專利名稱：單子葉植物的超速轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及土壤桿菌介導的單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
“轉(zhuǎn)化技術(shù)”是改良植物的手段之一，它將用于改變性狀的所需的重組基因?qū)胫参?。高效、快速的轉(zhuǎn)化方法對有用植物的分子育種極為重要，尤其對谷物，它是作為主食的重要糧食。
大多數(shù)谷物(例如水稻、小麥、大麥及玉米)屬于單子葉植物。目前為止已開發(fā)出多種轉(zhuǎn)化單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法。這些轉(zhuǎn)化方法大體分為直接轉(zhuǎn)化法和間接轉(zhuǎn)化法。
直接轉(zhuǎn)化法包括，如電穿孔法(Shimamofo等，Nature，338274-276，1989；Rhodes C.A.等，Science，240204-207，1989)、粒子槍法(ChristouP.等，Bio/Technology 9957-962，1991)及聚乙二醇(PEG)法(Datta，S.K.等，Bio/Technology 8736-740，1990)。電穿孔法和粒子槍法通常用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，它們是較為有效的導入基因地方法。
間接轉(zhuǎn)化法包括土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法(以下叫做土壤桿菌轉(zhuǎn)化法)。土壤桿菌是植物病原菌的一種。土壤桿菌的性質(zhì)是一旦感染植物，就將自身質(zhì)粒(例如，Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒)上存在的T-DNA區(qū)域整合到植物中。土壤桿菌轉(zhuǎn)化法利用T-DNA區(qū)域整合到植物中作為將基因?qū)胫参锏氖侄?。簡單地說就是用包含所需的重組基因的土壤桿菌感染植物。感染后，目的基因從土壤桿菌移到植物細胞內(nèi)，從而整合到植物基因組中。
土壤桿菌轉(zhuǎn)化法對于雙子葉植物已建立了有效的方法，到目前為止已建立了大量穩(wěn)定表達目的基因的轉(zhuǎn)化植物。
與此相對，一般認為土壤桿菌轉(zhuǎn)化法用于單子葉植物很困難。例如，Portrykus等，(Bio/Technology，535-542，1990)報道，土壤桿菌不感染單子葉植物。但是，另一方面，大量嘗試了使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤桿菌轉(zhuǎn)化法適用于單子葉植物的可能性。
例如，Ranineri等取出水稻的胚盤部分，造成損傷，放置到誘導去分化的培養(yǎng)基上，數(shù)日后，用土壤桿菌感染其胚盤部分。結(jié)果，未得到正常再生個體，但成功誘導了導入外來基因的愈傷組織(RanineriD.M.等，Bio/Technology，833-38，1990)。
國際公開WO94/00977號公開了水稻和玉米的土壤桿菌轉(zhuǎn)化法。該方法中有必要應用去分化過程中的或去分化了的培養(yǎng)組織(例如，愈傷組織)作為用土壤桿菌進行轉(zhuǎn)化的植物樣品。用土壤桿菌感染前，為了從要被轉(zhuǎn)化的植物樣品(例如葉子切片)制備去分化了的培養(yǎng)組織，通常要用3-4周誘導去分化。
國際公開WO95/06722號公開了用土壤桿菌轉(zhuǎn)化水稻和玉米的未成熟胚的方法。但是，取出未成熟胚很麻煩。
