專利名稱：一種生產(chǎn)灰樹花胞內(nèi)多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用天然真菌通過發(fā)酵制備一種具有抗艾滋病病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能的可食用的藥用糖綴合物，具體的說是通過灰樹花菌種的液體深層發(fā)酵，將發(fā)酵獲得的灰樹花菌絲體通過細(xì)胞破碎，脫蛋白，脫色，脫鹽，柱純化等步驟獲得單一組分的灰樹花胞內(nèi)多糖。所獲的灰樹花胞內(nèi)多糖可以直接制備成藥用針劑或食藥用口服制劑，具有抗艾滋病病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能。
背景技術(shù)：
灰樹花(Grifola frondosa)又名栗子蘑、蓮花菌、貝葉多孔菌、千佛菌、葉奇果菌、云蕈等，日本人稱為マィタケ(舞茸，Maitake)。在分類學(xué)上灰樹花隸屬于擔(dān)子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，多孔菌科，樹花菌屬，是一種天然的珍稀食藥兩用真菌。
灰樹花具有似野雞般的鮮美口味和質(zhì)感[13]，在日本倍受喜愛，供不應(yīng)求。封建時期，灰樹花售價高至重量與白銀等值，即便在近代，甚至僅于采菇者遺囑中才得以透露野生菇生長數(shù)年的神秘地點。其所含的生物活性物質(zhì)——灰樹花多糖具有生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)的功能，是一類理想的免疫調(diào)節(jié)劑，具有“菇類免疫之王”的美稱。它具有明顯的抗腫瘤、抗HIV病毒、改善免疫系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)血糖、血脂及膽固醇水平、降血壓等作用，對防止癌細(xì)胞的生成和轉(zhuǎn)移、愛滋病、高血壓、肥胖癥、糖尿病以及免疫系統(tǒng)功能紊亂都有一定的療效，且無任何毒副作用。此外，國外有學(xué)者認(rèn)為灰樹花多糖是所有真菌生物活性物質(zhì)中抗腫瘤活性最強(qiáng)的，而且口服有效。
灰樹花的生產(chǎn)方式包括液體發(fā)酵和固體發(fā)酵，傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵可獲得灰樹花子實體，但具有菌絲萌發(fā)慢，發(fā)酵周期長的不足。用液體培養(yǎng)法具有以下優(yōu)點(1)與傳統(tǒng)的固體栽培相比，大大縮短了生產(chǎn)周期；(2)采用發(fā)酵罐可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，大大提高產(chǎn)量；(3)節(jié)省勞動強(qiáng)度，降低生產(chǎn)成本；(4)產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
灰樹花多糖可以從固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的菌絲體和子實體中提取；也可從液體深層發(fā)酵中提取，其中發(fā)酵液的菌絲體中提取的是胞內(nèi)多糖，從剩余的發(fā)酵液中提取的是胞外多糖。由于培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式等條件的不同，灰樹花多糖在其分子量、結(jié)構(gòu)等方面也會產(chǎn)生差異。
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)的病原體是人類免疫缺陷病毒(human Immunodeficiency virus，HIV)，臨床表現(xiàn)主要是條件致病性感染及(或)發(fā)生惡性腫瘤。艾滋病自發(fā)現(xiàn)以來，傳播迅速，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，AIDS流行最早的許多非洲國家預(yù)計到2010年時，其平均期望壽命將因AIDS減壽30年左右。更有甚者，全球AIDS流行的勢頭還在迅猛上升，尤其是南非、拉丁美洲和亞洲。目前尚無有效的治療方法，病死率極高。
目前國內(nèi)對灰樹花多糖的研究主要集中在其抗腫瘤方面，關(guān)于它的抗艾滋病病毒的功效尚未見報道；而且主要是從灰樹花子實體中提取，得率低且得到的往往是包含一系列分子量、結(jié)構(gòu)不同的灰樹花胞內(nèi)多糖的組合物。
