專利名稱：一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：
隨著生活水平的提高，人們?cè)陉P(guān)注食品營養(yǎng)品質(zhì)的同時(shí)也對(duì)其外觀品質(zhì)提出了更高的要求。我國的傳統(tǒng)食品如面條、饅頭等對(duì)色澤的要求較高，具有白亮色澤的食品更受消費(fèi)者歡迎(He等，2003；楊金等，2004)。為迎合消費(fèi)者對(duì)面制品求白的心理，一些生產(chǎn)商向面粉中添加增白劑以提高面粉白度。近幾年國家質(zhì)檢部門對(duì)面粉行業(yè)的質(zhì)量抽檢報(bào)告表明，我國多數(shù)面粉增白劑含量嚴(yán)重超標(biāo)(焦淑婷等，2001)。大量使用增白劑會(huì)使面粉失去麥香味，長期食用增白劑超標(biāo)的面粉會(huì)加重肝臟負(fù)擔(dān)，引起慢性中毒，嚴(yán)重影響人體健康。
研究表明，面粉黃色素含量是影響面包、面條黃度的主要因素(楊金等，2004；He等，2004)。黃色素含量雖然在一定程度上受環(huán)境因素影響(Miskelly，1984)，但其主要受遺傳因素調(diào)控，遺傳力為0.67(Parker等，1998)或者更高0.88～0.97(Elouafi等，1995；Clarke等，2006)。我國312份普通冬小麥品種(系)間籽粒黃色素含量存在很大差異，變化范圍為0.35～3.42mg/kg，相差約10倍，選擇潛力很大(何中虎，2008，未發(fā)表)，通過育種途徑改良小麥黃色素含量是完全可行的。
對(duì)于黃色素含量的常規(guī)選擇方法是直接對(duì)面粉的黃色素含量進(jìn)行測量，因此只能在高代(高代是指雜交育種中經(jīng)過一次雜交，然后經(jīng)多代自交和選擇而獲得的群體，該群體具有大體整齊一致的表現(xiàn)型和基因型，但還未審定成為品種，稱為高代品系)進(jìn)行選擇，同時(shí)又由于環(huán)境等因素的影響，同一品種在不同年份、不同生長地點(diǎn)所表現(xiàn)出的表型值可能會(huì)有較大的差異。分子標(biāo)記輔助選擇(Marker assisted selection，MAS)是基于基因型的選擇，不受外界環(huán)境因素的影響，被越來越廣泛地應(yīng)用于育種實(shí)踐中。常用的分子標(biāo)記類型有RFLP、AFLP、SSR等，但這些標(biāo)記類型不能與目標(biāo)基因共分離，同時(shí)在分子育種中應(yīng)用成本較高，因此亟待開發(fā)準(zhǔn)確而又經(jīng)濟(jì)的分子標(biāo)記類型。功能標(biāo)記(Functionalmarker)是一類基于基因特征序列開發(fā)的標(biāo)記，與目標(biāo)基因共分離，大大提高了選擇的準(zhǔn)確性(Bagge等，2007)，在MAS中有著廣泛應(yīng)用前景。
雖然影響黃色素的基因較多，但大量QTL定位表明，影響小麥黃色素含量的關(guān)鍵基因位于7A與7B染色體上(Parker等，1998；Elouafi等，2001；Mares等，2001；張立平等，2006；Kuchel等，2006)，可解釋表型變異的30-60％。但與這些QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記大多為AFLP和SSR等非基因特異性標(biāo)記，不能與目標(biāo)基因共分離，同時(shí)在分子育種中應(yīng)用成本較高，因此不能廣泛用于分子輔助育種。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
本發(fā)明提供的小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白，是如下1)或2)或3)或4)或5)的蛋白質(zhì) (1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (3)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (4)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (5)將序列1、3、5或7所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與黃色素含量性狀相關(guān)的由序列1、3、5或7衍生的蛋白質(zhì)。
為了使所述蛋白便于純化，可在由序列表中序列1、序列3、序列5或序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
表1標(biāo)簽的序列 上述蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2、序列4、序列6或序列8所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述蛋白編碼基因可為如下1)或2)或3)或4)或5)或6)的DNA分子 1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子； 2)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子； 3)其核苷酸序列是序列表中序列6所示的DNA分子； 4)其核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子； 5)在嚴(yán)格條件下與1)、2)、3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 6)與1)、2)、3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
上述嚴(yán)格條件可為在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
基于所述蛋白的編碼基因及其等位變異，本發(fā)明還提供了兩對(duì)標(biāo)記引物。
本發(fā)明提供的標(biāo)記引物A，是由序列表中序列9的核苷酸序列和序列10的核苷酸序列組成的一對(duì)引物。
本發(fā)明提供的標(biāo)記引物B，是由序列表中序列11的核苷酸序列和序列12的核苷酸序列組成的一對(duì)引物。
基于所述編碼基因及其等位變異以及所述標(biāo)記引物，本發(fā)明提供了一種檢測小麥黃色素含量性狀的方法。