因此，若能利用更快速、有效的單子葉植物的土壤桿菌轉(zhuǎn)化法，對包含水稻等谷物的有用單子葉植物的分子育種將是一大貢獻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明意在解決上述問題。本發(fā)明的目的是改良單子葉植物的土壤桿菌轉(zhuǎn)化法。依據(jù)本發(fā)明的方法可比以往的土壤桿菌轉(zhuǎn)化法更有效地或迅速地制備出轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明涉及單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法，它包括用包含所需的重組基因的土壤桿菌感染無傷種子的步驟。本發(fā)明的方法中是在無傷狀態(tài)下感染種子，沒必要將要進行轉(zhuǎn)化的植物樣品進行去分化處理。
用于被土壤桿菌感染的種子是播種后第4-5天的種子。另外，感染的時間是，種子處于發(fā)芽狀態(tài)。
被轉(zhuǎn)化的單子葉植物優(yōu)選為水稻科植物，更優(yōu)選水稻(Oryza sativaL.)。
附圖簡述

圖1是表示生物狀態(tài)的照片，它表示感染土壤桿菌之前的水稻種子的狀態(tài)。
圖2是表示生物狀態(tài)的照片，它表示播種后第50天，用本發(fā)明的方法而得到的水稻再生個體。
圖3(a)是表示生物狀態(tài)的照片，它比較了播種后第90天用以往的方法得到的轉(zhuǎn)化體與播種后第50天用本發(fā)明的方法得到的轉(zhuǎn)化體；圖3(b)是表示生物狀態(tài)的照片，它比較了播種后第50天用以往的方法得到的轉(zhuǎn)化體與播種后第50天用本發(fā)明的方法得到的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的最佳實施方式以下對本發(fā)明進行詳細說明。
本發(fā)明的方法適用的“植物”為單子葉植物。優(yōu)選的單子葉植物包括水稻科植物(例如水稻和玉米)。本發(fā)明的方法適用的最佳植物是水稻，尤其是Japonica水稻。另外，如無其它說明，“植物”指植物體及由植物體而得到的種子。
(植物表達用載體的構(gòu)建)為了將所需的重組基因?qū)雴巫尤~植物，構(gòu)建包含所需的重組基因的植物表達用載體。這種植物表達用載體可應用業(yè)內(nèi)人士熟知的基因重組技術(shù)進行制備。例如pBI系的載體適用于構(gòu)建土壤桿菌轉(zhuǎn)化方法中應用的植物表達用載體，但并不限定于此。
“所需的重組基因”是指所希望的導入植物的任何多聚核苷酸。本發(fā)明的所需的重組基因并不限定于從天然物分離出的基因，它還包含合成的多聚核苷酸。合成的多聚核苷酸可以這樣獲得，如用該領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法合成或修飾序列已知的基因。本發(fā)明的所需的重組基因包括，例如希望能在轉(zhuǎn)化的植物中表達的、對于植物來講是內(nèi)源性的或外源性的任意多聚核苷酸，或者在希望調(diào)控植物內(nèi)某種內(nèi)源性基因的表達時，包含該目的基因的反義序列的多聚核苷酸。
意圖在植物內(nèi)表達時，所需的重組基因包含可操作方式的自己的啟動子(即，與該基因天然可操作性連接到啟動子)，或不包含自己的啟動子時，或者希望還包含自己啟動子之外的啟動子時，與任意合適的啟動子可操作性連接。所使用的啟動子包括組成性啟動子，在植物的一部分選擇性表達的啟動子，及誘導性啟動子。
植物表達用載體中還可以在宿主植物細胞內(nèi)可操作的方式連接各種調(diào)控元件。調(diào)控元件包括選擇性標記基因、植物啟動子、終止子及增強子。所使用的植物表達用載體的類型及調(diào)控元件的種類要根據(jù)轉(zhuǎn)化的目的進行變動，這是業(yè)內(nèi)人士眾所周知的事情。
“選擇性標記基因”是為了容易篩選轉(zhuǎn)化植物而使用的?？蛇x擇性使用賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因及賦予新霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)這樣的耐藥基因，但并不限定于此。
