專利名稱：標(biāo)記核糖核酸的方法和由此得到的標(biāo)記的rna片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種伴信號(hào)放大的標(biāo)記核糖核酸(RNA)的新方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)顯示，有很多方法用于標(biāo)記核苷酸、寡核苷酸或核酸；寡核苷酸和核酸用術(shù)語(yǔ)多核苷酸表示。多核苷酸可在合成中被標(biāo)記或通過(guò)摻入至少一個(gè)標(biāo)記的核苷酸而被標(biāo)記。
第一種方法包括將標(biāo)記連到堿基上，無(wú)論后者是天然堿基或經(jīng)修飾的堿基。第二種方法將標(biāo)記連到糖上，也無(wú)論后者是天然糖或經(jīng)修飾的糖。第三種方法涉及將標(biāo)記連到磷酸上。
事實(shí)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員都傾向于將標(biāo)記連到堿基或糖上來(lái)標(biāo)記核苷酸或核苷酸類似物或核酸，這會(huì)給他們帶來(lái)更多的便利和更多的選擇。而且，這是研究了大量文件得出的，如EP-A-0.329.198，EP-A-0.302.175，EP-A-0.097.373，EP-A-0.063.879，US-A-5,449,767，US-A-5,328,824，WO-A-93/16094，DE-A-3.910.151和EP-A-0.567.841涉及堿基，或EP-A-0.286.898涉及糖。各文件在此引作參考用于所有目的。
將標(biāo)記連到磷酸的技術(shù)更為復(fù)雜，尤其是因?yàn)楹怂崾撬苄缘模姿嵩谠摻橘|(zhì)中的反應(yīng)性比在有機(jī)溶劑中低。
盡管這樣，一些文件已經(jīng)提出了標(biāo)記磷酸的技術(shù)，如文件EP-A-0.280.058，在此引作參考用于所有目的，其描述了將標(biāo)記連到磷酸來(lái)標(biāo)記核苷酸的方法，當(dāng)所述核苷酸是脫氧核糖核苷酸時(shí)，標(biāo)記的磷酸連在糖的3’和/或5’位上；當(dāng)所述核苷酸是核糖核苷酸時(shí)，標(biāo)記的磷酸連在糖的2’，3’和/或5’位上。該文件也描述了包含至少一個(gè)如上所述的標(biāo)記的核苷酸的多核苷酸或寡核苷酸；該核苷酸在合成過(guò)程中被摻入多核苷酸或寡核苷酸中。
然而，文件EP-A-0.280.058提出的標(biāo)記方案不能均勻地標(biāo)記核酸。標(biāo)記的核苷酸摻入多核苷酸不受控制，它完全取決于合成的多核苷酸的組成。因此，一些多核苷酸可能含有大量標(biāo)記的核苷酸，而其他的可能根本不含標(biāo)記的核苷酸。其結(jié)果是這些核酸發(fā)射的信號(hào)強(qiáng)度不均勻，因此當(dāng)檢測(cè)核酸時(shí)難以解釋結(jié)果。
在這種情況下，標(biāo)記通過(guò)生物學(xué)方法摻入，標(biāo)記的核苷酸的位置不受任何控制。
文件US-A-5,317,098在此引作參考用于所有目的，涉及在其5’端被標(biāo)記的核酸。該連接使用咪唑和一個(gè)連接臂。沒(méi)有與標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的斷裂。此外，磷酸被加至核酸，因此用激酶作為引入磷酸的手段，導(dǎo)致至少一個(gè)附加的生物學(xué)步驟。該文件描述了對(duì)15聚體的寡核苷酸的標(biāo)記。當(dāng)用大分子核酸而不是寡核苷酸時(shí)，該技術(shù)使得標(biāo)記僅僅存在于5’端并且標(biāo)記的核酸的特異性活性是低的。
另外，當(dāng)對(duì)大分子核酸進(jìn)行標(biāo)記而不經(jīng)過(guò)斷裂階段，也稱為裂解階段時(shí)，這些標(biāo)記的核酸與其互補(bǔ)序列的雜交動(dòng)力學(xué)是慢的，以至造成了低的雜交收率。這因此造成信號(hào)在數(shù)量和質(zhì)量上的丟失。位阻在該反應(yīng)中是關(guān)鍵因素。
位阻不僅僅由核酸的長(zhǎng)度產(chǎn)生，也由二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在產(chǎn)生。斷裂幫助打破(或減少)這些結(jié)構(gòu)，并因此使得雜交最優(yōu)化。位阻在與包含高密度捕獲探針的固體表面的雜交中起著尤其重要的作用，如Affymetrix公司開發(fā)的DNA陣列(“用高密度DNA陣列存取遺傳信息”，M.Chee等，科學(xué)(Science)，274，610-614，1996?！肮馍傻墓押塑账彡嚵杏糜诳焖貲NA序列分析”，A.Caviani Pease等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91，5022-5026，1994，US-5744 305，US-5 445 934)。各文件在此引作參考用于所有目的。在該技術(shù)中，捕獲探針的大小通常減少，長(zhǎng)度大約20個(gè)核苷酸。
現(xiàn)有技術(shù)中描述了許多斷裂核酸的方法。
首先，斷裂可以是酶促的，即核酸可被核酸酶(DNA酶或RNA酶)斷裂(酶學(xué)方法(Methods in Enzymol.)，vol.152，S.Berger和A.Kimmel，ed.Academic Press，1987，酶技術(shù)和重組DNA技術(shù)(Enzymatic techniques和Recombinant DNA technology)，《分子克隆指南》，p91-110，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室指南，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第2版，p5.30-5.95，1989)。各文件在此引作參考用于所有目的。