本發(fā)明提供的檢測小麥黃色素含量性狀的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，用所述標(biāo)記引物A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有156bp的條帶或151bp的條帶；如PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中無156bp的條帶和151bp的條帶，再以所述待測小麥基因組DNA為模板，用所述標(biāo)記引物B進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有428bp的條帶。
所述方法中，如所述標(biāo)記引物A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有156bp的條帶或151bp的條帶，所述待測小麥為候選低黃色素含量小麥；如所述標(biāo)記引物A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中無156bp的條帶和151bp的條帶，而所述標(biāo)記引物B的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有428bp的條帶，所述待測小麥為候選高黃色素含量小麥。
用所述標(biāo)記引物A進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物可通過6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測；用所述標(biāo)記引物B進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物可通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。
所述小麥具體可為普通小麥。
所述方法在培育低黃色素含量小麥中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明所提供的蛋白及其編碼基因，與小麥的黃色素含量性狀有著緊密的相關(guān)性。本發(fā)明還提供了基于該小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白基因等位變異的特異性功能標(biāo)記，利用該標(biāo)記可以對(duì)小麥黃色素含量相關(guān)基因的變異進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，從而培育低黃色素含量的優(yōu)良小麥品種。應(yīng)用本發(fā)明提供的蛋白及其編碼基因以及功能標(biāo)記輔助選擇，可在發(fā)育早期篩選小麥品種，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本。本發(fā)明提供的檢測小麥黃色素含量性狀的方法具有操作簡單、穩(wěn)定可靠、成本低廉、周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，對(duì)快速改良小麥面制品顏色具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。



圖1為普通小麥的4個(gè)黃色素含量性狀相關(guān)蛋白編碼基因等位基因的序列比對(duì)。
圖2為15個(gè)樣本的第一次分型鑒定結(jié)果。
圖3為15個(gè)樣本的第二次分型鑒定結(jié)果。

具體實(shí)施例方式 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、與黃色素含量性狀相關(guān)的蛋白及其編碼基因的獲得 本實(shí)施例中所用到的引物序列見表2。
表2用于克隆Psy-B1位點(diǎn)等位基因的引物序列

1、Psy-Bla蛋白及其編碼基因的獲得 采取電子克隆結(jié)合常規(guī)PCR擴(kuò)增的方法獲取到了Psy-Bla蛋白編碼基因，具體如下 1)以玉米PSY基因(GenBank登錄號(hào)U32636)的cDNA序列作為電子探針篩選GenBank小麥EST數(shù)據(jù)庫，并將得到的序列進(jìn)行電子拼接組建跨疊群(contig)。
2)根據(jù)EST序列CD862515、CD875290和CA598664組建的跨疊群設(shè)計(jì)引物P7B1，通過在中國春缺體-四體系中進(jìn)行染色體定位發(fā)現(xiàn)其位于7B染色體上。根據(jù)該段測得的序列以及Psy-Ala的序列(GenBank登錄號(hào)EF600063)設(shè)計(jì)引物P7B2和P7B3，以中麥16號(hào)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得基因全長序列。
3)將獲得的Psy-Bla全長序列與Psy-Ala基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定其內(nèi)含子區(qū)及起始密碼子和終止密碼子，并將外顯子進(jìn)行拼接，翻譯獲得Psy-Bla蛋白序列。
Psy-Bla蛋白的序列如序列表的序列1所示，Psy-Bla蛋白的編碼基因序列如序列表的序列2所示。
2、Psy-Blb蛋白及其編碼基因的獲得 方法同步驟1中Psy-Bla蛋白的獲得。以高優(yōu)503的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
Psy-Blb蛋白的序列如序列表的序列3所示，Psy-Blb蛋白的編碼基因序列如序列表的序列4所示。
3、Psy-Blc蛋白及其編碼基因的獲得 應(yīng)用引物P7B1擴(kuò)增晉麥61的基因組DNA，分析PCR產(chǎn)物的序列，并根據(jù)該序列，同時(shí)參考Psy-Bla的序列，設(shè)計(jì)引物P7B4，PCR擴(kuò)增晉麥61的基因組DNA，獲得了Psy-Blc基因的中游序列。但該基因的上游序列以此方法未能獲得。將Psy-Blc的基因序列與Psy-Bla的基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定其內(nèi)含子區(qū)與終止密碼子。拼接晉麥61的cDNA序列，進(jìn)行翻譯獲得Psy-Blc蛋白序列。
