專利名稱：作為pak65配體的chp多肽的制作方法
發(fā)明的背景Pho GTP酶(Rac，Cdc42Hs和Rho)參予調(diào)節(jié)包括轉(zhuǎn)錄激活、生長控制和細(xì)胞形態(tài)學(xué)再組織在內(nèi)的多種生物學(xué)反應(yīng)(Hall et al.，Science，1998，279509-514和Van Aelst et al.，Genes Dev.，1997，112295-2322)。將這些GTP酶微量注射到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，證明Cdc 42Hs參予絲足的形成(Nobes et al.，Cell，1995，8153-62和Kozma et al.，Mol.Cell Biol.，1995，151942-1952)和Rac的活化以誘導(dǎo)片狀偽足，然后激活Rho以誘導(dǎo)應(yīng)力纖維(Ridleyet al.，Cell，1992，70401-410)。在過去的幾年里，已鑒定了這些GTP酶的多種不同的下游分子靶。這些靶與GTP酶的活化GTP結(jié)合形式相互作用。已顯示Cdc42Hs和Rac可與下列分子特異地相互作用WASP(Aspenstrom et al.，Curr Biol.，1996，670-75；Symonset al.，Cell，1996，84723-734；和Kolluri et al.，Proc.Natl.Acad Sci.，1996，936515-6518)、IQGAP(Hart et al.，EMBO J.，1996，152997-3005；和Kurodas et al.，J.Biol.Chem.，1996，27123363-23367)、POSH(Tapon et al.，EMBO J.，1998，171395-1404)、PORI(Van Aelst et al.，EMBO J.，1996，1153778-3786)、p67-phox(Diekmann et al.，Science，1994，265531-533)、MLK3(Teramoto et al.，J.Biol.Chem.，1996，27127225-27228)和PAK(Maser et al.，Nature 1993，363364-357；Martinet al.，EMBO J.，1995，141997-1978；和Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.，1995，27027995-27998)。p21活化的激酶(PAK)是GTP酶Rac和Cdc42Hs的下游效應(yīng)物之一(Maser et al.，Nature，1993，363364-367；Martin et al.，EMBO J.1995，141997-1998；Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.，1995，27027995-27998；以及Sells et al.，Trends Cell Biol.1997，71623-1627)。GTP酶的GTP結(jié)合形式通過一個(gè)保守的GTP酶結(jié)合區(qū)(GBD)與PAK相互作用，并繼之刺激Pak活性(Maser et al.，Nature 1993，363364-367；Martin et al.，EMBO J.1995，141997-1998；Bagrodia etal.，J.Biol.Chem.，1995，27027995-27998，和Sells et al.，Trends Cell Biol.，1997，71623-1627)。已鑒定出3個(gè)哺乳動(dòng)物PAK包括PAK1，2個(gè)小鼠PAK3和3個(gè)大鼠類似物PAKα、β及γ(Sells et al.，Trends Cell Biol.，1997，71623-1627)。
所有的PAK均含有調(diào)節(jié)區(qū)(PakR)和與酵母STE20緊密相關(guān)的高度保守的激酶區(qū)(Sells et al.，Trends Cell Biol.，1997，71623-1627)。RakR含有GBD和對(duì)于同含有SH3區(qū)域的蛋白質(zhì)相互作用十分重要的聚脯氨酸序列(Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.，1995，27027995-27998)。酯母同系物STE20是參予激活釀酒酵母中MAP激酶級(jí)聯(lián)的蛋白質(zhì)激酶，對(duì)該同系物的研究揭示了其對(duì)PAK功能的可能作用。幾個(gè)研究小組的結(jié)果顯示，哺乳動(dòng)物PAK可激活JNK MAP激酶級(jí)聯(lián)(Minden et al.