專利名稱：一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的連續(xù)核酸序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子(XYGluD3-LMWGS1)的核酸序列及其應(yīng)用，其應(yīng)用基于該序列通過基因工程方法改良小麥加工品質(zhì)。
背景技術(shù)：
小麥低分子量麥谷蛋白(Low Molecular Weight Glutenin)是小麥種子中的一類重要的貯藏蛋白。編碼這類蛋白的基因座位(Glu-3)位于第一同源群染色體(1A、1B、1D)的短臂上。每個基因座位包括2-7個基因，它們分別編碼分子量大小不同的亞基。Glu-3的三個位點(即Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3)均存在基因等位變異，故其編碼的亞基都存在著多態(tài)性。每個六倍體普通小麥品種應(yīng)該包含多個不同的低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)。小麥LMW-GS組成對其加工品質(zhì)性狀有重要的影響，它和高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)相互作用，共同決定著小麥面團的彈性和強度。LMW-GS組成對加工品質(zhì)的貢獻(xiàn)已從遺傳、蛋白結(jié)構(gòu)等方面得到確證。研究認(rèn)為基因Glu-A3b和Glu-B3b分別優(yōu)于其等位基因Glu-A3d和Glu-B3h。利用SDS-PAGE、PCR方法進行追蹤，通過轉(zhuǎn)基因?qū)胪庠碒MW-GS和LMW-GS基因，提高小麥的加工品質(zhì)的研究在國外已有成功的報道。
小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因(XYGluD3-LMWGS1)存在于面包小麥小偃6號等品種中，是Glu-D3位點的一個基因。該基因編碼的LMW-GS含有304個氨基酸殘基(其中N-末端的20個為信號肽)，其中包含9個半胱氨酸殘基；比所有已知LMW-GS多1個半胱氨酸殘基，該亞基類型的出現(xiàn)與面包加工品質(zhì)呈正相關(guān)，是中國獨特的優(yōu)質(zhì)基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以我國優(yōu)質(zhì)小麥品種小偃6號為材料，提供一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其啟動子的核酸序列及其應(yīng)用，首次從小偃6號中克隆了Glu-D3位點的一種LMW-GS基因(XYGluD3-LMWGS1)；并開展了基于該基因的分子標(biāo)記和轉(zhuǎn)基因研究，以培育出新的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)或品種。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的連續(xù)核酸序列，其特殊之處在于該基因及其啟動子序列為1TTGTAGAAAC TGCCATCCTT TACATGTAAA GCGGATTCGA TGAGTCATGT51 CATGCTCTAT AGACGTCAGT TTATCTTATC ATCTTACAGG AAAGTACAAA101 GTTAGTTTTC TGAAAAGCAA CCGAATATAG AAGAACACTC CACACTCAAG151 GCTTTACTAA TCGAGCATAT CCTAACAGCC CACACATGAT TGCAAACTTA201 GTCATACACA AGTTTTGCCT TTCTTGTTTA CGGCTGACAG CCTATACAAG251 GTTCCAAACT CGGTTGTAAA AGTGATACTA TCTTGATAAG TGTGTGACAT301 GTAAAGTTAA TAAGGTGAGT CATATATAGC AAATATCGGG GTTTCTGTAC351 TTTGTGTGTG ATCGTATGCA CAACTAAAAA TCAACTTTGA TGATCAATAT401 ATCCAAAAGT ACGCTTGTAG CTAGTGCAAA CCTAACACAA TGTAACAAAA