“植物啟動子”是指可與選擇性標記基因可操作性連接、在植物中表達的啟動子。這樣的啟動子的例子有，花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子，胭脂堿合成酶基因的啟動子，但并不限定于此。
“終止子”指位于基因編碼蛋白質(zhì)區(qū)域的下游，DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA時與轉(zhuǎn)錄的終結(jié)及polyA序列的添加相關(guān)的序列。終止子的例子包括CaMV 35S終止子和胭脂堿合成酶基因的終止子(Tnos)等，但并不限定于此。
“增強子”是為了提高目的基因的表達效率而應用的。作為增強子優(yōu)選應用包含CaMV 35S啟動子上游序列的增強子區(qū)域。每一個植物表達用載體可應用多個增強子。
(植物的轉(zhuǎn)化)用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的土壤桿菌可是任意的土壤桿菌屬細菌，優(yōu)選根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。用包含所需的重組基因的植物表達用載體(例如通過電穿孔法)轉(zhuǎn)化土壤桿菌。用轉(zhuǎn)化了的土壤桿菌感染種子，從而得到導入了所需的重組基因的植物。導入的重組基因整合到植物的基因組中存在。植物中的基因組不單指核染色體，還包含植物細胞中的各種細胞器(例如線粒體、葉綠體等)中的基因組。
將用于轉(zhuǎn)化的植物的種子去皮后，在無傷狀態(tài)下預培養(yǎng)。種子“無傷”是指種子不接受去除種子的胚珠及損傷其胚盤等人為操作的狀態(tài)。
預培養(yǎng)是將種子撒到含適當濃度植物生長激素(例如2，4-D)的培養(yǎng)基(例如N6D培養(yǎng)基)中，一般保溫4-5天，優(yōu)選5天。預培養(yǎng)在種子組織進入去分化過程以前停止。此時的溫度，一般25-35℃，優(yōu)選27-32℃。預培養(yǎng)結(jié)束后，給種子滅菌，然后用水充分洗滌。接著，無菌操作下，用轉(zhuǎn)化的土壤桿菌感染種子。
用土壤桿菌感染種子(共培養(yǎng))期間，黑暗處將種子一般保溫2-5天，優(yōu)選3天。此時的溫度，一般26-38℃，優(yōu)選28℃。接著，為了去除培養(yǎng)基中的土壤桿菌，用適當?shù)某鷦?例如羧芐青霉素)處理種子。以選擇標記(例如潮霉素抗性等抗藥性)為基準篩選轉(zhuǎn)化了的種子。
在適當?shù)某鷹l件和篩選條件下培養(yǎng)后，將篩選出的轉(zhuǎn)化種子轉(zhuǎn)移到含適當植物調(diào)節(jié)物質(zhì)的再生培養(yǎng)基(例如MS培養(yǎng)基)中，適當?shù)臅r間內(nèi)保溫。為了讓植物體再生，將再生了的轉(zhuǎn)化體移到發(fā)根培養(yǎng)基(例如不含植物調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS培養(yǎng)基)。確定發(fā)根后，將轉(zhuǎn)化體入盆。
導入植物的目的重組基因在植物體內(nèi)發(fā)揮預期的目的(例如表達期望的新性狀，或者調(diào)控某內(nèi)源性基因的表達)。
可用該領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法確認目的重組基因是否導入植物。例如，可用Northern blot分析進行確認。具體而言，從再生植物的葉中提取總RNA，經(jīng)變性瓊脂糖電泳后，點到適當?shù)哪ど稀Ｔ摪唿c上，導入基因的一部分與互補的標記的RNA探針雜交，由此檢測出目的基因的mRNA?；蛘?，希望通過導入目的重組基因來控制植物中內(nèi)源性基因的表達時，可用上述的Northern blot分析來檢測內(nèi)源性目的基因的表達。當內(nèi)源性目的基因的表達與非轉(zhuǎn)化的對照植物中該基因的表達被顯著抑制時，可確認目的重組基因?qū)肓酥参铮l(fā)揮表達調(diào)控的作用。
