專利名稱：5＇－核苷酸酶活性測定方法及5＇－核苷酸酶診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定5′-核苷酸酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及用于實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)學(xué)研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要見于阻塞性黃膽，也可見于肝癌和肝炎。在膽汁淤積并發(fā)膽管炎、原發(fā)性和繼發(fā)性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時(shí)，5NT升高率高于堿性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時(shí)5NT升高的敏感性高于堿性磷酸酶。因?yàn)?′-核苷酸酶活性無生理性升高，對于診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較堿性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5′-核苷酸酶的活性對于疾病的診斷具有重要意義。
5′-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學(xué)強(qiáng)酸測磷法(1925年)。據(jù)申請人了解，目前國際上普遍采用同位素底物測試法，方法為5′-核苷酸酶作用于H3-dUMP，終止反應(yīng)后，通過離子交換層析柱分析結(jié)果，求得5′-核苷酸酶活性?；蛘呃?′-核苷酸酶作用于單磷酸腺苷后產(chǎn)生無機(jī)磷，再用化學(xué)強(qiáng)酸法分析無機(jī)磷含量得以計(jì)算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法復(fù)雜還有同位素污染，而且需要同位素測定儀，因此難以切實(shí)推廣應(yīng)用。無機(jī)磷測定法是1925年發(fā)明的方法，準(zhǔn)確度不好，強(qiáng)酸污染環(huán)境等等，也不適合推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的5′-核苷酸酶活性的測定方法，同時(shí)給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行5′-核苷酸酶活性測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測定5′-核苷酸酶活性的步驟如下本發(fā)明測定5′-核苷酸酶活性的步驟如下1)、將樣品與主要由肌苷單磷酸、丙酮酸、乙醇、氧化型輔酶、丙酮酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下方法原理的反應(yīng)肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應(yīng)用5′-核苷酸酶、丙酮酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，以肌苷單磷酸為底物，最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因?yàn)檫€原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm吸收峰的增加程度可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)有一、它利用測量氧化型輔酶被還原成還原性輔酶的生成量來反映5′-核苷酸酶活性，氧化型輔酶在溶液中的穩(wěn)定性比還原性輔酶高很多，因此這個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性很好。二、這個(gè)酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)的需要先將體(血)液中原來含有的磷酸根(H2PO4-)消滅掉，否則結(jié)果會(huì)受體(血)液中不等含量的磷酸根的影響。這種消滅內(nèi)源磷酸根的步驟可以通過調(diào)配雙試劑，讓血樣先和試劑中第二、第三及第四反應(yīng)先作用后，再加入腺苷單磷酸啟動(dòng)5′-核苷酸酶作用。
用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l肌苷單磷酸 1--50mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l丙酮酸氧化酶 500--50000U/l過氧化氫酶 500--50000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內(nèi)、外源磷酸根污染試劑I緩沖液40--200mmol/l
丙酮酸 1--20mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l丙酮酸氧化酶 500--50000U/l過氧化氫酶 500--50000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑II緩沖液 40--200mmol/l肌苷單磷酸 1--50mmol/l穩(wěn)定劑 10--80mmol/l還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源磷酸根污染，還更有利于試劑的穩(wěn)定試劑I緩沖液40--200mmol/l丙酮酸1--20mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型輔酶0.5--20mmol/l穩(wěn)定劑10--80mmol/l試劑II緩沖液40--200mmol/l丙酮酸氧化酶 500--50000U/l過氧化氫酶500--50000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩(wěn)定劑10--80％(總體積)
試劑III緩沖液40--200mmol/l肌苷單磷酸1--50mmol/l穩(wěn)定劑10--80mmol/l三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，丙酮酸、乙醇、氧化型輔酶等可以放在試劑II中，試劑II其中的成分，丙酮酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等也可以放在試劑I中，如此可以形成多種配方，就不在此一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamineo)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上氧化型輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明5′-核苷酸酶診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l腺苷單磷酸 1--5mmol/l
丙酮酸 1--10mmol/l乙醇1--10mmol/l氧化型輔酶 1--5mmol/l丙酮酸氧化酶5000--20000U/l過氧化氫酶 5000--20000U/l醛脫氫酶5000--20000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，不易受到內(nèi)、外源其他物質(zhì)的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
此外，本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源磷酸根的污染，消除內(nèi)、外源磷酸根的作用發(fā)生在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間段的前半部分，在后半段時(shí)間受污染的內(nèi)、外源磷酸根已經(jīng)被消耗殆盡，而在后半段時(shí)間測試5′-核苷酸酶活性所需要的磷酸根都是產(chǎn)生于5′-核苷酸酶的活性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l腺苷單磷酸 1mmol/l丙酮酸 1mmol/l乙醇 1mmol/l
氧化型輔酶 1mmol/l丙酮酸氧化酶5000U/l過氧化氫酶 5000U/l醛脫氫酶5000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
本實(shí)施例應(yīng)用5′-核苷酸酶、丙酮酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，，以肌苷單磷酸為底物，最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因?yàn)檫€原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm吸收峰的增加程度可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I
緩沖液100mmol/l丙酮酸6mmol/l乙醇 6mmol/l氧化型輔酶6mmol/l丙酮酸氧化酶 12000U/l過氧化氫酶12000U/l醛脫氫酶 12000U/l穩(wěn)定劑50％(總體積)試劑II緩沖液100mmol/l肌苷單磷酸3mmol/l穩(wěn)定劑30mmol/l測定5′-核苷酸酶活性時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 120mmol/l丙酮酸 10mmol/l乙醇10mmol/l氧化型輔酶 5mmol/l穩(wěn)定劑 50mmol/l試劑II緩沖液 120mmol/l丙酮酸氧化酶20000U/l過氧化氫酶 20000U/l醛脫氫酶20000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 120mmol/l肌苷單磷酸 5mmol/l穩(wěn)定劑 50mmol/l在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+
二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在20分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l丙酮酸 5mmol/l乙醇 2mmol/l氧化型輔酶 1mmol/l丙酮酸氧化酶 10000U/l過氧化氫酶 8000U/l醛脫氫酶 6000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l肌苷單磷酸 1mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)，延遲時(shí)間1分鐘，檢測時(shí)間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。
權(quán)利要求
1.一種5′-核苷酸酶活性測定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由肌苷單磷酸、丙酮酸、乙醇、氧化型輔酶、丙酮酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下反應(yīng)肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述5′-核苷酸酶活性測定方法，其特征在于所述步驟2)為，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm，吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測定5′-核苷酸酶活性的方法，其特征在于被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種5′-核苷酸酶診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液 40--200mmol/l肌苷單磷酸 1--50mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l乙醇1--30mmol/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l丙酮酸氧化酶500--50000U/l過氧化氫酶 500--50000U/l醛脫氫酶500--50000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑為三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特征在于所述氧化型輔酶是NADP+、NAD+或thio-NAD+氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定5′－核苷酸酶活性的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及5′－核苷酸酶診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、肌苷單磷酸、丙酮酸、乙醇、氧化型輔酶、丙酮酸氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出5′－核苷酸酶的活性大小。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/32GK1760370SQ200410064908
公開日2006年4月19日 申請日期2004年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月11日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中