取決于涉及的酶，該反應(yīng)生成了在其5’或3’端有羥基或單磷酸基團(tuán)的小片段或單體。
其次，斷裂可以是化學(xué)的。例如，對(duì)于DNA序列，用烷化劑脫嘌呤或脫嘧啶作用生成脫堿基位點(diǎn)，然后在堿的存在下通過(guò)稱為“β-消除”的機(jī)制將其斷裂(T.Lindahl等，雙鏈脫氧核糖核酸在無(wú)嘌呤位點(diǎn)的鏈斷裂速率，生物化學(xué)(Biochemistry)，11，p3618-3623，1972)。DNA尤其可被氧化、烷化或自由基加成機(jī)制斷裂(M.Liuzzi等，用甲氧胺對(duì)γ照射和OsO4處理的DNA的表征和損傷，國(guó)際放射生物學(xué)雜志(Int.J.Radiat.Biol.)，54，p709-722，1988)。金屬陽(yáng)離子經(jīng)常與用作化學(xué)催化劑的有機(jī)分子如咪唑組合，用于RNA的斷裂(R.Breslow和R.Xu，核酸化學(xué)中的識(shí)別和催化，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90，p1201-1207，1993.J.Hovinen等，咪唑栓系的寡核苷酸合成和RNA裂解活性，有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem.)，60，p2205-2209，1995)。該斷裂優(yōu)選在堿性介質(zhì)中進(jìn)行，產(chǎn)生有3’磷酸末端的片段。各文件在此引作參考用于所有目的。
然而，這些斷裂的目的并不是易化或允許標(biāo)記。
文件WO-A-88/04300提供了一種斷裂和標(biāo)記RNA的方法，其利用具有酶活特的RNA分子，即核酶。用這些核酶進(jìn)行裂解催化是序列特異性的，反應(yīng)生成5’端有羥基基團(tuán)(OH)和3’端為單磷酸的RNA片段。然后通過(guò)摻入一個(gè)來(lái)源于GTP分子的附加的放射性磷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)標(biāo)記(只是放射性標(biāo)記)。這是屬于這些核酶的磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性，即激酶活性。所述放射性磷酸的結(jié)合只在5’端的羥基基團(tuán)上實(shí)現(xiàn)，沒(méi)有來(lái)自斷裂的磷酸被用于將標(biāo)記連到RNA片段上。此外，斷裂只能通過(guò)核酶進(jìn)行，意味著核酶與所要裂解的目標(biāo)核酸之間存在特異性。然后，磷酸作為標(biāo)記起作用。
我們的發(fā)明允許將標(biāo)記連到在裂解過(guò)程中釋放出的核酸片段的磷酸上，其中不存在特異性，因此任何類型的核酸能以隨機(jī)方式斷裂。用該方法能得到均勻的標(biāo)記強(qiáng)度，因?yàn)槊款惿善蔚臉?biāo)記產(chǎn)率完全獨(dú)立于其序列和組成。因此，我們的方法使得例如制備檢測(cè)探針成為可能。最后，磷酸只是核酸和標(biāo)記之間的連接臂。
信號(hào)放大技術(shù)在免疫測(cè)定領(lǐng)域，或例如在WO95/08000中描述的核酸探針，或發(fā)表在組織化學(xué)細(xì)胞化學(xué)雜志(J.Histochem.Cytochem.)45481-491，1997的文章中(各文件在此引作參考用于所有目的)是熟知的，但是在標(biāo)記過(guò)程中沒(méi)有相關(guān)的斷裂。
現(xiàn)有技術(shù)中未描述伴信號(hào)放大的標(biāo)記之前的斷裂過(guò)程。
所以本發(fā)明提供了一種克服先前所述缺點(diǎn)的方法。因此，該方法使一旦斷裂完成得到均勻標(biāo)記的RNA片段成為可能。另外，斷裂使獲得對(duì)可能的雜交具有最適大小的片段成為可能。隨著雜交質(zhì)量的提高，雜交后檢測(cè)標(biāo)記的片段將更快更有效。最后，發(fā)明通過(guò)增加產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度和信號(hào)/背景比提高了靈敏度。
發(fā)明概述為此，本發(fā)明涉及一種標(biāo)記合成的或天然的核糖核酸(RNA)的方法，特征在于其包括-斷裂RNA，-將第一配體固定于位于所述RNA各片段的3’端和/或5’端的末端磷酸，所述末端磷酸已經(jīng)在斷裂過(guò)程中被釋放，和-將標(biāo)記劑結(jié)合到所述第一配體上。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中，RNA(核糖核酸或多核糖核苷酸)是合成或天然RNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知獲得合成RNA的方法。這些方法包括如擴(kuò)增技術(shù)(參見，例如Kozal M.J.等，自然醫(yī)學(xué)(NatureMedicine)，2(7)，753-758，1996，在此全文引作參考用于所有目的)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增技術(shù)或其他獲得RNA產(chǎn)物的方法包括TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)，NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)，3SR(自動(dòng)維持序列擴(kuò)增)，Qβ復(fù)制酶擴(kuò)增，用酶消化天然RNA和多核苷酸化學(xué)合成(參見，如美國(guó)專利5,554,516和5,766,849和臨床微生物綜述(Clin.Microbiol.Rev.)