專(zhuān)利名稱(chēng)：5ˊ－核苷酸酶活性測(cè)定方法及5ˊ－核苷酸酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定5′-核苷酸酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及用于實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要見(jiàn)于阻塞性黃膽，也可見(jiàn)于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時(shí)，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時(shí)5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因?yàn)?′-核苷酸酶活性無(wú)生理性升高，對(duì)于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測(cè)定5′-核苷酸酶的活性對(duì)于疾病的診斷具有重要意義。
5′-核苷酸酶的活性測(cè)定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強(qiáng)酸測(cè)磷法(1925年)。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用同位素底物測(cè)試法，方法為5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應(yīng)后，通過(guò)離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5′-核苷酸酶活性?；蛘呃?′-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷，再用化學(xué)強(qiáng)酸法分析無(wú)機(jī)磷含量得以計(jì)算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測(cè)定儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。無(wú)機(jī)磷測(cè)定法是1925年發(fā)明的方法，準(zhǔn)確度不好，強(qiáng)酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的5′-核苷酸酶活性的測(cè)定方法，同時(shí)給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行5′-核苷酸酶活性測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測(cè)定5′-核苷酸酶活性的步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷單磷酸、單價(jià)磷酸鹽、腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成的試劑混合，使之發(fā)生如下方法原理的反應(yīng)腺苷單磷酸+水5核苷酸酶腺苷+磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上步驟2)通常將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上樣品與試劑按體積1/10到1/250的比例混合，以上過(guò)程的測(cè)定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應(yīng)用5′-核苷酸酶偶聯(lián)腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)以及還原型色原體(Chromogen)組合系統(tǒng)，將無(wú)色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原(Quioneimine)或者吲嗒胺色原(Indamine)染料，因此測(cè)量染料含量的高低(不同染料吸收波長(zhǎng)不同，介于400--600nm之間)可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)有(1)它利用將無(wú)色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原或者吲嗒胺色原染料來(lái)反映5′-核苷酸酶活性，有精確度好的優(yōu)點(diǎn)。(2)這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)組成的反應(yīng)成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試結(jié)果精確。
用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l單價(jià)磷酸鹽 0.2--10mmol/l腺苷脫氨酶 5000--500000U/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶500--50000U/l過(guò)氧化物酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)還原型色原體組合0.1--20mmol/l以上還原型色原體組合可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone簡(jiǎn)稱(chēng)MBTH)或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)與0.1--20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)
-m-anisidine簡(jiǎn)稱(chēng)ESPAS)N，N-雙乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-雙氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-benzenesulfonic acid簡(jiǎn)稱(chēng)TBHB)3，5-雙氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid簡(jiǎn)稱(chēng)DHBS)N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium簡(jiǎn)稱(chēng)TOOS)仨溴羥基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)雙甲基苯胺(Dimethylaniline簡(jiǎn)稱(chēng)DMA)N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine簡(jiǎn)稱(chēng)EHSPT)2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)簡(jiǎn)稱(chēng)ABTS4-羥基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillicacid(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)簡(jiǎn)稱(chēng)HMB)3-甲基-乙基-羥基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline簡(jiǎn)稱(chēng)MEHA)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤及尿酸的污染試劑I緩沖液 40--200mmol/l單價(jià)磷酸鹽 0.2--10mmol/l
腺苷脫氨酶 5000--500000U/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶500--50000U/l過(guò)氧化物酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)還原型色原體組合(一)0.1--20mmol/l還原型色原體組合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
試劑II緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l還原型色原體組合(二)0.1--20mmol/l還原型色原體組合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四種成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
雙劑的配方不僅限于上述配方，還原型色原體組合(一)及(二)可以互換位置。其中的試劑I的成分，過(guò)氧化物酶可以放在試劑II，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤及尿酸的污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定
試劑I緩沖液 40--200mmol/l單價(jià)磷酸鹽 0.2--10mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l還原型色原體組合(一)0.1--20mmol/l還原型色原體組合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
試劑II緩沖液 40--200mmol/l腺苷脫氨酶 5000--500000U/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶500--50000U/l過(guò)氧化物酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l還原型色原體組合(二)0.1--20mmol/l還原型色原體組合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四種成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
三劑的配方不僅限于上述配方，還原型色原體組合(一)及(二)可以分開(kāi)放在試劑I、II或III的任何位置。其中的試劑I的成分，單價(jià)磷酸鹽可以放在試劑II中，試劑II的成分，核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶、等也可以放在試劑I中，過(guò)氧化物酶還可以放在試劑III，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10-80％或者10-50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺、鹽或腺苷二磷酸等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性?xún)煞矫婢C合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明5′-核苷酸酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l腺苷單磷酸 l--5mmol/l單價(jià)磷酸鹽 2--8mmol/l腺苷脫氨酶 5000--12000U/l核苷磷酸酶 5000--12000U/l黃嘌呤氧化酶5000--12000U/l過(guò)氧化物酶 5000--12000U/l