451 TAATTCATTT CAGATGGAGC CAAACAGAAT TATTAAAGCT GATGCAAAGA501 AGGAAAAGAG GTGGTTCCTG GGCTACTATA AATAGGCATG AAGTATAAAG551 ATCATCACAA GCACAAGCAT CAGAACCAAG CAACACTAGT TAACACCAAT601 CCACCATGAA GACCTTCCTC GTCTTTGCCC TCCTCGCCGT TGCGGCGACA651 AGTGCAATTG CGCAGATGGA GACTAGATGC ATCCCTGGTT TGGAGAGACC701 ATGGCAGCAG CAACCATTAC CACCACAACA GACATTTCCA CAACAACCAC751 TATTTTCACA ACAACAACAA CTATTTCCTC AACAACCATC ATTTTCGCAG801 CAACAACCAC CATTTTGGCA GCAACAACCA CCATTTTCTC AGCAACAACC851 AATTCTACCA CAGCAACCAC CATTTTCGCA GCAACAACAA CTAGTTCTAC901 CGCAACAACC ACCATTTTCA CAGCAACAAC AACCAGTTTT ACCTCCACAA951 CAATCACCTT TTCCACAACA ACAACAACAC CAACAGCTGG TGCAACAACA1001 AATCCCTGTT GTTCAGCCAT CCATTTTGCA GCAGCTAAAC CCATGCAAGC1051 TATTCCTCCA GCAGCAGTGC AGCCCTGTGG CAATGCCACA ACGTCTTGCT1101 AGGTCGCAAA TGTTGCAGCA GAGCTGTTGC CATGTGATGC AACAACAATG1151 TTGCCAGCAG TTGCCGCAAA TCCCCCAGCA ATCCCGCTAT GAGGCAATCC1201 GTGCTATCAT CTACTCCATC ATCCTGCAAG AACAACAACA GGTTCAGGGT1251 TCCATCCAAT CTCAGCAGCA GCAACCCCAA CAGTTGGGCC AATGTGTTTC1301 CCAACCCCAA CAACAGTCGC AGCAGCAACT CGGGCAACAA CCTCAACAAC1351 AACAATTGGC ACAGGGTACC TTTTTGCAGC CACACCAGAT AGCTCAGCTT1401 GAGGTGATGA CTTCCATTGC GCTCCGTATC CTGCCAACGA TGTGCAGTGT1451 TAATGTGCCG TTGTACAGAA CCACCACTAG TGTGCCATTC GACGTTGGCA1501 CCGGAGTTGG TGCCTACTGA TAAGGAAAGA TCTCTAGTAA TATATAATTG
1551 GGTCACCGTT GTTTAGTCGA TGGATATGTC GATGCAGCGG TGAC上述胚乳特異表達(dá)啟動子(XYGluD3-LMWGS1)的PCR方式克隆時的引物序列為5’TTGTAGAAACTGCCATCCTT 3’5’GTCACCGCTGCATCGACATA 3’一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的連續(xù)核酸序列的應(yīng)用，其特殊之處在于通過基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道等方法導(dǎo)入小麥，培育出加工品質(zhì)優(yōu)良的小麥品種或小麥種質(zhì)。
一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的核酸序列的應(yīng)用，其特殊之處在于根據(jù)該基因的胚乳特異表達(dá)啟動子的核酸序列構(gòu)建種子胚乳特異表達(dá)載體，將外源目的基因?qū)胄←?，培育出加工品質(zhì)優(yōu)良的小麥品種和小麥種質(zhì)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下1、本發(fā)明首次從小偃6號中克隆了Glu-D3位點的一種LMW-GS基因(XYGluD3-LMWGS1)；并開展了基于該基因的分子標(biāo)記和轉(zhuǎn)基因研究，以期培育出新的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)或品種；2、本發(fā)明以我國優(yōu)質(zhì)小麥品種小偃6號為材料，通過位點特異PCR擴增Glu-D3位點的一種基因的完整編碼區(qū)和其胚乳特異表達(dá)啟動子區(qū)，并將該基因及其啟動子克隆入一種克隆載體中。