，Cell 1995，81147-157和Coso et al.，Cell 1995，811137-1146)，并且最近對(duì)Rac和Cdc42Hs效應(yīng)物突變體的研究提示，PAK對(duì)于JNK活化是必不可少的(Lamarche et al.，Cell 1996，87519-529)。PAK是Rac和Cdc42Hs的效應(yīng)物這一事實(shí)提示，它們?cè)谡{(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的再組織中也可能起作用。有幾篇報(bào)導(dǎo)證明向病灶性復(fù)合體及片狀偽足補(bǔ)充PAK，但這些作用并不依賴于PAK激酶活性和與Cdc42Hs或Rac的相互作用(Dharmawardhaneet al.，J.Cell Biol.1997，1381265-1278；Sells et al.，Curr.Biol.1997，7202-210和Manser et al.，Mol.Cell Biol.1997，171129-1143)。此外，不與PAK相互作用的Rac和Cdc42Hs的效應(yīng)物突變體能夠促進(jìn)誘生片狀偽足和絲狀假足(Lamarche et al.，Cell1996，87519-529)。
Pak2通過其富脯氨酸序列與NCK的SH3區(qū)(Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.1995，27027995-27998)和Grh2相互作用。最近，Manser等人(Mol.Cell 1998，1183-192)證明，PakR含有獨(dú)特的脯氨酸序列，其可與新的GTP/GDP交換因子—PIX的SH3區(qū)域結(jié)合。提示PIX/PAK相互作用對(duì)于PAK與病灶性復(fù)合體的結(jié)合是重要的(Manser et al.，Mol.Cell 1998，1183-192)。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及與蛋白激酶相互作用并類似于Rho家族成員的新一類細(xì)胞信號(hào)蛋白質(zhì)的核酸、多肽及其片段。本發(fā)明特別涉及新的人類蛋白質(zhì)Chp，它是一種可調(diào)節(jié)PAK和JNK活性、與JNK MAP激酶級(jí)聯(lián)相互作用、調(diào)整細(xì)胞骨架活性及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及在治療、診斷和研究中使用這樣的核酸和多肽的方法。例如，可利用Chp的核酸和多肽鑒定其活性調(diào)制劑，發(fā)展模擬人類疾病的動(dòng)物模型。本發(fā)明還涉及Chp的配體，如多肽、抗體和核酸。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1顯示編碼全長度人Chp的核苷酸和氨基酸序列。
圖2是人Chp、Cdc42和Rac1間的比較。
發(fā)明的詳細(xì)說明已鑒定了編碼一類新的Cdc42Hs相關(guān)蛋白質(zhì)Chp的新的核酸及多肽序列。Chp具有下列一種或多種生物學(xué)活性PAK調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、GTP酶活性、GTP/GDP結(jié)合活性、細(xì)胞骨架再組織活性、高爾基體導(dǎo)向和保留信號(hào)活性、調(diào)節(jié)含有細(xì)胞骨架再組織所需成分之小泡供應(yīng)的活性，或Chp特異性免疫原活性。
PAK調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合活性是指，例如，全長度Chp或其生物學(xué)活性多肽片段與GTP酶Rho家族下游效應(yīng)物之PAK(p21活化的激酶)家族，如Rac和Cdc 42Hs的多肽序列相互作用(如結(jié)合或附著)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)區(qū)是PakR(或“PakR調(diào)節(jié)區(qū)”)，其為與酵母STE20相關(guān)的并可得自PAK2的高度保守的激酶區(qū)域(參見，例如，Manser，E.，Leun，T.，Salihuddin，H.，Tan，L.，and Lim，L，A non-receptortyrosine kinase that inhibits the GTPase activity of p21cdc42，Nature 1993，363364-367；Martin，G.A.，Bollag，G.McCormick，F(xiàn).