專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定腺苷脫氨酶活性的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有重要關(guān)系的核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標(biāo)志。
腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H2O)腺苷脫氨酶肌苷(Inosine)+氨離子(NH4+)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現(xiàn)，因此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用一般醫(yī)院的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。
檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?3128092.7、申請日為2003.05.29、名稱為《一種測定腺苷脫氨酶的試劑及其制法》的中國專利申請公開了應(yīng)用酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰氨輔酶配制的測定試劑。該發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測定反應(yīng)所需的還原型煙酰氨輔酶或其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰氨輔酶或其類似物，及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰氨輔酶或其類似物，當(dāng)被還原的還原型煙酰氨輔酶或其類似物達(dá)到一定的濃度時(shí)，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達(dá)到測定樣本中腺苷脫氨酶及其同工酶活力的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為腺苷脫氨酶的測試提供一個(gè)內(nèi)源合成腺苷脫氨酶反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的腺苷脫氨酶試劑。其缺點(diǎn)之一為，這個(gè)系統(tǒng)在生成反應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時(shí)，也抵消了部分腺苷脫氨酶試劑(腺苷脫氨酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)必定將還原型煙酰氨輔酶氧化成氧化型煙酰氨輔酶)的活性，造成試劑測試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二是，該試劑在正式測試前必須事先反應(yīng)一段時(shí)間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果，給測試帶來很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，采用該試劑盒中的試劑不僅可以在可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行腺苷脫氨酶活性測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液40——200mmol/l2-酮戊二酸酯 1——50mmol/l還原型輔酶0.15——0.3mmo/l谷氨酸脫氫酶 5000——500000U/l腺苷 0.5——50mmol/l通常腺苷為白色結(jié)晶粉末，還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH，2-酮戊二酸酯(即2-Ketoglutarate)，谷氨酸脫氫酶(即GLDH/Glutamate Dehydragenase)，緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩沖液或磷酸鹽(Phosphate)緩沖液等。
也可以將以上單劑量分成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)外源氨污染試劑I緩沖液 40——200mmol/l2-酮戊二酸酯 1——50mmol/l還原型輔酶 0.15——0.3mmo/l谷氨酸脫氫酶 5000——500000U/l試劑II緩沖液 40——200mmol/l腺苷 0.5——50mmol/l雙劑也可以如下配制試劑I緩沖液 40——200mmol/l2-酮戊二酸酯 1——50mmol/l還原型輔酶 0.15——0.3mmo/l試劑II緩沖液 40——200mmol/l谷氨酸脫氫酶 5000——500000U/l腺苷 0.5-——50mmol/l此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑或雙劑的試劑I或試劑II中通常加入穩(wěn)定劑10——50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是硫酸銨、甘油、腺苷二磷酸等中的一種或一種以上。
本發(fā)明測定腺苷脫氨酶活性的方法包括如下步驟
1)、將樣品與試劑按體積1/10到1/250的比例混合，使之發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶或其衍生物谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水2)、將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。這種方法應(yīng)用腺苷脫氨酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。腺苷脫氨酶酶解腺苷反應(yīng)產(chǎn)生氨離子，再通過偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(NADH、NADPH或其它類似物——在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(NAD+、NADP+或其它類似物——在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算腺苷脫氨酶的活性大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方便綜合考慮，無論是單劑還是雙劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明腺苷脫氨酶診斷試劑盒較為理想緩沖夜 80——120mmol/l2-酮戊二酸酯3——10mmol/l還原型輔酶 0.2——0.3mmo/l谷氨酸脫氫酶100000——200000U/l腺苷1——5mmol/l由于本發(fā)明無需通過反應(yīng)生成還原型輔酶，不會抵消腺苷脫氨酶試劑的活性，因此可以保證具有較高的測試準(zhǔn)確性，同時(shí)顯然可以縮短了測試時(shí)間，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源氨的污染，消除內(nèi)、外源氨的作用發(fā)生在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間段的前半部分，在后半段時(shí)間受污染的內(nèi)、外源氨已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時(shí)間測試腺苷脫氨酶活性所需要的氨都是產(chǎn)生于腺苷脫氨酶的活性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑盒包括試劑I磷酸鹽緩沖液100mmol/l2-酮戊二酸酯10mmol/l還原型輔酶 0.2mmo/l谷氨酸脫氫酶200000U/l穩(wěn)定劑 20mmol/l試劑II磷酸鹽緩沖液100mmol/l腺苷2mmol/l在全自動(dòng)生化分析儀1上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度小于1.8，測試主波長340mn，測試副波長450mn，被測腺苷脫氨酶樣品與雙試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯的+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