在國外，研究的較多是日本的Nanba教授，他將獲得的灰樹花多糖進(jìn)行了人體試驗，80％左右的病人自我感覺良好，但艾滋病病毒未見減少；在對灰樹花胞內(nèi)多糖硫酸化后進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)其抗艾滋病病毒的效果有了較大的提高但毒性也大大增加，因此還不能很好的解決問題。此外他所獲得的灰樹花多糖同樣是包含一系列分子量、結(jié)構(gòu)不同的灰樹花胞內(nèi)多糖的組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服目前國內(nèi)外研究中得不足，確立一種獲得一種單一組分的灰樹花胞內(nèi)多糖的方法，使其可以直接制備成具有抗艾滋病病毒、抗腫瘤、改善免疫系統(tǒng)等功能的藥用針劑或食藥用口服制劑。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的步驟如下第一步灰樹花菌種液體深層發(fā)酵，其培養(yǎng)基組成為葡萄糖1～2％、玉米粉0.5～1.5％、棉子殼0.25～0.75％、麩皮0.5～1％、磷酸二氫鉀0.05～0.4％、磷酸鎂0.05～0.4％、氯化鈣0.02～0.3％，在121℃下滅菌30分鐘；液體深層發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度22～29℃，通風(fēng)比0.2～1.0vvm，攪拌速度40～120轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵培養(yǎng)時間120～168h，接種量為10％(體積比)。
第二步將發(fā)酵液離心后獲得的菌絲體進(jìn)行細(xì)胞破碎和熱水浸提。細(xì)胞破碎可以采用組織搗碎法、超聲波法、高壓破碎法，細(xì)胞破碎的目的是為了提高熱水浸提胞內(nèi)多糖的效果；熱水浸提胞內(nèi)多糖的條件為提取溫度為88～95℃，提取時間為2.5～6小時，菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶3～1∶6。
第三步酒精分步沉淀法獲得粗多糖粉，即在熱水浸提液中加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到22～38％，將該液體離心后取上清液。在上清液中再加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到55～75％，將該液體離心10分鐘后取沉淀80℃下烘干，所得即為粗多糖粉。將粗多糖粉用超純水溶解(溶液中粗多糖的質(zhì)量百分比為0.5～2.0％)后即可以進(jìn)行脫蛋白、脫色、脫鹽、柱純化等步驟。
第四步脫蛋白。脫蛋白可以采用三氯乙酸脫蛋白法，即在熱水浸提液中直接加入三氯乙酸，使液體中三氯乙酸的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到5～25％。將該液體離心后即可以達(dá)到脫蛋白的目的，所獲的上清液即為粗多糖液。也可以采用Sevag法脫蛋白。Sevag法采用的步驟為將粗多糖液與氯仿-正丁醇混合液(按體積比，氯仿∶正丁醇＝4∶1混合)按體積比3∶1混合，置于具塞試管中，充分振搖30min后，在4000轉(zhuǎn)/分的條件下離心1min，然后將水相與氯仿相分開，取水相；再重復(fù)上述步驟兩次。
第五步脫色。脫色可以采用雙氧水氧化脫色，在pH8條件下滴加20％雙氧水溶液至淡黃色，40℃下保溫1小時。
第六步脫鹽。脫鹽所采用的方法是將已經(jīng)脫蛋白和脫色的粗多糖溶液置于截留分子量為10000～12000的透析袋內(nèi)，以超純水透析至離子強(qiáng)度不變。
第七步柱純化。柱純化所采用的方法是采用16/10 DEAE層析柱，以pH6.0～9.0的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以1～3ml/min流速洗脫，5ml/管收集，經(jīng)苯酚——硫酸法逐管檢測每管多糖含量，F(xiàn)olin-酚法逐管檢測蛋白含量，以測定中多糖和蛋白含量第一次同時達(dá)到高峰時的那一管以它之前和之后各三管的樣品為本發(fā)明所需的胞內(nèi)多糖。將這些樣品再次脫鹽后即得到純的灰樹花胞內(nèi)多糖。
本發(fā)明所述的第三、四、五可以全部實施，也可以跳過其中幾步實施。一般說來如果不實施第三步，那么第四、五步一般要實施；如果實施第三步，那么第四、五步一般不要實施。
在第二步之后，第三步之前，可以根據(jù)實施情況將熱浸提液或粗多糖液進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s，濃縮過程在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行，濃縮的溫度不超過60℃，濃縮倍數(shù)可以根據(jù)具體情況確定，但以不超過5倍為宜。
本發(fā)明所述的灰樹花菌種購自河南省清豐縣食用菌技術(shù)推廣中心。