，5(4)，p 370-386，1992。各文件在此全文引作參考用于所有目的)。合成RNA也是RNA，其包括至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸或至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸間鍵如硫代磷酸。天然RNA是從細(xì)胞中提取得到的RNA，如信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)或轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)。標(biāo)記過(guò)程是連接一個(gè)能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記。下面非限定列出這些標(biāo)記●產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的酶，如通過(guò)比色法、熒光和發(fā)光來(lái)檢測(cè)，如辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
●發(fā)色團(tuán)，如熒光和發(fā)光化合物和染料。
●具有能被電子顯微鏡或通過(guò)其電特性，如傳導(dǎo)性、電流分析、電壓測(cè)量和電阻等檢測(cè)的電子密度的基團(tuán)。
●可檢測(cè)基團(tuán)，如其分子大小足以誘導(dǎo)在其物理和/或化學(xué)特性上可檢測(cè)的修飾；這種檢測(cè)可通過(guò)光學(xué)方法(如衍射、表面胞質(zhì)團(tuán)共振，表面變異和接觸變異角度)或物理方法(如原子力譜學(xué)和隧道效應(yīng))實(shí)現(xiàn)。
●放射性分子，如32P，35S或125I。
包含標(biāo)記的化合物是標(biāo)記劑。
術(shù)語(yǔ)“固定”意思是創(chuàng)建共價(jià)或非共價(jià)鍵。磷酸或硫代磷酸的選擇性抗體是創(chuàng)建非共價(jià)鍵的方法。根據(jù)優(yōu)選的操作模式，固定如實(shí)施例所述是共價(jià)的。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，斷裂和固定在一個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，斷裂和固定在兩個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案，標(biāo)記劑與第一配體的結(jié)合是共價(jià)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知允許共價(jià)偶聯(lián)的不同反應(yīng)基團(tuán)，一些軛合的實(shí)施例可在“生物軛合技術(shù)”《Bioconjugate techniques》Hermanson G.T.，Academic Press，San Diego，1996中找到，在此全文引作參考用于所有目的。
根據(jù)第二個(gè)實(shí)施方案，標(biāo)記劑與第一配體的結(jié)合是非共價(jià)的。非共價(jià)結(jié)合是包括如離子或靜電相互作用、范得瓦耳斯相互作用、氫鍵或不同相互作用組合的結(jié)合。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記劑結(jié)合到所述第一配體是非直接進(jìn)行的。固定到末端磷酸的第一配體結(jié)合到第一抗配體，所述第一抗配體結(jié)合到第二配體，而標(biāo)記劑是帶有至少一個(gè)標(biāo)記的第二抗配體并能與所述第二配體反應(yīng)。
(抗配體/配體)組合意思是能以特異性方式一起反應(yīng)的兩種化合物。
第一配體/第一抗配體和第二配體/第二抗配體組合選自如生物素/鏈霉抗生物素、半抗原/抗體、抗原/抗體、肽/抗體，糖/凝集素和多核苷酸/互補(bǔ)多核苷酸。
這些不同的組合和其他組合是已知的，例如在BioMerieux的申請(qǐng)WO 96/19729，WO 94/29723，WO 95/08000中記載，本文引作參考。
第一和第二配體是相同或不同的。
在優(yōu)選操作模式中，第一配體是熒光素衍生物，第二配體是生物素衍生物。
在另一個(gè)優(yōu)選操作模式中，第一配體是生物素衍生物，第一抗配體是鏈霉抗生物素衍生物。
對(duì)堆積其他實(shí)體(配體/抗配體)來(lái)增強(qiáng)信號(hào)放大設(shè)有限制。例如，一個(gè)(第二配體/第一抗配體)實(shí)體結(jié)合到固定至磷酸上的第一配體，然后一個(gè)(第三配體/第二抗配體)實(shí)體結(jié)合到第二配體，而標(biāo)記劑是帶有至少一個(gè)標(biāo)記的第三抗配體并能與第三配體反應(yīng)。
不同實(shí)體的加入可以在至少一個(gè)步驟中進(jìn)行或可以在配體固定到磷酸后先后加入各實(shí)體。
根據(jù)優(yōu)選的操作模式，將第一配體固定到RNA各片段的3’端，是遠(yuǎn)離構(gòu)成起始RNA的3’和/或5’端的片段進(jìn)行的。另外或可選擇的，將第一配體固定到RNA各片段的5’端，是遠(yuǎn)離構(gòu)成起始RNA的5’端的片段進(jìn)行的。