Psy-Blc蛋白的序列如序列表的序列5所示，Psy-Blc蛋白的編碼基因序列如序列表的序列6所示。
4、Psy-Bld蛋白及其編碼基因的獲得 應(yīng)用引物P7B1擴(kuò)增寧98084小麥的基因組DNA，分析PCR產(chǎn)物的序列，并根據(jù)該序列，同時(shí)參考Psy-Bla的序列，設(shè)計(jì)引物P7B5和P7B6，PCR擴(kuò)增寧98084小麥的基因組DNA，獲得了Psy-Bld基因的全長序列。將Psy-Bld的基因序列與Psy-Bla的基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定其內(nèi)含子區(qū)與終止密碼子。拼接寧98084小麥的cDNA序列，進(jìn)行翻譯獲得Psy-Bld蛋白序列。
Psy-Bld蛋白的序列如序列表的序列7所示，Psy-Bld蛋白的編碼基因序列如序列表的序列8所示。
來源于普通小麥的4個(gè)黃色素含量性狀相關(guān)蛋白(Psy-Bla、Psy-Blb、Psy-Blc、Psy-Bld)編碼基因等位基因的序列比對(duì)如圖1所示。
實(shí)施例2、小麥黃色素含量與基因型的相關(guān)性分析 一、功能標(biāo)記引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)序列表中的序列2、序列4、序列6和序列8設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1和P2(序列表中的序列9和序列表中的序列10)如下 P1(上游引物)5’-GCCACAACTTGAATGTGAAAC-3’， P2(下游引物)5’-ACTTCTTCCATTTGAACCCC-3’。
用引物P1和P2，可以擴(kuò)增序列表中序列2所示核苷酸中151bp的核苷酸序列；可以擴(kuò)增序列表中序列4所示核苷酸中156bp的核苷酸序列；不能擴(kuò)增出序列表中序列6和序列8所示核苷酸中151bp或156bp的核苷酸序列。
根據(jù)序列表中的序列6和序列8設(shè)計(jì)一對(duì)引物P3和P4(序列表中的序列11和序列表中的序列12)如下 P3(上游引物)5’-GCCACCCACTGATTACCACTA-3’， P4(下游引物)5’-CCAAGGTGAGGGTCTTCAAC-3’。
用引物P3和P4，可以擴(kuò)增出序列表中序列6所示核苷酸中428bp的核苷酸序列；不能擴(kuò)增出序列表中序列8所示核苷酸中428bp的核苷酸序列。
二、小麥黃色素含量與所述基因的相關(guān)性分析 取217份來源于中國國家種質(zhì)資源庫的小麥品種，見表1。每份小麥品種取300粒種子，其中297粒檢測黃色素含量，3粒提取基因組DNA。
1、小麥籽粒黃色素含量的檢測 檢測黃色素含量的具體方法如下 將待測的籽粒用旋風(fēng)磨磨成面粉；稱取3.000g樣品放入約30ml具塞試管或試劑瓶內(nèi)，加入15.0ml水飽和正丁醇(100ml正丁醇加20ml蒸餾水，反復(fù)混勻，取飽和液部分)，蓋緊塞子，放在混旋器上混合，使樣品粉末充分濕潤；把樣品瓶放在往復(fù)振蕩機(jī)上振蕩1h，然后靜置10min；將上部液體倒入離心管內(nèi)，在4000rpm的離心機(jī)上離心約10min至液體清亮為止；每一批次均以中優(yōu)9507面粉作為對(duì)照，取1.0cm比色皿，用分光光度計(jì)在436.5nm下測定離心后上清液的吸光度A；最終的黃色素含量(mg/kg)數(shù)值即為30.1A。
217份樣本黃色素含量的檢測結(jié)果見表3。
2、小麥基因型的測定 按常規(guī)方法提取小麥的基因組DNA，然后進(jìn)行以下步驟 1)第一次基因分型 ①以小麥基因組DNA為模板，P1和P2為引物，進(jìn)行PCR。
PCR反應(yīng)體系為模板DNA 50ng，Taq酶1U(北京天根生化科技公司)，上、下游引物(5μmol·L-1)各1μl，dNTP(25μmol·L-1)0.2μl，10×PCR緩沖液2μl，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。
PCR反應(yīng)程序?yàn)槭紫?5℃、5min；然后95℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃、5min。
擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。
②6％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 取20μl擴(kuò)增產(chǎn)物，加入4μl變性載樣指示劑(98％去離子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.1％溴酚藍(lán)和0.1％二甲苯青)，94℃變性5min后，立即放入冰水混合物中冷卻5-10min。取6μl變性的擴(kuò)增樣品進(jìn)行電泳分離，銀染顯色。
圖2為15個(gè)樣本的第一次分型鑒定結(jié)果。泳道M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道01至15分別為以下品種的小麥京冬8、冀麥38、寧98084、云麥42、皖麥38、煙農(nóng)18、陜150、寧99415-8、山農(nóng)1355、豫麥49號(hào)、鄭州992、河農(nóng)2552、冀3475、晉麥50、中優(yōu)9701。
2)第二次基因分型 ①將步驟1)中沒有得到擴(kuò)增條帶的樣本，以小麥基因組DNA為模板，P3和P4為引物，重新進(jìn)行PCR。
PCR反應(yīng)體系為模板DNA 50ng，Taq酶1U(北京天根生化科技公司)，上、下游引物(5μmol·L-1)各1μl，dNTP(25μmol·L-1)0.2μl，10×PCR緩沖液2μl，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20μl。
PCR反應(yīng)程序?yàn)槭紫?5℃、5min；然后95℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃、5min。
擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。
②將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