，and Abo，A，A novel Serine Kinase activated byracl/CDC42Hs-dependent autophosphorylation is related to PAK65and STE20，EMBO J.1995，141970-1978；Bagrodia，S.，Derijard，B.，Davis，R.J.，and Cerione，R.A.，Cdc 42 and PAK-mediatedsignaling leads to Jun Kinase and p38 mitogen-activated proteinKinase activation，J.Biol.Chem.1995，27027995-27998；Sells，M.A.and Chernof，J.Emerging from the Pak；the p21-activated Protein Kinase family，Trends Cell Biol.1997，7162-167)。
PakR可能包括GTP酶結(jié)合區(qū)(GBD)和聚脯氨酸序列(參見Bagrodiaet al.，J.Biol.Chem.1995，27027995-27998)。Chp結(jié)合區(qū)對(duì)于同PakR結(jié)合和刺激PAK激酶活性可能是有效的，如激動(dòng)劑；或者，其可導(dǎo)致Chp多肽與PakR的結(jié)合，而不刺激PAK激酶活性，如拮抗劑。同樣，Chp可能直接對(duì)JNK或?qū)χ虚g體具有JNK調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合活性。更一般地說，Chp對(duì)其它蛋白質(zhì)，包括與PAK、JNK、MAP激酶或由它們衍生的合成多肽具有結(jié)合活性和/或刺激活性。
可常規(guī)檢測(cè)結(jié)合活性。例如，可利競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)鑒定化合物，如附著于Chp多肽上的多肽或抗體或其衍生物?？稍谟行Оl(fā)生結(jié)合的條件下使Chp多肽，PakR調(diào)節(jié)區(qū)與待試驗(yàn)底物結(jié)合活性的化合物(配體)組合。該試驗(yàn)可在液相中完成，其中由膜將已結(jié)合的和游離的配體分開；或者需要時(shí)，測(cè)定可在固相中完成。可使用高物料通過量方法，例如在芯片、晶片上進(jìn)行固相測(cè)定。也可使用下文實(shí)施例中所述的基于細(xì)胞的功能性測(cè)定法，其中將Chp符合讀框的融合到質(zhì)膜導(dǎo)向信號(hào)上并使PakR符合讀框的融合到Ras上，并且其與Chp多肽間的有效結(jié)合可拯救細(xì)胞存活性。
“PAK激酶刺激活性”是指，例如，全長度Chp或其生物學(xué)活性片段使PAK家族成員產(chǎn)生蛋白質(zhì)激酶活性的能力。如下文和實(shí)施例中解釋的，可通過正常人Chp或活化的Chp介導(dǎo)刺激活性。可在體內(nèi)，或者可通過改變Chp的氨基酸序列實(shí)現(xiàn)激活。刺激作用可以是直接或間接的。例如，一般認(rèn)為GTP酶的GTP結(jié)合形式通過保守的GTP酶結(jié)合區(qū)(GBD)和聚脯氨酸序列與PAK家族及其它激酶相互作用。當(dāng)這種相互作用是“有效的”時(shí)，即可刺激激酶活性。雖然不拘泥于任何理論，但認(rèn)為Chp可能通過與PAK中的特異性區(qū)域如PakR結(jié)合，產(chǎn)生或刺激PAK中的激酶活性。因此，PAK刺激活性可包括與PAK直接結(jié)合。如上文提到的，可將結(jié)合活性與激酶刺激活性分離開。
JNK激酶刺激活性是指，例如，全長度Chp或其生物學(xué)活性片段產(chǎn)生、導(dǎo)致或誘導(dǎo)JNK的蛋白激酶活性和/或p38 MAP激酶途徑的能力(Minden et al.，Cell，811147-1157，1995；Coso et al.，Cell，811137-1146，1995)。這種刺激活性對(duì)JNK比ERK或p38更具選擇性，即Chp并不能顯著地誘導(dǎo)p38或ERK激酶活性。如圖1中所示的正常人Chp或激活形式的人Chp可按JNK MAP激酶途徑誘導(dǎo)激酶活性?？赏ㄟ^PAK介導(dǎo)JNK途徑激活。
可按照下列實(shí)施例中所述的常規(guī)方法(如參見Bagrodia et al.，J.Biol.Chem.27027995-27998，1995；Coso et al.，Cell 811137-1146，1995)檢測(cè)激酶活性。
全長度Chp或其生物學(xué)活性多肽片段也可具有GTP/GDP結(jié)合和/或GTP酶活性。可按照所提到的參考文獻(xiàn)中描述的常規(guī)方法(也參見Bourne et al.，Nature 349117-129，1991)檢測(cè)這些活性。
