專利名稱：肌酐含量測定方法及肌酐診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種測定肌酐含量的方法，同時本發(fā)明還涉及用于實現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
測定肌酐主要有化學測定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細管電泳法等。
化學測定法——成本低廉，操作簡便，是目前國內(nèi)測定肌酐最常用的方法之一。標本中的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復合物。此法的缺點是特異性不高，因為維生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應生成紅色。
高效液相層析法(HPLC)——肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽離子交換層析柱可與其他成分很好分離，在234nm測定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法不適于大批量臨床標本分析，通常僅作為肌酐測定的參考方法，用于評價市售肌酐測定的試劑盒和某些科研目的。
毛細管電泳法——血清標本用高速離心作預處理，尿液標本可用低速離心，除去有形成分，上清液用膠束動電毛細管電泳分離后測定235nm處吸光度。本法測定線性范圍寬，操作較為簡便，但需用特殊設備和進行血清標本的預處理，臨床常規(guī)使用困難。
酶學測定法——主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶(Creatininase)兩大類。檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?2139298.6、申請日為2002.11.15的專利申請公開了應用酶反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測定試劑。該發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測定反應所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類似物及其相應的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反應系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙酰胺輔酶或其類似物。當被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達到一定的濃度時，該發(fā)明所指的酶法試劑就可達到測定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測試提供一個內(nèi)源合成丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等反應所需要的底物—還原型煙酰胺輔酶。其缺點之一為，這個系統(tǒng)在生成反應所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時，也抵消了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測試的準確性大大降低。其缺點之二是，該試劑在正式測試前必須事先反應一段時間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶，這樣一來就造成了緩不濟急的結(jié)果，給測試帶來很大的不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點的肌酐含量的測定方法，同時給出實現(xiàn)該方法的肌酐診斷試劑盒，采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行肌酐含量測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明測定肌酐含量的方法步驟如下
1)、將樣品與主要由2-酮戊二酸酯、還原性輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出肌酐含量的大小。
通常步驟2)將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出肌酐含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應時間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應用肌酐脫亞胺酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應連續(xù)監(jiān)測法或比色法。肌酐脫亞胺酶將肌酐脫氨產(chǎn)生氨，再通過偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶(NADH、NADPH或其它類似物——在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(NAD+、NADP+或其它類似物——在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速(程)度，通過測量340nm處吸光度下降的速(程)度，可以測算肌酐的含量。
用于實現(xiàn)本發(fā)明方法的肌酐診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 0.5--50mmol/l還原性輔酶 0.15--0.5mmo/l肌酐脫亞胺酶 1000--50000U/l
谷氨酸脫氫酶 5000--90000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源氨污染試劑I緩沖液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 0.5--50mmol/l還原性輔酶0.15--0.5mmo/l谷氨酸脫氫酶 5000--90000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑II緩沖液40--200mmol/l肌酐脫亞胺酶 1000--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)如果不考慮內(nèi)、外源氨污染，雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，谷氨酸脫氫酶、2-酮戊二酸酯或還原性輔酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，肌酐脫亞胺酶等也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源氨污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液 40--200mmol/l2-酮戊二酸酯0.5--50mmol/l還原性輔酶 0.15--0.5mmo/l穩(wěn)定劑 10--50mmo/l試劑II
緩沖液40--200mmol/l谷氨酸脫氫酶 5000--90000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)試劑III緩沖液40--200mmol/l肌酐脫亞胺酶 1000--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，2-酮戊二酸酯、還原性輔酶等可以放在試劑II中，試劑II其中的成分，谷氨酸脫氫酶也可以放在試劑I中，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0-11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10-80％或者10-50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、鹽或腺苷二磷酸等中的一種或一種以上。
實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關系的本發(fā)明肌酐診斷試劑盒較為理想緩沖液80--120mmol/l2-酮戊二酸酯 5--20mmol/l還原性輔酶0.15--0.3mmo/l肌酐脫亞胺酶 2000--20000U/l谷氨酸脫氫酶 10000--50000U/l穩(wěn)定劑20--50％由于本發(fā)明是完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應的特異性促使測試結(jié)果精確。酶解反應都是在緩沖液條件下進行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準確性，更便于推廣應用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源氨的污染，消除內(nèi)、外源氨的作用發(fā)生在整個反應時間段的前半部分，在后半段時間受污染的內(nèi)、外源氨已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時間測試肌酐含量所需要的氨都是產(chǎn)生于肌酐的含量。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的肌酐診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l2-酮戊二酸酯 5mmol/l還原性輔酶 0.15mmo/l肌酐脫亞胺酶 2000U/l谷氨酸脫氫酶 10000U/l
穩(wěn)定劑 50％在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速(程)度，從而測算出肌酐的含量。
本實施例應用肌酐脫亞胺酶偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應連續(xù)監(jiān)測法或比色法。肌酐脫亞胺酶將肌酐脫氨產(chǎn)生氨，再通過偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶的作用，將還原型輔酶氧化成為輔酶，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速(程)度，通過測量340nm處吸光度下降的速(程)度，可以測算肌酐的含量。
實施例二(雙劑)本實施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l2-酮戊二酸酯 12mmol/l還原性輔酶 0.25mmo/l谷氨酸脫氫酶 30000U/l穩(wěn)定劑 50％試劑II緩沖液 100mmol/l
肌酐脫亞胺酶 11000U/l穩(wěn)定劑 50％測定肌酐含量時，溫度控制在30℃，反應時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
具體測定步驟為肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速(程)度，從而測算出肌酐的含量。
各反應步驟的反應時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的肌酐診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液120mmol/l2-酮戊二酸酯 20mmol/l還原性輔酶0.3mmo/l穩(wěn)定劑20mmo/l試劑II緩沖液120mmol/l谷氨酸脫氫酶 50000U/l穩(wěn)定劑50％試劑III緩沖液120mmol/l
肌酐脫亞胺酶 20000U/l穩(wěn)定劑 50％在全自動生化分析儀上設定溫度25℃，反應時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
具體測定步驟為肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速(程)度，從而測算出肌酐的含量。
各反應步驟的反應時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的肌酐診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l2-酮戊二酸酯10mmol/l還原性輔酶 0.25mmo/l谷氨酸脫氫酶50000U/l穩(wěn)定劑 50％試劑II緩沖液 100mmol/l肌酐脫亞胺酶8000U/l穩(wěn)定劑 50％在生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速(程)度，從而測算出肌酐的含量。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種肌酐含量測定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由2-酮戊二酸酯、還原性輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應肌酐+水+H+肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨離子氨離子+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶谷氨酸+輔酶2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出肌酐含量的大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肌酐含量測定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速(程)度，測算出肌酐的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肌酐含量測定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應時間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肌酐含量測定方法，其特征在于被測肌酐樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種肌酐診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40——200mmol/l
2-酮戊二酸酯 0.5——50mmol/l還原性輔酶 0.15——0.5mmo/l肌酐脫亞胺酶 1000——50000U/l谷氨酸脫氫酶 5000——90000U/l穩(wěn)定劑 10——80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、鹽或腺苷二磷酸中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0-11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述肌酐診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶是NADPH、NADH、thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定肌酐含量的方法，同時本發(fā)明還涉及肌酐診斷試劑盒，屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領域。該試劑盒包括緩沖液、2－酮戊二酸酯、還原型輔酶、谷氨酸脫氫酶、肌酐脫亞胺酶及穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應，再將最終反應物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出肌酐的含量。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應用。
文檔編號C12Q1/32GK1757755SQ20041006489
公開日2006年4月12日 申請日期2004年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中