穩(wěn)定劑10--50％(總體積)或10--50mmol/l還原型色原體組合 0.1--10mmol/l由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡(jiǎn)便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測(cè)試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒(méi)有污染環(huán)境問(wèn)題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測(cè)試成本低廉。因此可以保證具有較高的測(cè)試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤及尿酸的污染，消除內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤及尿酸的作用發(fā)生在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間段的前半部分，在后半段時(shí)間受污染的內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤及尿酸已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時(shí)間測(cè)試5′-核苷酸酶活性所需要的過(guò)氧化氫都是產(chǎn)生于5′-核苷酸酶的活性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l腺苷單磷酸 1mmol/l單價(jià)磷酸鹽 2mmol/l腺苷脫氨酶 5000U/l核苷磷酸酶 5000U/l黃嘌呤氧化酶5000U/l過(guò)氧化物酶 5000U/l
穩(wěn)定劑 10--50％(總體積)4-氨基抗砒 2mmol/l石碳酸 10mmol/l在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)495-505nm，測(cè)試副波長(zhǎng)600nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷單磷酸+水5核苷酸酶腺苷+磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)495-505nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
本實(shí)施例應(yīng)用5′-核苷酸酶偶聯(lián)腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)以及還原型色原體組合系統(tǒng)，將無(wú)色的還原型色原體組合氧化成有顏色的醌亞胺色原或者吲嗒胺色原，因此測(cè)量染料含量的高低(不同染料吸收波長(zhǎng)不同，介于400--600nm之間)可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有緩沖液 100mmol/l單價(jià)磷酸鹽 5mmol/l
腺苷脫氨酶 8000U/l核苷磷酸酶 8000U/l黃嘌呤氧化酶8000U/l過(guò)氧化物酶 8000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)4-氨基抗砒 1mmol/l試劑II緩沖液 100mmol/l腺苷單磷酸 3mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 1mmol/l測(cè)定5′-核苷酸酶活性時(shí)，溫度控制在30，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)546nm，測(cè)試副波長(zhǎng)630nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
具體測(cè)定步驟為腺苷單磷酸+水5核苷酸酶腺苷+磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)546nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 120mmol/l單價(jià)磷酸鹽 8mmol/l穩(wěn)定劑 50mmol/l3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2mmol/l試劑II緩沖液 120mmol/l腺苷脫氨酶 12000U/l核苷磷酸酶 12000U/l黃嘌呤氧化酶12000U/l過(guò)氧化物酶 12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 120mmol/l腺苷單磷酸 5mmol/l穩(wěn)定劑 50mmol/l雙甲基苯胺 2mmol/l在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度30，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)578nm，測(cè)試副波長(zhǎng)700nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
具體測(cè)定步驟為腺苷單磷酸+水5核苷酸酶腺苷+磷酸鹽腺苷+水 腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)578nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在10分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有緩沖液 120mmol/l單價(jià)磷酸鹽 6mmol/l腺苷脫氨酶 12000U/l核苷磷酸酶 12000U/l黃嘌呤氧化酶12000U/l過(guò)氧化物酶 12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)4-氨基抗砒 1mmol/l試劑II緩沖液 120mmol/l腺苷單磷酸 2mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l雙甲基苯胺 2mmol/l測(cè)定5′-核苷酸酶活性時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間5分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)578nm，測(cè)試副波長(zhǎng)700nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷單磷酸+水5核苷酸酶腺苷+磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)578nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在5分鐘。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種5′-核苷酸酶活性測(cè)定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷單磷酸、單價(jià)磷酸鹽、腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)腺苷單磷酸+水5核苷酸酶腺苷+磷酸鹽腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧絲酶尿酸鹽+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)400--600nm吸光度上升的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述5′-核苷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)400-600nm，吸光度上升的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述5′-核苷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述5′-核苷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
5.一種5′-核苷酸酶診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l單價(jià)磷酸鹽 0.2--10mmol/l腺苷脫氨酶 5000--500000U/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l過(guò)氧化物酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)還原型色原體組合 0.1--20mmol/l
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨、鹽或腺苷二磷酸中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑為三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色原體為0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合為由0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒與0.1-20mmol/l以下十四種成分之一組合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-雙乙基-m-甲苯胺、2，4-雙氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸、3，5-雙氯石碳酸磺酸、3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽、仨溴羥基苯甲酸、雙甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種5′－核苷酸酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定5′－核苷酸酶活性的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、腺苷單磷酸、單價(jià)磷酸鹽、腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過(guò)氧化物酶、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合，通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)吸光度變化的情況(速度)，從而測(cè)算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/42GK1749410SQ20041004196
公開(kāi)日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:王爾中