無(wú)論哪個(gè)實(shí)施方案，將第一配體固定到RNA片段的3’端或5’端是通過(guò)將第一配體攜帶的反應(yīng)基團(tuán)與磷酸反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述磷酸相對(duì)于核糖位于2’位，3’位或環(huán)單磷酸2’-3’位。
斷裂和/或?qū)⒌谝慌潴w固定到RNA片段的3’端或5’端是通過(guò)配體攜帶的親核、親電子或鹵素基團(tuán)與磷酸結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述磷酸相對(duì)于核糖位于2’位，3’位或環(huán)單磷酸2’-3’位。
RNA斷裂是通過(guò)酶促、化學(xué)或物理方法實(shí)現(xiàn)的。
RNA的酶促斷裂通過(guò)核酸酶進(jìn)行。
RNA的化學(xué)斷裂通過(guò)金屬陽(yáng)離子進(jìn)行，其中金屬陽(yáng)離子可以與或不與化學(xué)催化劑聯(lián)合。
在這種情況下，金屬陽(yáng)離子是Mg++，Mn++，Cu++，Co++和/或Zn++離子，而化學(xué)催化劑包括咪唑，取代的類似物，如N-甲基咪唑，或任何對(duì)RNA有親和力和帶有咪唑環(huán)的化學(xué)分子或取代的類似物。
RNA的物理斷裂通過(guò)超聲或照射進(jìn)行。
在所有情況下，第一配體固定到RNA片段的3’端或5’端是通過(guò)反應(yīng)分子R-X實(shí)現(xiàn)的，其中R包括配體，X是反應(yīng)基團(tuán)，如羥基、胺、肼、烷氧基胺、烷基鹵、苯甲基鹵、碘乙酰胺或馬來(lái)酰亞胺。X與連接于核糖的2’位，3’位或環(huán)單磷酸2’-3’位的磷酸反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案，X為烷基鹵、苯甲基鹵、碘乙酰胺或馬來(lái)酰亞胺。為便于固定配體，連接臂任選存在于配體和反應(yīng)基團(tuán)之間。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R-X是N-(生物素基)-N’-(碘乙?；?乙二胺，(+)-生物素基-碘乙酰胺基-3，6-二氧雜辛烷二胺，N-碘乙?；?N-生物素亞己基二胺，5-(溴甲基)熒光素。
本發(fā)明也包括通過(guò)上述方法得到的RNA片段。所述RNA片段在3’端或5’端具有單個(gè)核苷酸，所述核苷酸在斷裂過(guò)程中釋放出來(lái)的末端磷酸上被標(biāo)記。
該RNA片段包括10-150個(gè)核苷酸，優(yōu)選30-70個(gè)核苷酸并優(yōu)選40-60個(gè)核苷酸以利于RNA片段與探針或目標(biāo)的雜交。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，所述RNA片段包括至少一個(gè)硫代磷酸核苷酸。
另外，攜帶配體的核苷酸是硫代磷酸核苷酸。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，所述RNA片段在3’端包含磷酸或硫代磷酸，所述磷酸或硫代磷酸帶有熒光素，熒光素結(jié)合至帶有至少一個(gè)生物素的抗熒光素抗體，所述抗體結(jié)合到標(biāo)記的鏈霉抗生物素。
本發(fā)明涉及如上所述的RNA片段，作為探針檢測(cè)RNA和/或DNA或RNA片段和/或DNA片段的用途。
本發(fā)明最后涉及如上所述的RNA片段，作為能與捕獲探針結(jié)合的標(biāo)記的目標(biāo)的用途。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示在Mn++陽(yáng)離子和咪唑存在下化學(xué)斷裂RNA的圖解。
圖2顯示用帶有親核基團(tuán)的配體斷裂和標(biāo)記RNA的可能機(jī)制的圖解。
附圖和實(shí)施例代表特定的實(shí)施方案，不能視為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1RNA擴(kuò)增子在LDC(裂解過(guò)程中標(biāo)記)中的信號(hào)放大。
1.1 擴(kuò)增子的制備從分離菌中，用刮匙末端刮取一個(gè)或兩個(gè)新鮮生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落(結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(ATCC-27294)，在Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基上；3-5mm直徑；約108個(gè)細(xì)菌)，并將其重懸于在1.5ml Eppendorf管中的250μl無(wú)菌水中。在玻璃珠存在下，通過(guò)渦旋細(xì)菌懸液從培養(yǎng)物中釋放總核酸。將5μl裂解物直接加入PCR。用分枝桿菌屬引物(在結(jié)核分枝桿菌參考序列M20940[GenBank]的213到236位和394到415位，結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增子的大小是202bp)PCR擴(kuò)增16S高變區(qū)。引物在其5’端還含有噬菌體T3或T7啟動(dòng)子序列T3-M1，5′-AATTAACCCTCACTAAAGGGAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCA，和T7-M2， 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTGGCCGGACACCCTCTCA.
PCR在100μl反應(yīng)體積中進(jìn)行，其中含有50mM KCl，10mM Tris(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.001％(重量/體積)明膠，5％(體積/體積)二甲基亞砜，0.5μM(每種)引物，200μM(每種)脫氧核苷三磷酸，和1.5U Taq聚合酶(AmpliTaq；Perkin-Elmer，Norwalk，Conn.)。PCR在Perkin Elmer 2400 thermal cycler中進(jìn)行，最初變性步驟為94℃ 5分鐘，循環(huán)條件為94℃ 45秒，60℃ 30秒和72℃ 30秒共35個(gè)循環(huán)和最后一個(gè)循環(huán)72℃ 10分鐘。用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。
將啟動(dòng)子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增子用于通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生標(biāo)記的單鏈RNA目標(biāo)核酸。每20μl反應(yīng)混合物含有約50ng PCR產(chǎn)物，20 U T3或T7 RNA聚合酶(Promega)；40mM Tris乙酸(pH8.1)；100mM醋酸鎂；10mM二硫蘇糖醇；1.25mM核糖核苷三磷酸(ATP、CTP、GTP和UTP)，反應(yīng)在37℃下進(jìn)行1小時(shí)。
1.2 擴(kuò)增子裂解過(guò)程中的標(biāo)記RNA擴(kuò)增子如1.1所述制備。向RNA分子(1μl反應(yīng)混合物)中，加入6μl咪唑(0.1M在純水中)，6μlMnCl2(1M在純水中)和2μl 5-(溴甲基)熒光素(5-BMF，由Molecular Probes，Eugene，OR，USA提供，編號(hào)B1355；100mM在DMSO中)和純水，至終體積為100μl。將反應(yīng)介質(zhì)均化，65℃溫育30分鐘。
1.3 DNA陣列分析方案用于分析分枝桿菌擴(kuò)增子的DNA芯片與A.Troesch等在臨床微生物雜志(J.Clin.Microbiol.)，37(1)，p49-55，1999中描述的相同。在此全文引作參考用于所有目的。分析在GeneChip設(shè)備系統(tǒng)(參考號(hào)900228，Affymetrix，Santa Clara，CA)上進(jìn)行，其包括GeneArray掃描儀，GeneChip雜交箱，GeneChip射流工作站(fluidics station)和GeneChip分析軟件。
1.4 抗體染色第一步雜交用上述引作參考的文章中描述的方法在DNA陣列上進(jìn)行。
然后沖洗陣列，第二步染色用染色液進(jìn)行，其中含300μl MES(參考Aldrich 16373-2，2M在純水中)，2.4μl乙?；呐Ｑ灏椎鞍祝?μl正常山羊IgG，1.2μl抗熒光素抗體，和純水，終體積為600μl。
抗熒光素-兔IgG級(jí)分-生物素XX偶聯(lián)物(抗體-抗熒光素生物素)由Molecular Probes(Eugene，OR，參考號(hào)A-982)提供。
乙酰化的牛血清白蛋白(乙?；疊SA)溶液由GibcoBRL LifeTechnologies(Rockville，MD.編號(hào)15561-020)提供。
試劑級(jí)別的山羊IgG由Sigma Chemical(St.Louis，MO.編號(hào)I-5256)提供雜交10分鐘后，沖洗陣列，用含6×SSPE-Tween 0.01％的洗滌緩沖液洗滌。第三步雜交用第二種染色液進(jìn)行，所述染色體定義為300μl MES(2M在純水中)，6μl乙酰化BSA和6μl鏈霉抗生物素-R-藻紅素偶聯(lián)物和純水，終體積為600μl。
鏈霉抗生物素-R-藻紅素偶聯(lián)物(SRPhy)由Molecular Probes(Eugene，OR，編號(hào)S-866)提供。
雜交10分鐘后，沖洗陣列，用和第二步中相同的洗滌緩沖液洗滌。
用GeneChip軟件可用的功能生成的結(jié)果表示為核苷酸堿基信號(hào)百分比(BC％)、探針陣列單元的平均信號(hào)強(qiáng)度(S用相對(duì)熒光單位RFU表示)，平均背景強(qiáng)度(B用RFU表示)和S/B比值，見下表。
上述數(shù)據(jù)表明，用抗體染色的信號(hào)放大提高了堿基信號(hào)百分比和強(qiáng)度水平，信號(hào)對(duì)背景的比值也得到提高。
實(shí)施例2合成的寡脫氧核糖核苷酸作為標(biāo)記模型的抗體染色2.1 寡核苷3’-單硫代磷酸的制備。
通過(guò)Eurogentec(Seraing Belginm)用亞磷酰胺化學(xué)法制備在3’端帶有單磷酸基團(tuán)的寡核糖核苷酸(ODN-ps)(5’-CUG AAC GGU AGC AUCUUG AC-3’)。
2.2 寡核苷酸裂解過(guò)程中的標(biāo)記寡核糖核苷3’-單硫代磷酸如2.1所述制備。
向寡核苷酸(5μl，1nmol)中，加入3μl咪唑(0.1M在純水中)，3μlMnCl2(1M在純水中)和2μl四種標(biāo)記之一(100mM)和純水，至終體積為50μl。將反應(yīng)介質(zhì)均勻化，65℃溫育30分鐘。
測(cè)試不同的標(biāo)記標(biāo)記aN-(生物素基)-N’-(碘乙?；?乙二胺(100mM在DMSO中)(Molecular Probe編號(hào)B-1591)標(biāo)記b(+)-生物素基-碘乙酰胺基-3，6-二氧雜辛烷二胺(100mM在純水中)(Pierce Rockford，IL，編號(hào)21334)碘乙酰基-PEO-生物素。
標(biāo)記cN-碘乙?；?N-生物素亞己基二胺(100mM在DMF中)(Pierce Rockford，IL，編號(hào)21333)。
標(biāo)記d5-(溴甲基)熒光素(100mM在DMSO中)，無(wú)信號(hào)放大的檢測(cè)對(duì)照。
