專利名稱：5ˊ－核苷酸酶活性測定方法及5ˊ－核苷酸酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定5′-核苷酸酶活性的方法，同時本發(fā)明還涉及用于實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因?yàn)?′-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5′-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。
5′-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強(qiáng)酸測磷法(1925年)。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法為5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應(yīng)后，通過離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5′-核苷酸酶活性?；蛘呃?′-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無機(jī)磷，再用化學(xué)強(qiáng)酸法分析無機(jī)磷含量得以計算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。無機(jī)磷測定法是1925年發(fā)明的方法，準(zhǔn)確度不好，強(qiáng)酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的5′-核苷酸酶活性的測定方法，同時給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進(jìn)行5′-核苷酸酶活性測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測定5′-核苷酸酶活性的步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷單磷酸、腺苷脫氨酶、單磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化氫酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
這種方法應(yīng)用5′-核苷酸酶、腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因?yàn)檫€原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm吸收峰的增加程度可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。這個酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)有
它利用測量氧化型輔酶被還原成還原性輔酶的生成量來反映5′-核苷酸酶活性，氧化型輔酶在溶液中的穩(wěn)定性比還原性輔酶高很多，因此這個系統(tǒng)的穩(wěn)定性很好。
這個酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)組成的反應(yīng)成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試結(jié)果精確。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l腺苷脫氨酶 500--50000U/l單磷酸鹽0.2--10mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶500--50000U/l乙醇1--30mmol/l過氧化氫酶 500--50000U/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l醛脫氫酶500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤的污染試劑I緩沖液 40--200mmol/l腺苷脫氨酶 500--50000U/l單磷酸鹽0.2--10mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶500--50000U/l
乙醇1--30mmol/l過氧化氫酶 500--50000U/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l醛脫氫酶500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑II緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，乙醇、過氧化氫酶、醛脫氫酶等可以放在試劑II，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤的污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40--200mmol/l單磷酸鹽0.2--10mmol/l乙醇1--30mmol/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l試劑II緩沖液 40--200mmol/l腺苷脫氨酶 500--50000U/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶500--50000U/l過氧化氫酶 500--50000U/l
醛脫氫酶500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，單磷酸鹽、乙醇、氧化型輔酶等可以放在試劑II中，試劑II其中的成分，腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等也可以放在試劑I中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等。
以上氧化型輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10-80％或者10-50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺、鹽或腺苷二磷酸等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明5′-核苷酸酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l
腺苷單磷酸 1--5mmol/l腺苷脫氨酶 5000--10000U/l單磷酸鹽2--10mmol/l核苷磷酸酶 5000--10000U/l黃嘌呤氧化酶5000--10000U/l乙醇3--12mmol/l過氧化氫酶 5000--10000U/l氧化型輔酶 1--5mmol/l醛脫氫酶5000--10000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤的污染，消除內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤的作用發(fā)生在整個反應(yīng)時間段的前半部分，在后半段時間受污染的內(nèi)、外源腺苷、肌苷、次黃嘌呤已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時間測試5′-核苷酸酶活性所需要的乙醛都是產(chǎn)生于5′-核苷酸酶的活性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l
腺苷單磷酸 1mmol/l腺苷脫氨酶 5000U/l單磷酸鹽2mmol/l核苷磷酸酶 5000U/l黃嘌呤氧化酶5000U/l乙醇3mmol/l過氧化氫酶 5000U/l氧化型輔酶 1mmol/l醛脫氫酶5000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
這種方法應(yīng)用5′-核苷酸酶、腺苷脫氨酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因?yàn)檫€原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm吸收峰的增加程度可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l腺苷脫氨酶 8000U/l單磷酸鹽6mmol/l核苷磷酸酶 8000U/l黃嘌呤氧化酶8000U/l乙醇8mmol/l過氧化氫酶 8000U/l氧化型輔酶 3mmol/l醛脫氫酶8000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l腺苷單磷酸 3mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l測定5′-核苷酸酶活性時，溫度控制在30℃，反應(yīng)時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 120mmol/l單磷酸鹽10mmol/l乙醇12mmol/l氧化型輔酶 5mmol/l穩(wěn)定劑 50mmol/l試劑II緩沖液 120mmol/l腺苷脫氨酶 10000U/l核苷磷酸酶 10000U/l黃嘌呤氧化酶10000U/l過氧化氫酶 10000U/l醛脫氫酶10000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III
緩沖液 120mmol/l腺苷單磷酸 5mmol/l穩(wěn)定劑 50mmol/l在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時間控制在10分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l腺苷脫氨酶 12000U/l單磷酸鹽5mmol/l核苷磷酸酶 12000U/l黃嘌呤氧化 12000U/l
乙醇8mmol/l過氧化氫酶 12000U/l氧化型輔酶 3mmol/l醛脫氫酶12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l腺苷單磷酸 3mmol/l穩(wěn)定劑 40mmol/l在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種5′-核苷酸酶活性測定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷單磷酸、腺苷脫氨酶、單磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化氫酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下反應(yīng)腺苷單磷酸+水5′-核苷酸酶腺苷+單磷酸腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述5′-核苷酸酶活性測定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm，測試副波長405nm以上，吸光度上升的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述5′-核苷酸酶活性測定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述5′-核苷酸酶活性測定方法，其特征在于被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
5.一種5′-核苷酸酶診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l腺苷單磷酸 1--50mmol/l腺苷脫氨酶 500--50000U/l單磷酸鹽 0.2--10mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l乙醇 1--30mmol/l過氧化氫酶 500--50000U/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨、鹽或腺苷二磷酸中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑為三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述氧化型輔酶為NADP+、NAD+、thio-NAD+還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定5′－核苷酸酶活性的方法，同時本發(fā)明還涉及5′－核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、腺苷單磷酸、腺苷脫氨酶、單磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化氫酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/42GK1749411SQ20041004196
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中