本發(fā)明所述的DEAE-纖維素為離子交換層析中常用的一種支持介質(zhì)。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)/分為轉(zhuǎn)速單位，即每分鐘攪拌的轉(zhuǎn)數(shù)；vvm為通風(fēng)單位，即每分鐘單位體積的發(fā)酵液通入空氣的體積數(shù)；M為濃度單位，表示摩爾每升；min為時間單位，表示分鐘。
本發(fā)明所述的離心是在每分鐘3000轉(zhuǎn)條件下進(jìn)行的。
本發(fā)明如無特殊說明均為質(zhì)量百分比。
本發(fā)明所獲得的灰樹花胞內(nèi)多糖為組分單一的純的糖綴合物，其中蛋白質(zhì)含量為2％，單糖組成為鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，各組成單糖主要以β鍵相連接，分子量在200萬以上；存在O-糖苷鍵的糖肽連接方式，氨基酸組成主要以絲氨基、甘氨酸和賴氨酸為主。
本發(fā)明的特征在于通過灰樹花菌種的液體深層發(fā)酵，將發(fā)酵獲得的灰樹花菌絲體通過細(xì)胞破碎，熱水浸提，脫蛋白或經(jīng)過酒精分步沉淀后再脫蛋白，脫色，脫鹽，柱純化等步驟獲得單一組分的灰樹花胞內(nèi)多糖。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1)由于采用液體生層發(fā)酵，它具有灰樹花液體培養(yǎng)的一切優(yōu)點；2)本發(fā)明所獲得的灰樹花胞內(nèi)多糖具有明顯的抗HIV的功效，且基本無毒副作用；3)本發(fā)明所獲得的灰樹花胞內(nèi)多糖為單一組分，可以直接制備成藥用針劑或口服藥。


圖1為GFP-1的Supdex200凝膠過濾圖譜。
圖2為GFP-1Superdex200凝膠過濾的多糖檢測圖譜。
圖3為GFP-1的高壓液相圖譜。
①GFP-1的Superdex200凝膠過濾層析胞內(nèi)多糖經(jīng)DEAE-纖維素層析分離所得的GFP-1組分經(jīng)Superdex200 HR10/13柱凝膠過濾層析，于215nm，280nm波長下在線檢測，苯酚-硫酸法逐管檢測多糖含量，F(xiàn)olin-酚法逐管檢測蛋白含量。
由圖1可見，GFP-1經(jīng)Superdex200 HR10/13凝膠過濾層析，于215nm，280nm波長下在線檢測，得到215nm，280nm下的重疊對稱單峰。
由圖2可見，由圖11所得的重疊單峰亦是多糖，蛋白的重疊單一對稱洗脫峰。
②GFP-1的高壓液相層析由圖3可見，GFP-1經(jīng)HPLC層析，示差折光檢測顯示層析結(jié)果為一尖銳對稱單峰。
具體實施例方式
下面對具體實施例進(jìn)行描述，在實施例的描述過程中如無特殊說明均為質(zhì)量百分比；接種量均為10％(體積比)；離心均在3000轉(zhuǎn)每分鐘條件下進(jìn)行。濃縮過程均在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中進(jìn)行，濃縮的溫度不超過60℃。本文所述Sevag法脫蛋白的具體步驟為將熱水浸提液或粗多糖液與氯仿-正丁醇混合液按體積比3∶1混合，置于具塞試管中，充分振搖30分鐘后，在4000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心1分鐘，然后將水相與氯仿相分開，取水相；再重復(fù)上述步驟兩次，其中，氯仿-正丁醇混合液中兩者的體積比為氯仿∶正丁醇＝4∶1。脫色采用雙氧水氧化脫色，則操作為在pH8條件下滴加20％雙氧水溶液至淡黃色，40℃下保溫1小時。脫鹽均采用透析法，即粗多糖溶液置于截留分子量為10000～12000的透析袋內(nèi)，以超純水透析至離子強(qiáng)度不變。柱純化的條件為采用16/10 DEAE-纖維素層析柱，以磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以一定流速洗脫，5ml/管部分收集，經(jīng)苯酚——硫酸法逐管檢測每管多糖含量，F(xiàn)olin-酚法逐管檢測蛋白含量，以測定中多糖和蛋白含量第一次同時達(dá)到高峰時的那一管以它之前和之后各三管的樣品為本發(fā)明所需收集的胞內(nèi)多糖，并將這些收集的胞內(nèi)多糖溶液再次脫鹽后進(jìn)行冷凍干燥；多糖得率為多糖質(zhì)量與相應(yīng)發(fā)酵液的體積比。