圖3為15個(gè)樣本的第二次分型鑒定結(jié)果。泳道M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)；泳道01至15分別為以下品種的小麥京冬8、冀麥38、寧98084、云麥42、皖麥38、煙農(nóng)18、陜150、寧99415-8、山農(nóng)1355、豫麥49號(hào)、鄭州992、河農(nóng)2552、冀3475、晉麥50、中優(yōu)9701。
217個(gè)份樣本的基因型測定結(jié)果見表3。
表3小麥的基因型和黃色素含量檢測結(jié)果 注“-”表示無擴(kuò)增產(chǎn)物。
3、基因分型檢測結(jié)果驗(yàn)證 對(duì)217個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，151bp PCR產(chǎn)物是序列2(Psy-Bla基因)的自5′末端第2566-2716位脫氧核糖核苷酸，156bp PCR產(chǎn)物是序列4(Psy-Blb基因)的自5′末端第2566-2721位脫氧核糖核苷酸，428bp PCR產(chǎn)物是序列6(Psy-Blc基因)的自5′末端第2157-2584位脫氧核糖核苷酸，與電泳分型鑒定的結(jié)果一致。
217個(gè)樣本中，86個(gè)樣本基因型為Psy-Bla；95個(gè)樣本基因型為Psy-Blb；36個(gè)樣本基因型為Psy-Blc；2個(gè)樣本基因型為Psy-Bld。對(duì)不同基因型小麥的黃色素含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)有顯著差異，見表4。
表4小麥等位變異與籽粒黃色素含量關(guān)系的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果
通過小麥黃色素含量與所述基因的相關(guān)性分析，得出以下結(jié)論 以小麥基因組DNA為模板，先用引物P1和P2進(jìn)行擴(kuò)增，如果擴(kuò)增出151bp的條帶，說明基因型為Psy-Bla，具有較低黃色素含量；如果擴(kuò)增出156bp的條帶，說明基因型為Psy-Blb，具有低黃色素含量；對(duì)沒有擴(kuò)增條帶的樣本，用引物P3和P4進(jìn)行擴(kuò)增，如果擴(kuò)增出428bp的條帶，說明基因型為Psy-Blc，具有高的黃色素含量。
序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
<120>一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
<130>CGGNARY81358
<160>12
<210>1
<211>421
<212>PRT
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>1
Met Ala Thr Thr Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ser Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Gly Ala Ala Arg Asp Gly Val Gln Cys Ser Arg Met Leu Pro Arg
20 25 30
Arg Arg Gln Gln Arg Pro Arg Trp Val Leu Cys Ser Leu Lys Tyr Gly
35 40 45
Cys Leu Gly Val Gly Glu Pro Gly Glu Ala Gly Thr Arg Ser Ala Ala
50 55 60
Ser Pro Val Tyr Ser Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Glu Ala Ala
65 70 75 80
Val Ala Val Val Ser Ser Glu Gln Lys Val Tyr Asp Val Val Leu Lys
85 90 95
Gln Ala Ala Leu Leu Lys Arg Gln Leu Arg Pro Gln Gln Ala Ala Pro
100 105 110
Pro Ala Val Ala Arg Glu Leu Asp Ala Pro Arg Gly Gly Leu Gly Lys
115 120125
Ala Tyr Ala Arg Cys Gly Glu Ile Cys Glu Glu Tyr Ala Lys Thr Phe
130 135 140
Tyr Leu Gly Thr Leu Leu Met Thr Glu Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro
165 170 175
Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Arg Arg
180 185 190
Leu Glu Asp Leu Phe Ala Gly Arg Pro Tyr Asp Met Leu Asp Ala Ala
195 200 205
Leu Ser Asp Thr Ile Thr Lys Phe Pro Ile Asp Ile Gln Pro Phe Lys
210 215 220
Asp Met Ile Asp Gly Met Arg Thr Asp Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Lys
225 230 235 240
Asn Phe Asp Glu Leu Tyr Met Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val
245 250 255
Gly Leu Met Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala
260 265 270
Thr Ala Glu Ser Val Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala Asn
275 280 285
Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly
290 295 300
Arg Ile Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Glu Ala Gly Leu Ser Asp