另外，全長度Chp或其生物學(xué)活性多肽片段可具有細(xì)胞骨架再組織活性。這種活性意味著，例如，Chp多肽，特別是活化的Chp有能力調(diào)節(jié)細(xì)胞之肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的聚合，包括產(chǎn)生局部復(fù)合體，質(zhì)膜、粘附纖維、應(yīng)力纖維、片狀偽足及絲足處的局部復(fù)合體(如參見Nobesand Hall，Cell 8153-62，1995；Symons et al.，Cell 84723-734)?？墒褂贸Ｒ?guī)試劑，在向靶細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入Chp或其編碼核酸后觀察細(xì)胞骨架以常規(guī)檢測(cè)這種活性(也參見下列實(shí)施例)。
術(shù)語“Chp特異性免疫原活性”是指Chp多肽引發(fā)對(duì)Chp有選擇性的免疫學(xué)反應(yīng)。這種反應(yīng)可以是細(xì)胞的或體液的。因此，選自哺乳動(dòng)物Chp多肽，如圖1中所示的人Chp氨基酸序列對(duì)抗體、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹狀細(xì)胞等的刺激作用為特異性免疫原活性?？捎贸Ｒ?guī)方法檢測(cè)這些反應(yīng)。例如參見下文所述的抗結(jié)合KLH之C末端肽的Chp特異性抗體。
哺乳動(dòng)物Chp如人Chp是具有可得自天然來源的氨基酸序列并具有上述一種或多種活性的哺乳動(dòng)物多肽。其可以是全長度的(即如圖1中所示，具有以起始密碼子開始并以終止密碼子結(jié)束的氨基酸序列)，或者是小于全長度并有生物學(xué)活性的。因此其包括天然存在的正常、突變、多態(tài)等序列。天然來源包括如得自組織或整個(gè)生物體、培養(yǎng)的細(xì)胞系(包括原代和無限增殖化細(xì)胞系、活體解剖組織等)的活細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及全長度哺乳動(dòng)物Chp的片段。該片段最好是有“生物活性”的?！吧锘钚浴笔侵付嚯钠卧诨钕到y(tǒng)中具有活性或有活系統(tǒng)的成分。生物學(xué)活性包括上面提到的那些，例如，PAK調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性，GTP酶活性，GTP結(jié)合活性，細(xì)胞骨架再組織活性，或Chp特異性免疫原活性?？梢园凑杖魏芜m宜的方法制備片段，包括化學(xué)合成、遺傳工程、切割產(chǎn)物等(見下文)。Chp的生物學(xué)片段包括已在蛋白質(zhì)的羧基或氨基末端除去或修飾了氨基酸序列，例如從其前體形式加工成“成熟”形式的Chp。
本發(fā)明還涉及具有如圖1所示推測(cè)的氨基酸1至236之序列的人Chp。236氨基酸多肽具有大約36kDa的分子量。其包括以下區(qū)域大約在氨基酸1-32處的獨(dú)特Chp區(qū)域；在氨基酸32-211處的與CDC42和Rac GTP酶有關(guān)的GTP酶區(qū)域；在大約氨基酸211-236處的PAK調(diào)節(jié)結(jié)合區(qū)域活性(包括直接結(jié)合或構(gòu)象效應(yīng))。
可以用已知方法分析本發(fā)明的如具有圖1中所示氨基酸序列的Chp多肽，以鑒定多肽中包括跨膜區(qū)、疏水區(qū)等的其它結(jié)構(gòu)和/或功能區(qū)。例如，可利用Kyte和Doolittle(J.Mol.Biol.157105，1982；EMBL Protein Predict)、Rost和Sander(Proteins，1955-72，1994)公開的方法分析Chp多肽。
可按照各種方法制得哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物來源的其它Chp同系物。例如，可以按例如Sambrook等人(Molecular Cloning，1989，第11章)所述的方法，與選自人Chp之核苷酸序列的寡核苷酸雜交，以從其它種生物體中選擇同系物。這些同系物可以與Chp有不同量的核苷酸和氨基酸序列相同性和相似性。哺乳動(dòng)物生物體包括，例如，嚙齒動(dòng)物小鼠、大鼠、倉鼠，以及猴、豬、牛等。非哺乳動(dòng)物生物體包括，例如，脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、斑馬魚、雞、果蠅、雅致酵母，非洲爪蟾、粟酒裂殖酵母、釀酒酵母、線蟲、原核生物、植物、擬南芥、病毒等。
