專利名稱：5＇－核苷酸酶活性測(cè)定方法及5＇－核苷酸酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定5′-核苷酸酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及用于實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要見(jiàn)于阻塞性黃膽，也可見(jiàn)于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時(shí)，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時(shí)5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因?yàn)?′-核苷酸酶活性無(wú)生理性升高，對(duì)于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測(cè)定5′-核苷酸酶的活性對(duì)于疾病的診斷具有重要意義。
5′-核苷酸酶的活性測(cè)定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強(qiáng)酸測(cè)磷法(1925年)。據(jù)申請(qǐng)人了解，目前國(guó)際上普遍采用同位素底物測(cè)試法，方法為5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應(yīng)后，通過(guò)離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5′-核苷酸酶活性?；蛘呃?′-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷，再用化學(xué)強(qiáng)酸法分析無(wú)機(jī)磷含量得以計(jì)算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測(cè)定儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。無(wú)機(jī)磷測(cè)定法是1925年發(fā)明的方法，準(zhǔn)確度不好，強(qiáng)酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的5′-核苷酸酶活性的測(cè)定方法，同時(shí)給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行5′-核苷酸酶活性測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測(cè)定5′-核苷酸酶活性的步驟如下1)、將樣品與主要由尿苷單磷酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過(guò)程的測(cè)定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應(yīng)用5′-核苷酸酶偶聯(lián)丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。5′-核苷酸酶酶解尿苷單磷酸產(chǎn)生單磷酸鹽，然后丙酮酸氧化酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再作用最后產(chǎn)生草酰乙酸，再通過(guò)偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，氧化NAD(P)H成為NAD(P)+，從而得以測(cè)定NAD(P)H在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算5′-核苷酸酶的活性大小。雖然單磷酸鹽在系統(tǒng)中被重復(fù)使用，但是最終的反應(yīng)速率還是取決于最初的5′-核苷酸酶活性的大小所產(chǎn)生的初始單磷酸鹽濃度決定。
用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l尿苷單磷酸 1--10mmol/l丙酮酸 1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l丙酮酸氧化酶 2000--20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l蘋果酸脫氫酶 2000--20000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑試劑I緩沖液 40--200mmol/l丙酮酸 1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l丙酮酸氧化酶 2000--20000U/l
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l蘋果酸脫氫酶 2000--20000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑II緩沖液 40--200mmol/l尿苷單磷酸 1--10mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l還可以將試劑配成如下三試劑，更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40--200mmol/l丙酮酸 1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l試劑II緩沖液 40--200mmol/l丙酮酸氧化酶 2000--20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l蘋果酸脫氫酶 2000--20000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l尿苷單磷酸 1--10mmol/l穩(wěn)定劑 10--50mmol/l三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶等可以放在試劑II中，試劑II其中的成分，丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等也可以放在試劑I中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明5′-核苷酸酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l尿苷單磷酸 1--5mmol/l丙酮酸 1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1--8mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l丙酮酸氧化酶6000--20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000--20000U/l
蘋果酸脫氫酶 6000--20000U/l穩(wěn)定劑 10--50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡(jiǎn)便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測(cè)試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒(méi)有污染環(huán)境問(wèn)題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測(cè)試成本低廉。因此可以保證具有較高的測(cè)試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑盒包括緩沖液80mmol/l尿苷單磷酸1mmol/l丙酮酸1mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1mmol/l還原型輔酶0.2mmol/l丙酮酸氧化酶 6000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶6000U/l蘋果酸脫氫酶 6000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)
尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
本實(shí)施例應(yīng)用5′-核苷酸酶偶聯(lián)丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。5′-核苷酸酶酶解尿苷單磷酸產(chǎn)生單磷酸鹽，然后丙酮酸氧化酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再作用最后產(chǎn)生草酰乙酸，再通過(guò)偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，氧化NAD(P)H成為NAD(P)+，從而得以測(cè)定NAD(P)H在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算5′-核苷酸酶的活性大小。雖然單磷酸鹽在系統(tǒng)中被重復(fù)使用，但是最終的反應(yīng)速率還是取決于最初的5′-核苷酸酶活性的大小所產(chǎn)生的初始單磷酸鹽濃度決定。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l丙酮酸 6mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 5mmol/l還原型輔酶 0.25mmol/l丙酮酸氧化酶 13000U/l
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 13000U/l蘋果酸脫氫酶 13000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l尿苷單磷酸 3mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l測(cè)定5′-核苷酸酶活性時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
具體測(cè)定步驟為尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 120mmol/l
丙酮酸10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 8mmol/l還原型輔酶0.3mmol/l穩(wěn)定劑50mmol/l試劑II緩沖液120mmol/l丙酮酸氧化酶 20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶20000U/l蘋果酸脫氫酶 20000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑III緩沖液120mmol/l尿苷單磷酸5mmol/l穩(wěn)定劑50mmol/l在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間20分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
具體測(cè)定步驟為尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在20分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l丙酮酸 4mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸3mmol/l還原型輔酶 0.25mmol/l丙酮酸氧化酶12000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000U/l蘋果酸脫氫酶8000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l尿苷單磷酸 2mmol/l穩(wěn)定劑 10mmol/l在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測(cè)時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+
二氧化碳+過(guò)氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種5′-核苷酸酶活性測(cè)定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由尿苷單磷酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)尿苷單磷酸+水5核苷酸酶尿苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過(guò)氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測(cè)最終反應(yīng)物在主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述5′-核苷酸酶活性測(cè)定方法，其特征在于所述步驟2)為，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm，吸光度下降的速度，測(cè)算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測(cè)定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測(cè)定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于被測(cè)5′-核苷酸酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種5′-核苷酸酶診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l尿苷單磷酸 1--10mmol/l丙酮酸 1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l丙酮酸氧化酶2000--20000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2000--20000U/l蘋果酸脫氫酶2000--20000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADPH、NADH或thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定5′－核苷酸酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及5′－核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、尿苷單磷酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)吸光度變化的情況(速度)，從而測(cè)算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK1760373SQ20041006491
公開日2006年4月19日 申請(qǐng)日期2004年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月11日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:王爾中