以往的方法中，在用土壤桿菌感染之前，通常有必要進行3-4周的去分化誘導。與此相對，本發(fā)明的方法，沒必要進行去分化誘導過程，所以可縮短制備轉(zhuǎn)化的單子葉植物所必要的時間。再者，依照本發(fā)明的方法，可縮短以往方法中篩選所需的時間，因此可減低培養(yǎng)變異的影響。
在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，制備轉(zhuǎn)化的單子葉植物所需的時間為50天，是以往土壤桿菌轉(zhuǎn)化法(例如參照下述實施例2)所必需時間(約90天)的三分之二以下。另外，依照本發(fā)明的方法，應用日本晴的種子時，轉(zhuǎn)化率為10-15％。用Dontokol、Kitaake等其它品種時也能得到同樣高的轉(zhuǎn)化率。因此，通過使用本發(fā)明的方法，可比以往的轉(zhuǎn)化方法更有效、迅速地制備出轉(zhuǎn)化植物。
(實施例)列舉以下實施例對本發(fā)明進行具體說明。本發(fā)明并不限定于此。若無其它特殊說明，實施例中所使用的試劑、材料等源自商業(yè)渠道。
實施例1應用本發(fā)明的方法進行水稻植物的轉(zhuǎn)化水稻的代表性品種為日本晴，將日本晴種子去皮后，在無傷狀態(tài)下，在2.5％次氯酸鈉(NaCIO)溶液中滅菌。用水充分洗滌后，將水稻進行以下無菌操作。
1.1預培養(yǎng)將種子撒到含2，4-D的N6D的培養(yǎng)基(30g/l蔗糖，0.3g/l酪蛋白氨基酸，2.8g/l脯氨酸，2mg/l 2，4-D，4g/l gellite，pH 5.8)上，27-32℃保溫5天。這期間種子發(fā)芽(圖1)。
1.2植物表達用載體用質(zhì)粒pIG121Hm(中村等，植物生物技術(shù)II，現(xiàn)代化學增刊，pp123-132，(1991))作轉(zhuǎn)化土壤桿菌用的植物表達用載體，該載體是將包含Ricinus的過氧化氫酶第1內(nèi)含子的GUS基因與潮霉素抗性基因連接的質(zhì)粒。用pIG121Hm轉(zhuǎn)化土壤桿菌EHA101(Hood等，J.Bacteriol.，1681291-1301(1986))。EHA101是輔助性質(zhì)粒的vir區(qū)域來自強病原性土壤桿菌A281的細菌。
1.3土壤桿菌感染將預培養(yǎng)的上述種子浸漬到轉(zhuǎn)化的土壤桿菌的懸浮液中，移植到2N6-AS培養(yǎng)基(，10g/l葡萄糖，0.3g/l酪蛋白氨基酸，2mg/l 2，4-D，10mg/l acetosyringon，4g/l gellite，pH 5.2)中，暗處28℃保溫共培養(yǎng)3天。
1.4除菌及篩選共培養(yǎng)完了后，用含羧芐青霉素的N6D培養(yǎng)基從種子中洗去土壤桿菌。接著在以下條件下篩選轉(zhuǎn)化了的種子。
第一次篩選將種子放置到含2mg/l補充了羧芐青霉素(500mg/l)和潮霉素(25mg/l)的2，4-D的N6D培養(yǎng)基上，再在27-32℃保溫7天。
第二次篩選將種子放置到含2-4mg/l補充了羧芐青霉素(500mg/l)和潮霉素(25mg/l)的2，4-D的N6D培養(yǎng)基上，再在27-32℃保溫7天。
1.5再生在以下條件下使篩選出的轉(zhuǎn)化種子再生。
第一次再生將篩選的種子放到再生培養(yǎng)基(補充了羧芐青霉素(500mg/l)和潮霉素(25mg/l)的MS培養(yǎng)基(30g/l蔗糖，30g/l山梨糖醇，2g/l酪蛋白氨基酸，2mg/l激動素，0.002mg/l NAA，4g/l gellite，pH5.8))，27-32℃保溫2周。