本發(fā)明還涉及Chp特異性氨基酸序列，如圖1所示的見于人體的但非Chp多肽的其它氨基酸序列中沒有的特定氨基酸序列?？梢员容^相關(guān)的蛋白質(zhì)以選擇對(duì)Chp特異的序列(也參見圖2)?？墒褂糜?jì)算機(jī)程序BLAST系統(tǒng)檢索基因/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，以常規(guī)發(fā)現(xiàn)特異性氨基酸序列?？衫肅hp特異性氨基酸序列制得抗原肽，以產(chǎn)生對(duì)其特異的免疫反應(yīng)?？捎萌绱嗣庖叩玫降目贵w作為哺乳動(dòng)物Chp蛋白的探針，用于診斷或研究目的。Chp特異性氨基酸序列如包括圖1中列出的氨基酸4-32、216-234、216-224和229-234。
如上所述，本發(fā)明的多肽可包括Chp的完整氨基酸序列(即根據(jù)帶有起始和終止密碼子的核苷酸序列確定的全長度)、成熟氨基酸序列(即作為前體產(chǎn)生的Chp多肽被加工成成熟多肽，類似于對(duì)Ras進(jìn)行的肽加工(如參見Gelb，Science 2751750-1751，1997)，或其片段。有用的片段包括含有任一上述區(qū)域及Chp特異性氨基酸序列或基本上由其組成的片段。
可以選擇具有特異性生物學(xué)活性，如PAK調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、GTP酶活性、GTP結(jié)合活性、細(xì)胞骨架再組織活性，或Chp特異性免疫原活性的Chp多肽片段?？梢栽囼?yàn)這些片段的所需活性以常規(guī)鑒定有用的片段。下文和實(shí)施例中描述了這些活性的檢測(cè)。也可按EP 496162中所述方法鑒定并制備這些肽。有用的片段可包括圖1所示的大約9個(gè)連續(xù)的氨基酸，優(yōu)選約10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)或30個(gè)連續(xù)的氨基酸或基本上由這些氨基酸組成。
本發(fā)明的多肽也可以有100％或不足100％氨基酸序列相同于圖1中列出的氨基酸序列。為了便于以下的討論序列相同性是指在被比較序列的相應(yīng)位置上發(fā)現(xiàn)有如圖1中所示序列中的相同核苷酸或氨基酸。與圖1所示氨基酸序列有小于100％序列相同性的多肽可能含有對(duì)天然存在序列的各種不同的取代，包括同源和非同源氨基酸取代。例如參見下示的同源氨基酸取代。將相同和同源殘基的總和除以被比較的Chp多肽序列中殘基的總數(shù)等于百分序列相似性。為了計(jì)算序列相同性和相似性，可按照任何所需的方法，算法，例如，包括使用FASTA、BLASTA計(jì)算機(jī)程序等對(duì)比并計(jì)算被比較的序列。與圖1的氨基酸序列具有小于100％氨基酸序列相同性的多肽可能有大約99％、98％、97％、95％、90％、70％，甚至低至大約53％的序列相同性。優(yōu)選百分率的氨基酸序列相同性為大約87％或更多，例如88％，89％(詳見下文關(guān)于突變或突變蛋白的討論)。
本發(fā)明還涉及Chp多肽突變蛋白，即氨基酸序列不同于得自天然來源之氨基酸序列的任何多肽(哺乳動(dòng)物Chp的片段在其氨基酸序列上不同于天源存在的Chp)。因此，Chp突變蛋白包括氨基酸取代、插入和缺失，其中還有非天然存在的氨基酸。
也可按照從基因數(shù)據(jù)庫(如Genbank，EMBL)檢索的同源性制備本發(fā)明Chp氨基酸序列的突變蛋白?？墒褂糜?jì)算機(jī)程序BLAST家族中所述的算法、Smith-Waterman算法等多種方法進(jìn)行序列同源性檢索?？梢澡b定并對(duì)比在多肽間有相同和/或同源序列的區(qū)域內(nèi)的氨基酸，然后基于這種序列對(duì)比修飾氨基酸，以在序列中引入突變蛋白。例如，圖2中顯示了人Chp、Cdc42和Rac1之間的序列比較。這些序列對(duì)比揭示出彼此相同和不同的氨基酸位置，提供了關(guān)于可望降低、減小或消除Chp之生物學(xué)活性的氨基酸取代的信息。例如，當(dāng)序列對(duì)比揭示在兩個(gè)或多個(gè)區(qū)域之間保守的相同氨基酸時(shí)，去除或取代氨基酸預(yù)計(jì)將會(huì)對(duì)其生物學(xué)活性造成不利影響。