實施例1培養(yǎng)基組成為葡萄糖2％、玉米粉1.5％、棉子殼0.75％、麩皮1％、磷酸二氫鉀0.4％、磷酸鎂0.4％、氯化鈣0.3％，在121℃下滅菌30分鐘；發(fā)酵溫度25℃，通風(fēng)比0.65vvm，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)120小時后結(jié)束發(fā)酵；將發(fā)酵液離心15分鐘，收集菌絲體；按菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶5的比例加入水后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并在90℃條件下熱水浸提6小時；冷卻至室溫后離心15分鐘取上清液，濃縮5倍，向其中加入三氯乙酸，使液體中三氯乙酸的濃度達(dá)到10％，靜置后離心20分鐘，所得上清液即為粗多糖液；將粗多糖液脫色、脫鹽、在以pH6.0的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以1ml/min流速洗脫條件下柱純化，獲得純的灰樹花胞內(nèi)多糖GFP-1，提取得率為0.24‰。
實施例2培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.2％、玉米粉1.0％、棉子殼0.5％、麩皮0.5％、磷酸二氫鉀0.2％、磷酸鎂0.1％、氯化鈣0.1％，在121℃下滅菌30分鐘；發(fā)酵溫度25℃，通風(fēng)比1.0vvm，攪拌速度40轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)168小時后結(jié)束發(fā)酵；將發(fā)酵液離心15分鐘，收集菌絲體；按菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶5的比例加入水后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并在92℃條件下熱水浸提6小時；冷卻至室溫后離心15分鐘取上清液，濃縮3倍，向其中加入三氯乙酸，使液體中三氯乙酸的濃度達(dá)到15％，靜置后離心20分鐘，所得上清液即為粗多糖液；將粗多糖液脫色、脫鹽、在以pH9.0的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以3ml/min流速洗脫條件下柱純化，后獲得純的灰樹花胞內(nèi)多糖GFP-1，提取得率為0.28‰。
實施例3培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.8％、玉米粉1.0％、棉子殼0.5％、麩皮0.8％、磷酸二氫鉀0.2％、磷酸鎂0.2％、氯化鈣0.05％，在121℃下滅菌30分鐘；發(fā)酵溫度29℃，通風(fēng)比0.2vvm，攪拌速度120轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)132小時后結(jié)束發(fā)酵；將發(fā)酵液離心15分鐘，收集菌絲體；按菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶3的比例加入水后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并在95℃條件下熱水浸提2.5小時；冷卻至室溫后離心15分鐘取上清液，向其中加入三氯乙酸，使液體中三氯乙酸的濃度達(dá)到25％，靜置后離心20分鐘，所得上清液即為粗多糖液；將粗多糖液脫色、脫鹽、在以pH6.0的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以3ml/min流速洗脫條件下柱純化，后獲得純的灰樹花胞內(nèi)多糖GFP-1，提取得率為0.24‰。
實施例4培養(yǎng)基組成為葡萄糖1％、玉米粉0.5％、棉子殼0.25％、麩皮0.5％、磷酸二氫鉀0.05％、磷酸鎂0.05％、氯化鈣0.02％，在121℃下滅菌30分鐘；發(fā)酵溫度25℃，通風(fēng)比0.40vvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)120小時后結(jié)束發(fā)酵；將發(fā)酵液離心15分鐘，收集菌絲體；按菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶5的比例加入水后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并在90℃條件下熱水浸提6小時；冷卻至室溫后離心15分鐘取上清液，向其中加入三氯乙酸，使液體中三氯乙酸的濃度達(dá)到5％，靜置后離心20分鐘，所得上清液即為粗多糖液；將粗多糖液脫色、脫鹽、在以pH9.0的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以1ml/min流速洗脫條件下柱純化，后獲得純的灰樹花胞內(nèi)多糖GFP-1，提取得率為0.26‰。
