污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內推廣應用，可望在臨床和化學分析中取代火焰光度計法，使鈉離子含量成為常規(guī)分析項目；(5)應用本發(fā)明提供的測定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑、干試劑等多種形式的試劑，主要用于測定人體和其它動物體內鈉離子的含量，也可以結合稀釋、濃縮等輔助手段來測定其它樣品中的鈉離子；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)鈉離子診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，存在于其中的各種成分的三維空間結構保持完整，很好地保證了應用測試效果。配成雙劑以后，能夠進一步降低各成分之間的交叉影響，檢測結果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長時間儲存。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明技術方案作進一步說明。這些例子僅是一些應用范例，不能理解為對本發(fā)明權利要求保護范圍的一種限制。
實施例一(單劑)按以下成分和用量配制鈉離子診斷試劑盒雙甘氨肽緩沖液 80mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖 2mmol/l，β-半乳糖苷酶10000U/l，乙二醇 50％(占試劑總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度37℃、反應時間10分鐘、測試主波長405nm、測試副波長505nm以上，被測鈉離子樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應方向為正反應(吸光度上升，下同)。
加入樣品和配成的單劑，兩者在分析儀內部自動混勻，檢測、記錄405nm吸光度的上升情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中鈉離子的含量。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結果重復性好、精確度高。
實施例二(雙劑例之一)按以下成分和用量配制鈉離子診斷試劑盒試劑I——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖5mmol/l，甘油 20mmol/l；試劑II——咪唑～鹽酸緩沖液 100mmol/l，β-半乳糖苷酶 20000U/l，乙二醇50％(占試劑II總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度30℃、反應時間15分鐘、測試主波長405nm、測試副波長505nm以上，被測鈉離子樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應方向為正反應。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內部自動混勻，檢測、記錄405nm吸光度的上升情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中鈉離子的含量。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結果重復性好、精確度高。
實施例三(雙劑例之二)按以下成分和用量配制鈉離子診斷試劑盒試劑I——Tris-HCl緩沖液 120mmol/l，β-半乳糖苷酶 30000U/l，甘油 50％(占試劑I總體積)；試劑II——Tris-HCl緩沖液 120mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖8mmol/l，丙二醇50％(占試劑II總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設定溫度37℃、反應時間10分鐘、測試主波長405nm、測試副波長505nm以上，被測鈉離子樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應方向為正反應。
先加入樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內部自動混勻，發(fā)生以下原理性反應
檢測、記錄405nm主波長吸光度的上升情況。根據(jù)速率法、終點法等方法，對照相應的標準曲線測算出樣品中鈉離子的含量。對同一批樣品多次重復以上過程，測試結果重復性好、精確度高。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法，完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀器，測定出樣品的中鈉離子的含量，測試靈敏度高、精確度好，不受樣品中是否存在鉀離子的影響，也不受內、外源物質的污染。而且，本發(fā)明提供的鈉離子診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，長時間存放之后仍然能夠準確檢測各種類型樣品中鈉離子的含量。
權利要求
1.一種酶法測定鈉離子含量的方法，包括以下步驟①將待測樣品與含有o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和β-半乳糖苷酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應，②將反應混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下，檢測主波長405nm的吸光度的上升速度，測算出樣品中鈉離子的含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的酶法測定鈉離子含量的方法，其特征在于待測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的酶法測定鈉離子含量的方法，其特征在于反應溫度控制在20℃～50℃，反應時間控制在2～30分鐘，檢測時設定副波長在505nm以上。
4.一種鈉離子診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液 40～200mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖 1～10mmol/l，β-半乳糖苷酶4000～60000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積10～80％。
5.根據(jù)權利要求4所述的鈉離子診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液的PH范圍是6.0～11.0。
6.根據(jù)權利要求5所述的鈉離子診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸緩沖液”、“三乙醇胺緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液”、“咪唑～鹽酸緩沖液”、“雙甘氨肽緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鉀緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“碳酸鉀～碳酸氫鉀緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鉀緩沖液”、“硼砂～氫氧化鉀緩沖液”或者“磷酸鉀緩沖液”中的至少一種。
7.根據(jù)權利要求4所述的鈉離子診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇或者丁二酸鹽中的至少一種。
8.權利要求4～7中任意一種鈉離子診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑或雙劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶法測定鈉離子含量的方法及鈉離子診斷試劑盒。發(fā)明應用半乳糖苷酶反應比色法，在鈉離子的激活下β－半乳糖苷酶酶解o－硝基酚基－β－D－吡喃糖苷半乳糖，使得405nm主波長的吸光度上升，其吸光度變化幅度與樣品中鈉離子的含量成正比，從而定量反映出樣品中鈉離子的含量。該方法特異性高，不受樣品中鉀離子的影響，也不受內、外源物質的污染，測試結果精確、準確性好。將診斷試劑盒制成雙劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩(wěn)定性，便于長期儲存。該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內推廣應用。
文檔編號C12Q1/34GK1786186SQ200410066188
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權日2004年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司