305 310 315 320
Glu Asp Ile Val Lys Gly Val Val Thr Asp Lys Trp Arg Lys Phe Met
325 330 335
Lys Arg Gln Ile Lys Arg Ala Arg Met Phe Phe Glu Glu Ala Glu Arg
340 345 350
Gly Val Thr Glu Leu Arg Lys Glu Ser Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser
355 360 365
Leu Leu Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr
370 375 380
Asn Asn Phe Thr Lys Arg Ala Tyr Val Gly Lys Ala Lys Lys Val Leu
385 390 395 400
Ala Leu Pro Val Ala Tyr Gly Lys Ser Leu Leu Leu Pro Ser Ser Leu
405 410 415
Arg Asn Asn Gln Thr
420
<210>2
<211>2935
<212>DNA
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>2
atggccacca ccgtcacgct gctgctcggg gcagcctcgt cccccggtga tggcgccgcg 60
cgggacggcg tccagtgctc ccgcatgttg cctaggagga ggcagcagag gccgcggtgg 120
gtgctctgct cgctcaagta cggctgcctc ggcgtcggcg agccggggga ggcgggaacc 180
cggagcgcgg cgtcgccggt ctactccagc ctcaccgtca gccccggcgg cgaggcggcc 240
gtcgccgtcg tctcctcgga gcagaaggtg tacgacgtgg tgctgaagca ggcggcattg 300
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tgtctagttt ataccccccc ccctcccact tggtataatc attgaaaaaa aatttagggg 2700
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<210>3
<211>421
<212>PRT
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>3
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1 5 10 15
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20 25 30
Arg Arg Gln Gln Arg Pro Arg Trp Val Leu Cys Ser Leu Lys Tyr Gly
35 40 45
Cys Leu Gly Val Gly Glu Pro Gly Glu Ala Gly Thr Arg Ser Ala Ala
50 55 60
Ser Pro Val Tyr Ser Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Glu Ala Ala
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Val Ala Val Val Ser Ser Glu Gln Lys Val Tyr Asp Val Val Leu Lys
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Pro Ala Val Ala Arg Glu Leu Asp Ala Pro Arg Gly Gly Leu Gly Lys
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Tyr Leu Gly Thr Leu Leu Met Thr Glu Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp
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Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro
165 170 175
Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Arg Arg
180 185 190
Leu Glu Asp Leu Phe Ala Gly Arg Pro Tyr Asp Met Leu Asp Ala Ala
195 200 205
Leu Ser Asp Thr Ile Thr Lys Phe Pro Ile Asp Ile Gln Pro Phe Lys
210 215 220
Asp Met Ile Asp Gly Met Arg Thr Asp Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Lys
225 230 235 240
Asn Phe Asp Glu Leu Tyr Met Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val
245 250 255
Gly Leu Met Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala
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Thr Ala Glu Ser Val Tyr Gly Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala Asn
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Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly
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Ala Leu Pro Val Ala Tyr Gly Lys Ser Leu Leu Leu Pro Ser Ser Leu
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50 55 60
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65 70 75 80
Ile Asp Gly Met Arg Thr Asp Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Lys Asn Phe
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Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr Asn Asn
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<210>6
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<212>DNA
<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
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Met Ala Thr Thr Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ser Ser Pro Gly
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Pro Gly Ala Gly Leu Ala Ala Gly Asp Gly Thr Ala Arg Asp Gly Val
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Lys Val Tyr Asp Thr Val Val Lys Gln Ala Ala Leu Leu Lys Arg Gln
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Leu Arg Pro Gln Gln Gln Gln Ala Ala Pro Pro Ala Val Ala Arg Glu
115 120 125
Leu Asp Ala Pro Arg Gly Gly Leu Gly Glu Ala Tyr Ala Arg Cys Gly
130 135 140
Glu Ile Cys Glu Glu Tyr Ala Lys Thr Phe Tyr Leu Gly Thr Leu Leu
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Met Thr Glu Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp Ala Ile Tyr Val Trp Cys
165 170 175
Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro Asn Ala Ser His Ile Thr
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Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Arg Arg Leu Glu Asp Leu Phe Ala
195 200 205
Gly Arg Pro Tyr Asp Met Leu Asp Ala Ala Leu Ser Asp Thr Ile Thr
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Lys Phe Pro Ile Asp Ile Gln Pro Phe Lys Asp Met Ile Asp Gly Met
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Arg Thr Asp Leu Lys Lys Ala Arg Tyr Lys Asn Phe Asp Glu Leu Tyr
245 250 255
Met Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val Gly Leu Met Ser Val Pro
260 265 270
Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala Thr Ala Glu Ser Val Tyr
275 280 285
Gly Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile Leu
290 295 300
Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Pro Gln
305 310 315 320
Asp Glu Leu Ala Glu Ala Gly Leu Ser Asp Glu Asp Ile Phe Lys Gly
325 330 335
Val Val Thr Asp Lys Trp Arg Lys Phe Met Lys Arg Gln Ile Lys Arg
340 345 350
Ala Arg Met Phe Phe Glu Glu Ala Glu Arg Gly Val Thr Glu Leu Arg
355 360 365
Lys Glu Ser Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Arg Gln
370 375 380
Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr Asn Asn Phe Thr Lys Arg
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Ala Tyr Val Gly Lys Ala Lys Lys Val Leu Ala Leu Pro Val Ala Tyr
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<213>小麥屬普通小麥(Triticum aestivum L.)