實施例5培養(yǎng)基組成為葡萄糖1％、玉米粉1.5％、棉子殼0.25％、麩皮0.75％、磷酸二氫鉀0.3％、磷酸鎂0.1％、氯化鈣0.1％，在121℃下滅菌30分鐘；發(fā)酵溫度22℃，通風(fēng)比0.65vvm，攪拌速度80轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)168小時后結(jié)束發(fā)酵；將發(fā)酵液離心15分鐘，收集菌絲體；按菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶6的比例加入水后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并在92.5℃條件下熱水浸提4.5小時；冷卻至室溫后離心15分鐘取上清液，濃縮5倍，加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到30％，將該液體離心10分鐘后取上清液。在上清液中再加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到60％，將該液體離心10分鐘后取沉淀80℃下烘干，所得即為粗多糖粉。將粗多糖粉用超純水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的質(zhì)量百分比為0.5％。將該粗多糖液脫鹽，在以pH6.8的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以1ml/min流速洗脫條件下柱純化，后獲得純的灰樹花胞內(nèi)多糖GFP-1，提取得率為0.25‰。
實施例6培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.2％、玉米粉1.0％、棉子殼0.5％、麩皮0.5％、磷酸二氫鉀0.2％、磷酸鎂0.1％、氯化鈣0.1％，在121℃下滅菌30分鐘；發(fā)酵溫度25℃，通風(fēng)比0.45vvm，攪拌速度120轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)120小時后結(jié)束發(fā)酵；將發(fā)酵液離心15分鐘，收集菌絲體；按菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶4的比例加入水后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并在88℃條件下熱水浸提3.5小時；冷卻至室溫后離心15分鐘取上清液，濃縮2倍，加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到22％，將該液體離心10分鐘后取上清液。在上清液中再加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到55％，將該液體離心10分鐘后取沉淀80℃下烘干，所得即為粗多糖粉。將粗多糖粉用超純水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的質(zhì)量百分比為2.0％。將該粗多糖液用sevag法脫蛋白后再脫鹽，在以pH6.8的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以2ml/min流速洗脫條件下柱純化，后獲得純的灰樹花胞內(nèi)多糖GFP-1，提取得率為0.24‰。
實施例7培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.8％、玉米粉1.0％、棉子殼0.5％、麩皮0.8％、磷酸二氫鉀0.2％、磷酸鎂0.2％、氯化鈣0.05％，在121℃下滅菌30分鐘；發(fā)酵溫度25℃，通風(fēng)比0.8vvm，攪拌速度40轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)136小時后結(jié)束發(fā)酵；將發(fā)酵液離心15分鐘，收集菌絲體；按菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶3.5的比例加入水后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并在95℃條件下熱水浸提2.5小時；冷卻至室溫后離心15分鐘取上清液，加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到38％，將該液體離心10分鐘后取上清液。在上清液中再加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到75％，將該液體離心10分鐘后取沉淀80℃下烘干，所得即為粗多糖粉。將粗多糖粉用超純水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的質(zhì)量百分比為1.5％。將該粗多糖液脫色、脫鹽、在以pH7.8的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以1.5ml/min流速洗脫條件下柱純化，后獲得純的灰樹花胞內(nèi)多糖GFP-1，提取得率為0.26‰。