3、本發(fā)明經(jīng)測序和分析結(jié)果表明，基因XYGluD3-LMWGS1是不同于已經(jīng)公布的所有LMW-GS基因的一種新的LMW-GS基因類型，該序列特征顯示該序列的獨特之處和導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)的潛在因素。
具體實施例方式1、基因序列小麥麥谷蛋白Glu-D3位點控制的一種低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子(XYGluD3-LMWGS1)的連續(xù)核酸序列。該基因及其啟動子的序列為1TTGTAGAAAC TGCCATCCTT TACATGTAAA GCGGATTCGA TGAGTCATGT51 CATGCTCTAT AGACGTCAGT TTATCTTATC ATCTTACAGG AAAGTACAAA101 GTTAGTTTTC TGAAAAGCAA CCGAATATAG AAGAACACTC CACACTCAAG151 GCTTTACTAA TCGAGCATAT CCTAACAGCC CACACATGAT TGCAAACTTA201 GTCATACACA AGTTTTGCCT TTCTTGTTTA CGGCTGACAG CCTATACAAG251 GTTCCAAACT CGGTTGTAAA AGTGATACTA TCTTGATAAG TGTGTGACAT301 GTAAAGTTAA TAAGGTGAGT CATATATAGC AAATATCGGG GTTTCTGTAC351 TTTGTGTGTG ATCGTATGCA CAACTAAAAA TCAACTTTGA TGATCAATAT401 ATCCAAAAGT ACGCTTGTAG CTAGTGCAAA CCTAACACAA TGTAACAAAA451 TAATTCATTT CAGATGGAGC CAAACAGAAT TATTAAAGCT GATGCAAAGA501 AGGAAAAGAG GTGGTTCCTG GGCTACTATA AATAGGCATG AAGTATAAAG551 ATCATCACAA GCACAAGCAT CAGAACCAAG CAACACTAGT TAACACCAAT601 CCACCATGAA GACCTTCCTC GTCTTTGCCC TCCTCGCCGT TGCGGCGACA651 AGTGCAATTG CGCAGATGGA GACTAGATGC ATCCCTGGTT TGGAGAGACC701 ATGGCAGCAG CAACCATTAC CACCACAACA GACATTTCCA CAACAACCAC751 TATTTTCACA ACAACAACAA CTATTTCCTC AACAACCATC ATTTTCGCAG801 CAACAACCAC CATTTTGGCA GCAACAACCA CCATTTTCTC AGCAACAACC
851 AATTCTACCA CAGCAACCAC CATTTTCGCA GCAACAACAA CTAGTTCTAC901 CGCAACAACC ACCATTTTCA CAGCAACAAC AACCAGTTTT ACCTCCACAA951 CAATCACCTT TTCCACAACA ACAACAACAC CAACAGCTGG TGCAACAACA1001 AATCCCTGTT GTTCAGCCAT CCATTTTGCA GCAGCTAAAC CCATGCAAGC1051 TATTCCTCCA GCAGCAGTGC AGCCCTGTGG CAATGCCACA ACGTCTTGCT1101 AGGTCGCAAA TGTTGCAGCA GAGCTGTTGC CATGTGATGC AACAACAATG1151 TTGCCAGCAG TTGCCGCAAA TCCCCCAGCA ATCCCGCTAT GAGGCAATCC1201 GTGCTATCAT CTACTCCATC ATCCTGCAAG AACAACAACA GGTTCAGGGT1251 TCCATCCAAT CTCAGCAGCA GCAACCCCAA CAGTTGGGCC AATGTGTTTC1301 CCAACCCCAA CAACAGTCGC AGCAGCAACT CGGGCAACAA CCTCAACAAC1351 AACAATTGGC ACAGGGTACC TTTTTGCAGC CACACCAGAT AGCTCAGCTT1401 GAGGTGATGA CTTCCATTGC GCTCCGTATC CTGCCAACGA TGTGCAGTGT1451 TAATGTGCCG TTGTACAGAA CCACCACTAG TGTGCCATTC GACGTTGGCA1501 CCGGAGTTGG TGCCTACTGA TAAGGAAAGA TCTCTAGTAA TATATAATTG1551 GGTCACCGTT GTTTAGTCGA TGGATATGTC GATGCAGCGG TGAC2.