2.3 雜交然后加入500μl雜交緩沖液(1.5ml 20×SSPE+250μl Triton 1％+3.250ml純水(6×SSPE 0.05％triton)，將該溶液渦旋混勻。
將反應(yīng)產(chǎn)物如實(shí)施例1所述進(jìn)行雜交。
2.4 抗體染色對(duì)于3種帶有生物素的標(biāo)記劑，另一步雜交在DNA棋盤上如實(shí)施例1.4所述進(jìn)行，對(duì)于標(biāo)記d，不經(jīng)抗體染色的附加步驟而是直接進(jìn)行分析。
該染色步驟用染色液進(jìn)行，其中包含300μl MES(2M在純水中)，60μl乙?；腂SA，6μl鏈霉抗生物素-R-藻紅素偶聯(lián)物(SRPhy)和純水，終體積為600μl。乙?；呐Ｑ灏椎鞍?BSA)溶液由GibcoBRLLife Technologies(Rockville，MD.編號(hào)15561-020)提供。鏈霉抗生物素-R-藻紅素偶聯(lián)物由Molecular Probes(Eugene，OR，編號(hào)S-866)提供。
雜交10分鐘后，沖洗陣列，用洗滌緩沖液6×SSPE-Tween 0.01％洗滌。
如實(shí)施例1所述在DNA棋盤陣列上進(jìn)行檢測(cè)和分析。
該DNA-棋盤陣列設(shè)計(jì)為用如WO 9511995所述的4-tiling方法分析ODN-ps的互補(bǔ)序列。
分析結(jié)果表示為堿基信號(hào)百分比(BC％)、強(qiáng)度水平(S)、背景(B)和S/B比值，見下表。
在LDC中用生物素衍生物和抗體染色取代用5-(溴甲基)熒光素直接標(biāo)記，就堿基信號(hào)百分比和強(qiáng)度水平而言信號(hào)放大效果更好。
實(shí)施例3 天然RNA在LDC(裂解過(guò)程中標(biāo)記)中的信號(hào)放大。
3.1 RNA分離從生長(zhǎng)在LB肉湯(Teknova)中的大腸桿菌菌株MG1655中分離總RNA。細(xì)胞在37℃下生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期，離心收集細(xì)胞。用RNeasy試劑盒(Qiagen)分離RNA。分離的RNA通過(guò)在260nm下測(cè)量吸光度以定量。
3.2 RNA斷裂和標(biāo)記通過(guò)將以下成分在100μl終體積中混合用熒光素標(biāo)記RNA8μgRNA，30mM CHES(Aldrich，編號(hào)22403-0)pH 9-9.5，1mM 5-(溴甲基)熒光素(Molecular Probes，用在二甲基甲酰胺中的50mM原液加入)，30mM氯化錳。將組分置于PCR管中，在GeneAmp PCRSystem2400設(shè)備(Perkin Elmer)中加熱至65℃40分鐘，然后冷卻至4℃。為了用生物素標(biāo)記RNA，將以下成分在100μl終體積中混合10μg RNA，30mM MOPS(Aldrich，編號(hào)16377-5)pH7.5，20mM PEO-碘乙酰基-生物素(Pierce Rockford，IL，編號(hào)21334)，10mM氯化鎂。將組分置于PCR管中，在上述PCR設(shè)備中加熱至95℃ 30分鐘，然后25℃ 30分鐘，再冷卻至4℃。加入25μg載體糖原后沉淀標(biāo)記的RNA片段。將對(duì)照RNA spikes(各2fmol)先于標(biāo)記加到大腸桿菌RNA中。對(duì)照RNA spikes由體外轉(zhuǎn)錄線性化質(zhì)粒模板來(lái)制備。
3.3 探針陣列雜交和信號(hào)放大。
雜交在大腸桿菌有義探針陣列(Affymetrix)上進(jìn)行。該探針陣列基于大腸桿菌K-12的序列(“大腸桿菌K-12完整的基因組序列”，Blattner，F(xiàn).等，科學(xué)(Science)，277，1453-1474，1997，在此全文引作參考用于所有目的)。該陣列包含對(duì)每個(gè)用b#指定的RNA或蛋白編碼區(qū)的15個(gè)探針對(duì)(Blattner等，同上文)。對(duì)于這些區(qū)域，探針組互補(bǔ)于天然RNA(有義鏈)。該陣列也包括對(duì)位于b#區(qū)域之間的區(qū)域的探針組。這些被稱為基因間區(qū)。在這種情況下，探針組代表著基因間區(qū)的2個(gè)取向。另外，該探針陣列包含對(duì)一些對(duì)照序列的探針組。許多這些對(duì)照可以被夾雜在樣本中，作為陽(yáng)性雜交對(duì)照。陣列的單元特征大小為(23.5×23.5)μm2，合成面積為(12.8×12.8)mm2。
雜交液含有10μg熒光素標(biāo)記的RNA片段或5μg生物素標(biāo)記的RNA片段，在終體積為200μl含100mM MES，pH6.5-7.0，1M，Nat 20mMEDTA、0.01％(體積/體積)Tween20，0.5nM對(duì)照寡核苷酸(熒光素或生物素標(biāo)記的，與RNA樣本相匹配)、0.1mg/ml剪切和變性的鯡精子DNA和0.5mg/ml乙?；疊SA的體系中。將雜交液直接注射到探針陣列盒中，在GeneChip雜交箱(Affymetrix，Santa Clara，CA)里45℃雜交16小時(shí)。在GeneChip射流工作站(Affymetrix)進(jìn)行洗滌和染色。洗滌液定義如下嚴(yán)格的洗滌緩沖液，100mM MES，pH 6.5-7.0，0.1M Na+，0.01％(體積/體積)Tween20；非嚴(yán)格的洗滌緩沖液，6×SSPE(來(lái)自20×原液，BioWhittaker)，0.01％(體積/體積)Tween20，0.005％(體積/體積)Antifoam0-30(Sigma)。對(duì)于熒光素標(biāo)記的RNA雜交，將探針陣列放置在射流工作站并用非嚴(yán)格洗滌緩沖液洗滌(25℃，每個(gè)循環(huán)2次混合共10個(gè)循環(huán))，接著用嚴(yán)格洗滌緩沖液洗滌(50℃，每個(gè)循環(huán)15次混合共4個(gè)循環(huán))，在掃描之前用非嚴(yán)格洗滌緩沖液填充。