可用另一個(gè)氨基酸取代一個(gè)同源的氨基酸以造成氨基酸取代?？梢曰趥?cè)鏈的大小和極性化程度來限定同源的氨基酸，其中包括小的非極性氨基酸半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸；小的極性氨基酸絲氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；大的極性氨基酸谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸；中等極性氨基酸酪氨酸、組氨酸、色氨酸；大的非極性氨基酸苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸。也可以對(duì)同源氨基酸進(jìn)行如下分組不帶電荷的極性R組甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；酸性氨基酸(帶負(fù)電荷的)天冬氨酸和谷氨酸；堿性氨基酸(帶正電荷的)賴氨酸、精氨酸、組氨酸。同源氨基酸還包括Dayhoff(Atlas ofProtein Sequence and Structure 5(1978)，和Argos(EMBO J.，8，779-785，1989)所述的那些。
本發(fā)明的突變蛋白包括Chp序列中的殘基被Cdc42或Rac1之相應(yīng)區(qū)域的同源殘基取代所形成的氨基酸序列(如參見圖2)。
因此，本發(fā)明涉及圖1的Chp核苷酸序列，其中所說的核酸編碼其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置被取代或缺失或有這兩種情況的多肽，并且由該核酸編碼的多肽具有PAK調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、GTP酶活性、CTP結(jié)合活性、細(xì)胞骨架再組織活性，或Chp特異性免疫原活性。例如，Chp多肽突變蛋白及其相應(yīng)的核苷酸編碼序列，可具有如圖1所示的氨基酸序列，不同的是可有一個(gè)或多個(gè)位置被同源氨基酸取代，例如可有1、5、10、15或20處取代。本發(fā)明還涉及突變蛋白多肽和編碼這些多肽的突變蛋白核酸?？砂瓷鲜龅模率龅暮捅绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢測(cè)修飾作用對(duì)上述活性的影響程度。
如上所述，也可基于與相關(guān)蛋白質(zhì)如Cdc42和Rac1的相似之處來造成氨基酸取代。例如，用纈氨酸取代40位上的甘氨酸(G40V)，產(chǎn)生組成上有活性的或激活形式的Chp。術(shù)語“激活形式的人Chp多肽，或其生物學(xué)活性片段”是指具有天然可獲得之序列的人Chp多肽，其可以是天然存在的具有組成活性或天然序列(其已經(jīng)被修飾而產(chǎn)生組成上有活性的多肽)的突變體。經(jīng)修飾的多肽例如可以是上述的G40V突變體多肽。術(shù)語“組成上有活性的”或“激活的”是指多肽序列及其處于“開啟”狀態(tài)的修飾形式。上下文中所提到的JNK刺激活性、激活形式的人Chp多肽或其片段，應(yīng)是可刺激JNK激酶途徑的多肽。G40V突變即是這樣的一個(gè)例子?？尚揎椈蛘T變Chp，并按下述方法和實(shí)施例檢測(cè)激酶活性以選擇那些刺激JNK途徑的突變。
可用天冬酰胺取代45位上的絲氨酸(S45D)，以制備另一個(gè)突變體。該突變產(chǎn)生顯性失活等位基因，鎖定GDP結(jié)合的無活性形式。與G40V突變相比，這種突變所得到的是無活性的Chp?；谂cCdc42和其它Rho GTP酶的同源性而導(dǎo)入這些及其它取代。因此，可以基于這些同源性制成突變；可以按下列方法和實(shí)施例中所述常規(guī)選擇所需的活性，如增強(qiáng)的、激活的、降低的活性、無活性等。
哺乳動(dòng)物Chp全長度多肽、其片段或取代的多肽還可包括各種修飾，這些修飾可以是脂質(zhì)修飾、甲基化、磷酸化、糖基化、共價(jià)修飾(如氨基酸R基團(tuán)的修飾)、氨基酸取代、氨基酸缺失，或氨基酸加入。可以按照重組、合成、化學(xué)等各種方法對(duì)多肽進(jìn)行修飾。
本發(fā)明的多肽(如人Chp，其片段或突變體)可以各種方式使用例如，作為免疫原用于檢測(cè)抗體(如下所述)，或作為生物學(xué)活性劑(如具有與Chp有關(guān)的一種或多種活性)。
編碼Chp、其衍生物或其片段的核苷酸可以按一種自然界中并不存在的，即不是天然存在的排布，例如，作為人Chp基因，作為從活生物體如動(dòng)物，優(yōu)選人、小鼠等哺乳動(dòng)物體內(nèi)或其細(xì)胞系的基因組中制備的基因片段，與一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)、功能區(qū)、可檢測(cè)區(qū)、抗原區(qū)和/或所需的有用多肽相結(jié)合。包括這些特征的多肽為嵌合或融合多肽?？捎没瘜W(xué)、合成、準(zhǔn)合成和/或重組方法等各種方法制備這種嵌合多肽。編碼嵌合多肽的嵌合核酸可在連續(xù)的(如有多重N末端區(qū)域，用以穩(wěn)定或增強(qiáng)活性)或間斷的可讀框(如含有內(nèi)含子、剪接位點(diǎn)、增強(qiáng)子等)中含有各種區(qū)域或所需的多肽。