應(yīng)用方法上述基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的核酸序列，可以通過以下途徑應(yīng)用1)通過基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道等本領(lǐng)域工作人員共知的方法導(dǎo)入小麥，培育出加工品質(zhì)優(yōu)良的小麥品種和小麥種質(zhì)；2)根據(jù)該基因核酸序列可以建立簡捷的特異PCR標(biāo)記體系，并通過該標(biāo)記體系進行定向育種，獲得加工品質(zhì)優(yōu)良的小麥新品種或新種質(zhì)；3)根據(jù)基因核酸序列可以構(gòu)建其酵母表達(dá)載體，通過本領(lǐng)域共知的研究方法將其導(dǎo)入酵母，然后通過在面粉中添加該轉(zhuǎn)基因酵母提高面筋彈性。
4)根據(jù)該基因的胚乳特異表達(dá)啟動子的核酸序列構(gòu)建種子胚乳特異表達(dá)載體，通過本領(lǐng)域共知的研究方法將外源目的基因?qū)胄←?，培育出加工品質(zhì)優(yōu)良的小麥品種和小麥種質(zhì)。
本發(fā)明位點特異PCR引物設(shè)計對所有已知LMW-GS基因按Glu-3位點分類，再對每類進行序列同源性比對，根據(jù)特定區(qū)域的保守序列設(shè)計出Glu-D3位點特異的LMW-GS基因PCR引物，序列如下Primer 1 5’TTGTAGAAACTGCCATCCTT 3’Primer 2 5’GTCACCGCTGCATCGACATA 3’基因的擴增CTAB法提取小麥基因組DNA，利用下述條件擴增目的基因小麥LMW-GS基因穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系為反應(yīng)體積為20μl，Mg2+濃度為2.5mmol/L，dNTP濃度為200umol/L，模板DNA量為30-60ng，每種引物含量為50ng，Taq酶0.5U；PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1min；循環(huán)反應(yīng)為94℃ 1min，62℃ 1min，72℃，2min，30循環(huán)后，再72℃延伸7min。
基因克隆將擴增產(chǎn)物通過pGEM-T easy載體進行直接克隆，并通過菌落PCR和質(zhì)粒酶切驗證克隆產(chǎn)物是否正確。
序列分析序列分析通過ABI370測序儀完成。得到上述基因核酸序列。
權(quán)利要求
1.一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的連續(xù)核酸序列，其特征在于該基因及其啟動子序列為1 TTGTAGAAAC TGCCATCCTT TACATGTAAA GCGGATTCGA TGAGTCATGT51 CATGCTCTAT AGACGTCAGT TTATCTTATC ATCTTACAGG AAAGTACAAA101GTTAGTTTTC TGAAAAGCAA CCGAATATAG AAGAACACTC CACACTCAAG151GCTTTACTAA TCGAGCATAT CCTAACAGCC CACACATGAT TGCAAACTTA201GTCATACACA AGTTTTGCCT TTCTTGTTTA CGGCTGACAG CCTATACAAG251GTTCCAAACT CGGTTGTAAA AGTGATACTA TCTTGATAAG TGTGTGACAT301GTAAAGTTAA TAAGGTGAGT CATATATAGC AAATATCGGG GTTTCTGTAC351TTTGTGTGTG ATCGTATGCA CAACTAAAAA TCAACTTTGA TGATCAATAT401ATCCAAAAGT ACGCTTGTAG CTAGTGCAAA CCTAACACAA TGTAACAAAA451TAATTCATTT CAGATGGAGC CAAACAGAAT TATTAAAGCT GATGCAAAGA501AGGAAAAGAG GTGGTTCCTG GGCTACTATA AATAGGCATG AAGTATAAAG551ATCATCACAA GCACAAGCAT CAGAACCAAG CAACACTAGT TAACACCAAT601CCACCATGAA GACCTTCCTC GTCTTTGCCC TCCTCGCCGT TGCGGCGACA651AGTGCAATTG CGCAGATGGA GACTAGATGC ATCCCTGGTT TGGAGAGACC701ATGGCAGCAG CAACCATTAC CACCACAACA