熒光素標(biāo)記的探針陣列在GeneArray掃描儀(Hewlettpackard)上掃描，應(yīng)用以下掃描參數(shù)3μm象素，530nm波長(zhǎng)。掃描后，通過(guò)以下方法將熒光素信號(hào)放大將陣列與600μl 2μg/ml抗熒光素抗體-生物素偶聯(lián)物(抗體-抗熒光素生物素)，0.1mg/ml正常山羊IgG，和2mg/ml乙?；疊SA在100mM MES，pH 6.5-7.0，1M Na+，0.05％(體積/體積)Tween20和0.005％(體積/體積)Antifoam0-30中在25℃混合10分鐘。抗體結(jié)合之后，用600μl 10μg/ml鏈霉抗生物素-R-藻紅素偶聯(lián)物(SRPhy)在100mM MES，pH 6.5-7.0，1M Na+，0.05％(體積/體積)Tween20，0.005％(體積/體積)Antifoam0-30和5mg/ml乙酰化BSA中在25℃將陣列染色10分鐘。鏈霉抗生物素藻紅素染色之后，用非嚴(yán)格雜交緩沖液洗滌陣列(30℃，每個(gè)循環(huán)4次混合共10個(gè)循環(huán))。用3μm像素和570nm波長(zhǎng)的參數(shù)掃描陣列。對(duì)于生物素標(biāo)記的RNA雜交，用非嚴(yán)格洗滌緩沖液洗滌探針陣列(25℃，每個(gè)循環(huán)2次混合共10個(gè)循環(huán))，接著如上所述用嚴(yán)格洗滌緩沖液洗滌(50℃，每個(gè)循環(huán)15次混合共4個(gè)循環(huán))。然后如上所述用鏈霉抗生物素藻紅素對(duì)陣列進(jìn)行染色，接著用非嚴(yán)格洗滌緩沖液洗滌(25℃，每個(gè)循環(huán)4次混合共10個(gè)循環(huán))。然后通過(guò)以下方法陣列上的信號(hào)被放大將陣列與600μl 3μg/ml生物素化的抗鏈霉抗生物素抗體(山羊)(Vector Laboratories)，0.1mg/ml正常山羊IgG，和2mg/ml乙?；疊SA在100mM MES，pH 6.5-7.0，1M Na+，0.05％(體積/體積)Tween20和0.005％(體積/體積)Antifoam0-30中在25℃混合10分鐘。將陣列如上所述再用鏈霉抗生物素藻紅素染色，接著用非嚴(yán)格洗滌緩沖液洗滌(30℃，每個(gè)循環(huán)4次混合共15個(gè)循環(huán))。所有的步驟都在GeneChip射流工作站上按次序進(jìn)行。然后，用3μm像素和570nm波長(zhǎng)的參數(shù)掃描陣列。
3.4 數(shù)據(jù)分析掃描數(shù)據(jù)用GeneChip軟件(3.1版，AffyMetri X)分析。用設(shè)定在默認(rèn)參數(shù)的Expression Analysis Algorithm生成數(shù)據(jù)。呈現(xiàn)的信號(hào)選自陣列上的編碼序列(穩(wěn)定RNA和可讀框)。均差定義為完全配對(duì)探針和失配探針之間的強(qiáng)度差異對(duì)用以確定編碼序列的16探針對(duì)的平均。
3.5 結(jié)果雜交結(jié)果總結(jié)于下面兩個(gè)表中。
表1.大腸桿菌總RNA比較
表1概括了從陣列上編碼序列獲得的結(jié)果?？贵w放大對(duì)熒光素標(biāo)記目標(biāo)的價(jià)值通過(guò)比較呈現(xiàn)信號(hào)數(shù)目和平均均差值清楚可見。在這種情況下，抗體放大產(chǎn)生的附加信號(hào)將呈現(xiàn)信號(hào)數(shù)從826增加到1199，將平均均差從6提高到180。生物素標(biāo)記的RNA的抗體放大產(chǎn)生的平均均差信號(hào)類似于但輕度低于那些來(lái)自熒光素標(biāo)記的放大的平均均差信號(hào)。應(yīng)當(dāng)注意，生物素標(biāo)記的樣本是熒光素標(biāo)記的樣本量的1/2。
表2對(duì)照RNA spike的比較
1均差2絕對(duì)信號(hào)P＝呈現(xiàn)；A＝缺失；M＝邊緣表2概括了用RNA對(duì)照spike得到的數(shù)據(jù)。對(duì)于熒光素標(biāo)記的spikes，抗體信號(hào)放大極大地提高了平均均差值，將任何缺失或邊緣信號(hào)轉(zhuǎn)化為呈現(xiàn)信號(hào)。在抗體信號(hào)放大后，與熒光素標(biāo)記的spikes相比，生物素標(biāo)記的RNA spikes在12個(gè)探針組中的10個(gè)產(chǎn)生了更高的信號(hào)。
權(quán)利要求
1.伴信號(hào)放大的標(biāo)記核糖核酸(RNA)的方法，特征在于其包括-斷裂RNA；-將第一配體固定到位于所述RNA各片段的3’端和/或5’端的末端磷酸上，所述末端磷酸已在斷裂過(guò)程中被釋放，和-將標(biāo)記劑結(jié)合到所述第一配體上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)記劑結(jié)合到所述第一配體是間接實(shí)現(xiàn)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中第一配體結(jié)合到第一抗配體，所述第一抗配體結(jié)合到第二配體，而標(biāo)記劑是帶有至少一個(gè)標(biāo)記的第二抗配體并能與所述第二配體反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中第一配體/第一抗配體和第二配體/第二抗配體組合選自生物素/鏈霉抗生物素，半抗原/抗體，抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝集素和多核苷酸/互補(bǔ)的多核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中第一配體和第二配體是相同的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中第一配體和第二配體是不同的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中第一配體是熒光素衍生物，第