<400>8
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agttccccat agatattcag gtaccagctc gccggtgcat aattgttcag tccacattgt1440
atgattctgg tagaagaaca gagtggtggt ggatattccc tgtcagcatc agattccccc1500
tagacctcac aatctcagtg caagatgacc ggaaagtcga tgattggtca aaattgtttc1560
gtttgtcggc cttttattgg tctctgatgc tgttattgag ctgtatgaac ttttcacaca1620
ttgtagtggg ggcttatcca gttgactaga cgtatagtgg gaaactggga atcatctggt1680
caaagatatg tttaatcaaa ctagggaaat tatagaaaag cttttctata ataaatagtc1740
atgaacatag caagaacaaa aaagaacttg gcaacgatct agaggtataa caggaatcag1800
gggaagtcta aggctctgtt tggtttatcg tttccatttc aaatacccct gtataactta1860
cagacctccg cccgtcgttt tgctttccgg ccggaaatag ctcttggtca gtaagttaca1920
cccgtaaata aattacacct gtattcaaat acatccatac caagcgcggc ctaattgatt1980
tcatacctga aatagcatta tgagaatgtt cttggttctg gttagtacta ttacttgaaa2040
gttgaaacta tattctttat gttctaaagt gaccaactct tcatacatgt atcgttagat2100
tcatcataag atgttgtttc atactccctc cgtctcaaaa ttcttgtctt agatttgtct2160
agatacggat gtatttaaca ctaaaacata actagattca tcaaaattct tgtcttagat2220
ttgtctagat acggatgtat ttaacactaa aacataactg gatacatccg tatttagaca2280
aatttaaggc aagaattttg ggacggaggg agtatattca atatttgtta ttgtggatac2340
aaaatttttt tatataaatt tggtcaaagt ttgtaaagtt tgactttcaa aaaaaattat2400
aagcactaca ttatggaacg gagggagtat attctaaaat gacagactct tcatacttat2460
gccagccctt caaggacatg atcgacggga tgcggacaga cctcaagaag gcaagataca2520
agaacttcga cgagctctac atgtactgct actacgttgc aggtacggtg gggctgatga2580
gcgtcccggt gatgggcatt gcgcccgagt ccaaggcgac ggccgagagc gtctacggcg2640
ccgctctggc tctcgggctc gcgaaccagc tcaccaacat actcagggat gttggagaag2700
agtaagccac ccactgatta ccactaaaat gcaacggttt tcccttcctc taaagaacag2760
gcatgatatg agtattaaaa tagcactgtc tgaatttttg tgtgtttgca atatttcttt2820
tccagtgcgc gaagaggaag gatatatcta ccacaagacg agctcgcgga ggcggggctc2880
tccgacgaag acatcttcaa aggagtcgtc accgacaagt ggaggaaatt catgaagagg2940
cagatcaaga gggcgaggat gttcttcgag gaggcggagc gaggggtgac cgagcttagg3000
aaggagagcc ggtggccggt aagtgaccta acaccacaac ttcaaagcca aacagaacta3060
catacagagt tctcatcggc gttaattatc agtaacaacg aaaggagcta tgtgtagttc3120
aagaccagca aaaaagaaac ctatgtgtat ttcaaggggg gccgctgccc ctcaccttgg3180
tataatcatt gaagaataaa tattaggggc ttaaatagaa gaaagtatca cttgagtgat3240
aatatggttt tgcattgcaa ttgcaggttt gggcctctct gttgctatac cggcagatcc3300
tcgacgagat cgaagcgaac gactacaaca acttcaccaa gagggcctat gttgggaagg3360
cgaagaaggt gctggcgctc cctgtcgcgt acgggagatc gctgctctta ccgtattcac3420
tgagaaataa ccagacctag3440
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gccacaactt gaatgtgaaa c21
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
acttcttcca tttgaacccc 20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
gccacccact gattaccact a21
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ccaaggtgag ggtcttcaac 20