GACATTTCCA CAACAACCAC751TATTTTCACA ACAACAACAA CTATTTCCTC AACAACCATC ATTTTCGCAG801CAACAACCAC CATTTTGGCA GCAACAACCA CCATTTTCTC AGCAACAACC851AATTCTACCA CAGCAACCAC CATTTTCGCA GCAACAACAA CTAGTTCTAC901CGCAACAACC ACCATTTTCA CAGCAACAAC AACCAGTTTT ACCTCCACAA951CAATCACCTT TTCCACAACA ACAACAACAC CAACAGCTGG TGCAACAACA1001 AATCCCTGTT GTTCAGCCAT CCATTTTGCA GCAGCTAAAC CCATGCAAGC1051 TATTCCTCCA GCAGCAGTGC AGCCCTGTGG CAATGCCACA ACGTCTTGCT1101 AGGTCGCAAA TGTTGCAGCA GAGCTGTTGC CATGTGATGC AACAACAATG1151 TTGCCAGCAG TTGCCGCAAA TCCCCCAGCA ATCCCGCTAT GAGGCAATCC1201 GTGCTATCAT CTACTCCATC ATCCTGCAAG AACAACAACA GGTTCAGGGT1251 TCCATCCAAT CTCAGCAGCA GCAACCCCAA CAGTTGGGCC AATGTGTTTC1301 CCAACCCCAA CAACAGTCGC AGCAGCAACT CGGGCAACAA CCTCAACAAC1351 AACAATTGGC ACAGGGTACC TTTTTGCAGC CACACCAGAT AGCTCAGCTT1401 GAGGTGATGA CTTCCATTGC GCTCCGTATC CTGCCAACGA TGTGCAGTGT1451 TAATGTGCCG TTGTACAGAA CCACCACTAG TGTGCCATTC GACGTTGGCA1501 CCGGAGTTGG TGCCTACTGA TAAGGAAAGA TCTCTAGTAA TATATAATTGGGTCACCGTT GTTTAGTCGA TGGATATGTC GATGCAGCGG TGAC
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的連續(xù)核酸序列，其特征在于所述胚乳特異表達(dá)啟動子(XYGluD3-LMWGS1)的PCR方式克隆時的引物序列為5’TTGTAGAAACTGCCATCCTT 3’5’GTCACCGCTGCATCGACATA 3’
3.一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的連續(xù)核酸序列的應(yīng)用，其特征在于通過基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道等方法導(dǎo)入小麥，培育出加工品質(zhì)優(yōu)良的小麥品種和小麥種質(zhì)。
4.一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的連續(xù)核酸序列的應(yīng)用，其特征在于根據(jù)基因的胚乳特異表達(dá)啟動子的核酸序列構(gòu)建種子胚乳特異表達(dá)載體，將外源目的基因?qū)胄←?，培育出加工品質(zhì)優(yōu)良的小麥品種和小麥種質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的連續(xù)核酸序列及其應(yīng)用，本發(fā)明以我國優(yōu)質(zhì)小麥品種小偃6號為材料，提供一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基基因及其胚乳特異表達(dá)啟動子的核酸序列及其應(yīng)用，首次從小偃6號中克隆了Glu－D3位點的一種LMW－GS基因(XYGluD3－LMWGS1)；并開展了基于該基因的分子標(biāo)記和轉(zhuǎn)基因研究，以培育出新的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)或品種。
文檔編號C12N15/11GK1683531SQ20031012223
公開日2005年10月19日 申請日期2003年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者趙惠賢, 范三紅, 徐虹, 胡勝武, 郭藹光 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)