實(shí)施例二本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有試劑I三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 180mmol/l2-酮戊二酸酯40mmol/l還原型輔酶 0.25mmo/l谷氨酸脫氫酶400000U/l穩(wěn)定劑 20mmol/l試劑II三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 180mmol/l腺苷40mmol/l測定腺苷脫氨酶活性時(shí)，溫度控制在37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度小于1.7，測試主波長340mn，測試副波長450mn，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例約為4/50，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測時(shí)間2分鐘，理論K值-2170。
具體測定步驟為1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子2、氨離子+2-酮戊二酸酯的+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水3，將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
實(shí)施例三本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，有三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 50mmol/l2-酮戊二酸酯5mmol/l還原型輔酶 0.25mmo/l谷氨酸脫氫酶10000U/l腺苷3mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l測定腺苷脫氨酶活性時(shí)，溫度控制在37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度小于1.7，測試主波長340mn，測試副波長450mn，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的比例約為1/12.5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間5分鐘，檢測時(shí)間2分鐘，理論K值-2170。
具體測定步驟為1、腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子2、氨離子+2-酮戊二酸酯的+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水3，將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的腺苷脫氨酶診斷試劑有試劑I三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 120mmol/l2-酮戊二酸酯20mmol/l
還原型輔酶 0.25mmo/l試劑II三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 120mmol/l谷氨酸脫氫酶400000U/l腺苷25mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度小于1.8，測試主波長340mn，測試副波長450mn，被測腺苷脫氨酶樣品與雙試劑的體積比例為2/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間3.5分鐘，檢測時(shí)間1.5分鐘，理論K值-2170。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯的+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
實(shí)驗(yàn)證明，采用技術(shù)方案范圍中的其它配比關(guān)系均能達(dá)到所需的測定效果。并且，煙酰氨腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化型)-依賴型(NADP-依賴型)谷氨酸脫氫酶比煙酰氨腺嘌呤二核苷酸(氧化型)-依賴型谷氨酸脫氫酶(NAD-依賴型)在反應(yīng)中的速度和穩(wěn)定性都更好，采用還原型煙酰氨腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)偶聯(lián)反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測，會使得反應(yīng)更穩(wěn)定、可靠、靈敏，并且步驟簡單，便于操作，也更易于推廣應(yīng)用。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，包括緩沖液 40——200mmol/l2-酮戊二酸酯 1——50mmol/l還原型輔酶 0.15——0.3mmo/l谷氨酸脫氫酶 5000——500000U/l腺苷 0.5——50mmol/l
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、2-酮戊二酸酯、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷組成單劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、2-酮戊二酸酯、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶組成試劑I，由緩沖液、腺苷組成試劑II。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、2-酮戊二酸酯、還原型輔酶組成試劑I，由緩沖液、谷氨酸脫氫酶、腺苷組成試劑II。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑10——50mmol/l。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于其中緩沖液 80——120mmol/l2-酮戊二酸酯3——10mmol/l還原型輔酶 0.2——0.3mmo/l谷氨酸脫氫酶100000——200000U/l腺苷 1——5mmol/l
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑為三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸、磷酸鹽中的一種，所述穩(wěn)定劑為硫酸銨、甘油、腺苷二磷酸中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒測定腺苷脫氨酶活性的方法，包括如下步驟1)、將樣品與試劑按體積1/10到1/250的比例混合，使之發(fā)生以下反應(yīng)腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型煙酰氨輔酶或其衍生物谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶+水2)、將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性大小。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述測定腺苷脫氨酶活性的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定腺苷脫氨酶活性的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒包括緩沖液、2－酮戊二酸酯、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生還原型酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測主波長或副波長吸光度下降的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/25GK1641041SQ200410014929
公開日2005年7月20日 申請日期2004年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月18日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中