實施例8培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.2％、玉米粉1.0％、棉子殼0.5％、麩皮0.5％、磷酸二氫鉀0.2％、磷酸鎂0.1％、氯化鈣0.1％，在121℃下滅菌30分鐘；發(fā)酵溫度22℃，通風(fēng)比1.0vvm，攪拌速度60轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)148小時后結(jié)束發(fā)酵；將發(fā)酵液離心15分鐘，收集菌絲體；按菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶6的比例加入水后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并在90℃條件下熱水浸提6小時；冷卻至室溫后離心15分鐘取上清液，加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到32％，將該液體離心10分鐘后取上清液。在上清液中再加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到68％，將該液體離心10分鐘后取沉淀80℃下烘干，所得即為粗多糖粉。將粗多糖粉用超純水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的質(zhì)量百分比為2.0％。將向該粗多糖液中加入三氯乙酸，使液體中三氯乙酸的濃度達(dá)到10％，靜置后離心20分鐘，所得上清液再脫色、脫鹽，在以pH6.8的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以1ml/min流速洗脫條件下柱純化，后獲得純的灰樹花胞內(nèi)多糖GFP-1，提取得率為0.23‰。
實施例9培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.8％、玉米粉1.0％、棉子殼0.5％、麩皮0.8％、磷酸二氫鉀0.2％、磷酸鎂0.2％、氯化鈣0.05％，在121℃下滅菌30分鐘；發(fā)酵溫度28℃，通風(fēng)比0.65vvm，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)140小時后結(jié)束發(fā)酵；將發(fā)酵液離心15分鐘，收集菌絲體；按菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶4的比例加入水后進(jìn)行細(xì)胞破碎，并在88℃條件下熱水浸提5小時；冷卻至室溫后離心15分鐘取上清液，濃縮1倍，加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到26％，將該液體離心10分鐘后取上清液。在上清液中再加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到70％，將該液體離心10分鐘后取沉淀80℃下烘干，所得即為粗多糖粉。將粗多糖粉用超純水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的質(zhì)量百分比為1.75％。將該粗多糖液脫鹽，在以pH6.8的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以1.5ml/min流速洗脫條件下柱純化，后獲得純的灰樹花胞內(nèi)多糖GFP-1，提取得率為0.28‰。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)灰樹花胞內(nèi)多糖的方法，a、深層發(fā)酵，將灰樹花液體在發(fā)酵溫度22～29℃，通風(fēng)比0.2～1.0vvm，攪拌速度40～120轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵培養(yǎng)時間120～168h的條件下深層發(fā)酵；b、細(xì)胞破碎，將上述發(fā)酵液中的菌絲體進(jìn)行破碎；c、熱水浸提，在溫度為88～95℃，時間為2.5～6小時，菌絲體質(zhì)量與水體積的比值為1∶3～1∶6的條件下進(jìn)行浸提，得到含有胞內(nèi)多糖的浸提液；d、脫鹽，利用透析法對粗多糖溶液進(jìn)行脫鹽處理；e、柱純化，利用16/10 DEAE層析柱對已經(jīng)脫過鹽的粗多糖溶液進(jìn)行柱純化。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是灰樹花液體深層發(fā)酵所用的培養(yǎng)基組成為葡萄糖1～2％、玉米粉0.5～1.5％、棉子殼0.25～0.75％、麩皮0.5～1％、磷酸二氫鉀0.05～0.4％、磷酸鎂0.05～0.4％、氯化鈣0.02～0.3％。