權(quán)利要求
1、一種檢測小麥黃色素含量性狀的標(biāo)記引物A，是由序列表中序列9的核苷酸序列和序列10的核苷酸序列組成的一對(duì)引物。
2、一種檢測小麥黃色素含量性狀的標(biāo)記引物B，是由序列表中序列11的核苷酸序列和序列12的核苷酸序列組成的一對(duì)引物。
3、一種檢測小麥黃色素含量性狀的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的標(biāo)記引物A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有156bp的條帶或151bp的條帶；如PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中無156bp的條帶和151bp的條帶，再以所述待測小麥基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2所述的標(biāo)記引物B進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有428bp的條帶。
4、如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中，如所述標(biāo)記引物A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有156bp的條帶或151bp的條帶，所述待測小麥為候選低黃色素含量小麥；如所述標(biāo)記引物Λ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中無156bp的條帶和151bp的條帶，而所述標(biāo)記引物B的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有428bp的條帶，所述待測小麥為候選高黃色素含量小麥。
5、如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于用所述標(biāo)記引物A進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物通過6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測；用所述標(biāo)記引物B進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。
6、如權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述小麥為普通小麥。
7、一種蛋白，是如下1)或2)或3)或4)或5)的蛋白質(zhì)
(1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(3)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(4)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(5)將序列1、3、5或7所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與黃色素含量性狀相關(guān)的由序列1、3、5或7衍生的蛋白質(zhì)。
8、權(quán)利要求7所述蛋白的編碼基因。
9、如權(quán)利要求8所述的基因，其特征在于所述蛋白編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)或4)或5)或6)的DNA分子
1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
2)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；
3)其核苷酸序列是序列表中序列6所示的DNA分子；
4)其核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子；
5)在嚴(yán)格條件下與1)、2)、3)或4)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
6)與1)、2)、3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
10、權(quán)利要求3-5中任一所述方法在培育低黃色素含量小麥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的小麥黃色素含量性狀相關(guān)蛋白是由序列表中序列1或3或5或7以及它們經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與黃色素含量性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了該蛋白的編碼基因和基于小麥基因等位變異的特異性功能標(biāo)記。利用本發(fā)明的標(biāo)記，通過兩次基因分型，可判斷小麥攜帶的黃色素含量相關(guān)基因。應(yīng)用本發(fā)明，可在發(fā)育早期篩選小麥品種，從而優(yōu)化雜交組合，加快育種速度，降低育種成本。本發(fā)明提供的檢測小麥黃色素含量性狀的方法具有操作簡單、穩(wěn)定可靠、成本低廉、周期短的優(yōu)點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，對(duì)快速改良小麥面制品顏色具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101289695SQ20081011325
公開日2008年10月22日 申請(qǐng)日期2008年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日
發(fā)明者夏先春, 何中虎, 何心堯 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所