二配體是生物素衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中第一配體是生物素衍生物而標(biāo)記劑或第一抗配體是鏈霉抗生物素衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中斷裂和固定在一個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中斷裂和固定在兩個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)記劑與第一配體的結(jié)合是共價(jià)的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)記劑與第一配體的結(jié)合是非共價(jià)的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中將第一配體固定到RNA片段的3’端或5’端是通過(guò)將所述第一配體攜帶的反應(yīng)基團(tuán)與相對(duì)于核糖位于2’位、3’位或環(huán)單磷酸的2’-3’位的磷酸反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中斷裂和/或?qū)⒌谝慌潴w固定到RNA片段的3’端或5’端是通過(guò)將所述第一配體攜帶的親核、親電子或鹵素基團(tuán)與相對(duì)于核糖位于2’位、3’位或環(huán)單磷酸的2’-3’位的磷酸反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中RNA斷裂是用酶促、化學(xué)或物理方法實(shí)現(xiàn)的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中RNA的酶促斷裂是通過(guò)核酸酶進(jìn)行的。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中RNA的化學(xué)斷裂是通過(guò)可以與或可以不與化學(xué)催化劑組合的金屬陽(yáng)離子進(jìn)行的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述金屬陽(yáng)離子是Mg++，Mn++，Cu++，Co++和/或Zn++離子，化學(xué)催化劑包括咪唑，取代的類似物，如N-甲基咪唑，或任何對(duì)RNA有親和力和帶有咪唑核的化學(xué)分子或取代的類似物。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中RNA的物理斷裂是通過(guò)超聲或照射方法進(jìn)行的。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中第一配體固定到RNA片段的3’端或5’端是通過(guò)將分子R-X與連接于核糖的2’位，3’位或環(huán)單磷酸2’-3’位的磷酸反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中R包括第一配體，X是選自羥基、胺、肼、烷氧基胺、烷基鹵、苯甲基鹵、碘乙酰胺或馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)基團(tuán)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中R-X選自5-(溴熒光素)和碘乙?；锼匮苌铩?br> 22.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法得到的RNA片段，其中所述RNA片段在3’端或5’端包含單個(gè)核苷酸，該核苷酸在其斷裂過(guò)程中釋放的末端磷酸上被標(biāo)記。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的RNA片段，其中所述RNA片段包含10-150個(gè)核苷酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求22和23其中一個(gè)的RNA片段，其中所述RNA片段包含至少一個(gè)硫代磷酸核苷酸，其帶有結(jié)合至鏈霉抗生物素抗體的生物素。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的RNA片段，其中帶有配體的核苷酸是硫代磷酸核苷酸。
26.RNA片段，其3’端包含帶有結(jié)合至帶有至少一個(gè)生物素的抗熒光素抗體的熒光素的磷酸或硫代磷酸，所述抗體結(jié)合至標(biāo)記的鏈霉抗生物素。
27.根據(jù)權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)的RNA片段作為探針用于檢測(cè)RNA和/或DNA，或RNA片段和/或DNA片段的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)的RNA片段作為能夠結(jié)合捕獲探針的標(biāo)記的目標(biāo)的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及伴信號(hào)放大的標(biāo)記核糖核酸(RNA)的方法，特征在于其包括斷裂RNA，將第一配體固定到位于所述RNA各片段的3’端和/或5’端的末端磷酸上，所述末端磷酸已在斷裂過(guò)程中被釋放，和將標(biāo)記劑結(jié)合到所述第一配體上。本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1391616SQ99817071
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期1999年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月17日
發(fā)明者A·拉尤恩, D·杜, C·G·米亞達(dá) 申請(qǐng)人:比奧美希奧公司, 阿費(fèi)梅特里克斯公司