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在細(xì)胞破碎時，將經(jīng)過深層發(fā)酵后的菌絲體利用組織搗碎法或超聲波法或高壓破碎法進(jìn)行細(xì)胞破碎。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在熱水浸提后，脫鹽前，利用酒精對上述浸提液分步沉淀，即在熱水浸提液中加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到22～38％，將該液體離心后取上清液，在上清液中再加入無水酒精，使液體中酒精的體積百分比濃度達(dá)到55～75％，將該液體離心后取沉淀物于80℃下烘干，所得即為粗多糖粉，將粗多糖粉用超純水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的質(zhì)量百分比為0.5～2.0％。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在熱水浸提后，再脫蛋白。
6.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征是在脫蛋白后，再脫色，即在上述粗多糖溶液中滴加20％雙氧水溶液至淡黃色，在滴加20％雙氧水溶液時，粗多糖的pH值為8，再在40℃下保溫1小時。
7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在脫鹽時，將已經(jīng)脫色的粗多糖溶液置于截留分子量為10000～12000的透析袋內(nèi)，以超純水透析至離子強(qiáng)度不變。
8.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在柱純化時，采用16/10 DEAE層析柱，以pH6.8～9.0的磷酸鹽緩沖液，1M氯化鈉溶液梯度洗脫，以1～3ml/min流速洗脫，5ml/管部分收集，經(jīng)苯酚——硫酸法逐管檢測每管多糖含量，F(xiàn)olin-酚法逐管檢測蛋白含量，以測定中多糖和蛋白含量第一次同時達(dá)到高峰時的那一管以它之前和之后各三管的樣品為所需的胞內(nèi)多糖。
9.按權(quán)利要求7所述的方法，其特征是所獲得的灰樹花胞內(nèi)多糖為各組成單糖主要以β鍵相連接，分子量在200萬以上組分單一的純的糖綴合物。
10.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征是在獲得粗多糖溶液后，脫鹽前，進(jìn)行脫蛋白。
11.按權(quán)利要求4或10所述的方法，其特征是在獲得粗多糖溶液或脫蛋白后，再脫色，即在上述粗多糖溶液中滴加20％雙氧水溶液至淡黃色，在滴加20％雙氧水溶液時，粗多糖的pH值為8，再在40℃下保溫1小時。
12.按權(quán)利要求5或10所述的方法，其特征是在脫蛋白時，在熱水浸提液或粗多糖溶液中直接加入三氯乙酸，使液體中三氯乙酸的質(zhì)量百分比濃度達(dá)到5～25％，再將該液體離心，脫去其中的蛋白，所獲的上清液即為粗多糖溶液。
13.按權(quán)利要求5或10所述的方法，其特征是在脫蛋白時，在熱水浸提液或粗多糖溶液中利用Sevag法脫蛋白將熱水浸提液或粗多糖液與氯仿-正丁醇混合液按體積比3∶1混合，置于具塞試管中，充分振搖30分鐘后，在4000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心1分鐘，然后將水相與氯仿相分開，取水相；再重復(fù)上述步驟兩次，其中，氯仿-正丁醇混合液中兩者的體積比為氯仿∶正丁醇＝4∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用天然真菌通過發(fā)酵制備一種具有抗艾滋病病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能的可食用的藥用糖綴合物。本發(fā)明的特征在于通過灰樹花菌種的液體深層發(fā)酵，將發(fā)酵獲得的灰樹花菌絲體通過細(xì)胞破碎，熱水浸提，脫蛋白或經(jīng)過酒精分步沉淀后再脫蛋白，脫色，脫鹽，柱純化等步驟獲得單一組分的灰樹花胞內(nèi)多糖。本發(fā)明的優(yōu)點在于1)由于采用液體生層發(fā)酵，它具有灰樹花液體培養(yǎng)的一切優(yōu)點；2)本發(fā)明所獲得的灰樹花胞內(nèi)多糖具有明顯的抗HIV的功效，且基本無毒副作用；3)本發(fā)明所獲得的灰樹花胞內(nèi)多糖為單一組分，可以直接制備成藥用針劑或口服藥。
文檔編號C12P19/04GK1546677SQ200310106540
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者章克昌, 袁德云, 王玉紅, 章毅 申請人:章克昌