可按照各種方法生產(chǎn)嵌合核酸(如參見美國專利5,439,819號(hào))。一個(gè)區(qū)域或所需的多肽可具有任何所需的性質(zhì)，其中包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長促進(jìn)、細(xì)胞導(dǎo)向(如信號(hào)序列、導(dǎo)向序列，如導(dǎo)向高爾基體或內(nèi)質(zhì)綱)等生物學(xué)功能，如疏水、親水、跨膜等結(jié)構(gòu)功能，受體—配體功能，和/或可檢測(cè)的功能，如與酶、螢光多肽、綠色螢光蛋白相結(jié)合(Chalfie et al.，1994，Science 263802；Cheng et al.，1996，Nature Biotechnology 14606；Levyet al.，1996，Nature Biotechnology 14610等)。此外，可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，使用多肽或其部分作為可選擇標(biāo)志。例如，可使編碼本發(fā)明的氨基酸序列的核酸與所需的編碼序列進(jìn)行符合讀框的融合及為了純化、選擇或標(biāo)記目的而用作為標(biāo)記物。融合的區(qū)域可編碼有利于表達(dá)、分離及純化等的切割位點(diǎn)。
可按照本發(fā)明，在表達(dá)系統(tǒng)中，于體內(nèi)或體外利用無細(xì)胞體系、重組體、細(xì)胞融合體等生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。這些系統(tǒng)可提供的對(duì)多肽修飾包括糖基化、氨基酸取代(例如借助不同的密碼子使用)、多肽加工如消化、切割、內(nèi)肽酶或外肽酶活性，以及與化學(xué)部分(包括脂質(zhì)和磷酸等)結(jié)合。
可按照常規(guī)方法從天然來源，被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(培養(yǎng)基或細(xì)胞)中回收本發(fā)明的多肽。所說的方法包括去污劑提取(如CHAPS、辛基糖苷)、硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、羥基磷灰石層析及凝集素層析。為了完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型，必要時(shí)可使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最后，純化步驟中可利用高效液相層析(HPLC)。也可按本領(lǐng)域已知的分離GTP酶的方法分離Chp多肽。
哺乳動(dòng)物Chp核酸或其片段是具有得自天然來源之核苷酸序列的核酸(如前所述)。因此其包括天然存在的，正常的、突變的、多態(tài)的等位基因等。天然來源包括例如得自組織和整個(gè)生物體及培養(yǎng)的細(xì)胞系(包括原化和無限增殖化細(xì)胞系)的活細(xì)胞。
人Chp是作為約1.5Kb的單一mRNA表達(dá)的。其在腦和睪丸中最為豐富，同時(shí)在脾和肺中表達(dá)量較低。因此，可使用Chp作為組織切片中(使用Chp特異性抗體或Chp特異性核酸探針)，在進(jìn)行活組織檢查的樣品等中存在腦和睪丸的標(biāo)志。
圖1中顯示哺乳動(dòng)物Chp的人等位基因的核酸序列。其含有236個(gè)氨基酸的可讀框。如圖1中所示，其含有5′未翻譯序列和3′未翻譯序列。本發(fā)明的核酸序列可含有從氨基酸1至氨基酸236的完全編碼序列、其簡(jiǎn)并序列及其片段。本發(fā)明的核酸也可包括與上文和下文中提到的任何核苷酸序列100％互補(bǔ)的核苷酸序列，如反義序列。
本發(fā)明核酸可得自各種不同的來源。其可得自，例如從組織、細(xì)胞或整個(gè)生物體分離的DNA或RNA，如聚腺苷酸化的mRNA。核酸可直接得自DNA或RNA，或得自cDNA庫。核酸可得自處于特定發(fā)育階段的，有預(yù)期基因型和表型的細(xì)胞(如胚胎或成人心臟細(xì)胞或組織)等。
就上面提到的Chp多肽來說，包括編碼本發(fā)明之多肽的核苷酸序列的核酸可以只包括編碼序列；包括編碼序列和附加編碼序列(如編碼前導(dǎo)、分泌、導(dǎo)向、酶促、熒光或其它診斷肽的序列)、編碼序列和非編碼序列(如位于5′或3′末端或分散于編碼序列中的未翻譯序列，如內(nèi)含子)。包括不間斷地編碼多肽的核苷酸序列的核酸是指含有Chp的氨基酸編碼序列，同時(shí)沒有干擾或破壞該編碼序列的非編碼核苷酸，即沒有內(nèi)含子的核苷酸序列。這樣的核苷酸序列也可以說是無隔的可以常規(guī)制得編碼人或其它哺乳動(dòng)物Chp的基因組DNA。