第二次再生使用與第一次再生相同的再生培養(yǎng)基，27-32℃再保溫2周。
1.6入盆將再生的轉(zhuǎn)化體移到發(fā)根培養(yǎng)基(補充了潮霉素(25mg/l)不含激素的MS培養(yǎng)基)上，確認發(fā)根后，入盆(圖2)。
實施例2用以往的方法轉(zhuǎn)化水稻植物為了與實施例1的方法進行比較，使用日本晴作為轉(zhuǎn)化材料，以往轉(zhuǎn)化水稻植物的方法如下進行。
2.1誘導愈傷組織將日本晴種子去皮后，滅菌，播種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基(含2mg/l2.4-D的N6D培養(yǎng)基)上，在亮處30℃保溫。從誘導開始大約4周后，使用來源于胚盤的增殖的愈傷組織進行轉(zhuǎn)化。
2.2轉(zhuǎn)化如實施例1那樣用植物表達用載體pIG121Hm轉(zhuǎn)化土壤桿菌EHA101，用它感染所得愈傷組織，在2N6-AS培養(yǎng)基上，暗處28℃保溫共培養(yǎng)3天。
2.3除菌及篩選用含500mg/l羧芐青霉素的N6D培養(yǎng)基從愈傷組織中洗去土壤桿菌。接著在以下條件下篩選轉(zhuǎn)化了的愈傷組織。
第一次篩選將愈傷組織放置到含2-4mg/l補充了羧芐青霉素(500mg/l)和潮霉素(25mg/l)的2，4-D的N6D培養(yǎng)基上，再在27-32℃保溫2周。
第二次篩選將愈傷組織放置到含2-4mg/l補充了羧芐青霉素(500mg/l)和潮霉素(25mg/l)的2，4-D的N6D培養(yǎng)基上，再在27-32℃保溫2周。
2.4再生、發(fā)根及入盆在與實施例1同樣的條件下使篩選出的轉(zhuǎn)化種子再生、入盆。
2.5結(jié)果用以往的方法進行轉(zhuǎn)化的實施例與用本發(fā)明的方法進行轉(zhuǎn)化的實施例進行比較的結(jié)果如圖3所示。播種后到入盆所必需的日期是，以往的方法中約90天，而本發(fā)明的方法中約50天(圖3(a))。在播種后第50天的時間點進行比較，本發(fā)明方法中的轉(zhuǎn)化體已達到可入盆的狀態(tài)，而以往的方法中，轉(zhuǎn)化體還處于再生過程(圖3(b))?？傊?，本發(fā)明的方法將轉(zhuǎn)化所需的時間縮短到以往的約三分之二以下。
產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明提供改良的、土壤桿菌介導的單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的方法中，用包含所需的重組基因的土壤桿菌感染打算用于轉(zhuǎn)化的植物的無傷的種子。通過使用本發(fā)明，可更有效且迅速地制備出轉(zhuǎn)化植物。
權(quán)利要求
1轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法，它包含用含有所需重組基因的土壤桿菌感染無傷種子的步驟。
2權(quán)利要求1的方法，其中的種子是播種后第4-5天的種子。
3權(quán)利要求2的方法，其中的種子是發(fā)芽的種子。
4權(quán)利要求3的方法，其中單子葉植物是水稻科植物。
5權(quán)利要求4的方法，其中水稻科植物是水稻。
全文摘要
單子葉植物的土壤桿菌轉(zhuǎn)化方法,它包含用含有所需的重組基因的土壤桿菌感染無傷種子的步驟。
文檔編號C12N15/82GK1352522SQ99816766
公開日2002年6月5日 申請日期1999年7月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月22日
發(fā)明者田中宥司, 萱野曉明, 宇垣正志, 鹽原文緒, 澀谷直人, 小野寺治子, 小野和子, 田切明美, 西澤八重子 申請人:農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物資源研究所所長