本發(fā)明的核酸也可包括與上述核酸可操作地連接的表達(dá)控制序列?！氨磉_(dá)控制序列”是指與表達(dá)多肽的核酸可操作地連接的控制表達(dá)的核酸序列?？稍趍RNA或多肽水平上調(diào)節(jié)表達(dá)。因此，表達(dá)控制序列包括mRNA相關(guān)元件和蛋白質(zhì)相關(guān)元件。這樣的元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子(病毒或細(xì)胞的)、核糖體結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄終止子等。表達(dá)控制序列可操作地連接到核苷酸編碼序列上，當(dāng)以這種方式定位表達(dá)控制序列時(shí)，即可進(jìn)行或?qū)崿F(xiàn)編碼序列的表達(dá)。例如，當(dāng)啟動(dòng)子被可操作地連接到編碼序列的5′端時(shí)，啟動(dòng)子即驅(qū)動(dòng)編碼序列的表達(dá)。對(duì)于正?；?，表達(dá)控制序列可以是異源(外源)的或內(nèi)源的。
可以基于核酸雜交來選擇本發(fā)明的核酸。可根據(jù)兩條單鏈核酸制品雜交在一起的能力，如核苷酸A-T、G-C等之間的堿基配對(duì)能力，確定它們核苷酸序列互補(bǔ)性。因此本發(fā)明還涉及與包括圖1中所示核苷酸序列的核酸雜交的核酸，及其互補(bǔ)序列。與后者雜交的核苷酸序列將具有互補(bǔ)核酸鏈，或者可在聚合酶(即適當(dāng)?shù)暮怂岷铣擅?存在下用作模板。本發(fā)明包括核酸的兩條鏈，如有意義鏈和反義鏈。
可以選擇使用雜交條件，以篩選與圖1所示的核苷酸序列有一定量核苷酸互補(bǔ)性的核酸。能夠與這樣的序列雜交的核酸序列間具有，例如約85％，優(yōu)選約90％、92％，更優(yōu)選約95％、97％或100％互補(bǔ)性。本發(fā)明特別涉及在低或高度嚴(yán)格條件下與圖1所示核苷酸序列雜交的核酸序列。
可以用各種方法選擇與Chp序列雜交的核酸。例如可在預(yù)雜交溶液(6×SSC、0.5％SDS、100μg/ml變性的鮭魚精子DNA、5×Denhardt’s溶液和50％甲酰胺)中，將印跡(即含有核酸的基質(zhì))、芯片陳列及其它含有用核酸的基質(zhì)30℃保溫過夜，然后在雜交溶液(如6×SSC、0.5％SDS、100μg/ml變性的鮭魚精子DNA和50％甲酰胺)中，按照已知方法于42℃下與可檢測(cè)的Chp探針(見下文)雜交過夜。在允許小于5％bp錯(cuò)配，即選擇有95％或更高序列相同性的高度嚴(yán)格條件下洗印跡(例如，65℃在0.1％SSC和0.1％SDS中洗兩次，計(jì)30分鐘)。高度嚴(yán)格條件的其它非限制性例子包括最后于65℃在含有30mM NaCl和0.5％SDS的含水緩沖液中洗滌。高度嚴(yán)格條件的另一個(gè)例子是在7％SDS、0.5M NaPO4，pH7，1mM EDTA中50℃雜交過夜，然后于42℃用1％SDS溶液洗一次或多次。本文所述的激活的Chp和顯性失活Chp序列，在前述高度嚴(yán)格條件下與圖1所示的野生型核酸序列及其寡核苷酸探針雜交。高度嚴(yán)格洗滌可允許小于5％的錯(cuò)配，但松弛或低嚴(yán)格洗滌條件(例如在0.2％SSC和0.5％SDS中37℃洗兩次，30分鐘)則允許達(dá)到20％的錯(cuò)配。低嚴(yán)格條件的另一個(gè)非限制性實(shí)例包括最后在含有30mM NaCl和0.5％SDS的緩沖液中42℃洗滌。
也可以按照Sambrook等人(Molecular Cloning，1989，第9章)所述的方法進(jìn)行洗滌和雜交。按照Sambrook等人上述文獻(xiàn)中所述，也可基于計(jì)算探針和其靶之間形成之雜合體的熔解溫度(Tm)進(jìn)行雜交?？蛇x擇嚴(yán)格條件，以分離探針(如Chp的寡核苷酸)和靶核酸(Chp突變蛋白或同系物)之間具有，例如至少大約95％，優(yōu)選97％核苷酸互補(bǔ)性的序列，及其互補(bǔ)序列。
根據(jù)本發(fā)明，核酸或多肽可以包括與圖1中列出的核苷酸或氨基酸序列有一處或多處差異?？捎萌魏我阎椒?，如定點(diǎn)或隨機(jī)誘變方法對(duì)核苷酸和/或氨基酸進(jìn)行改變或修飾。
編碼本發(fā)明的人Chp的核酸可包括在天然存在的Chp基因中出現(xiàn)的核苷酸，如天然存在的多態(tài)性、正?；蛲蛔兊牡任换?核苷酸或氨基酸)、見于天然哺乳動(dòng)物群體(如人、猴、豬、小鼠、大鼠或兔)中的突變。術(shù)語“天然存在”是指可從天然來源如動(dòng)物組織和細(xì)胞、體液、組織培養(yǎng)細(xì)胞和法醫(yī)學(xué)樣品得到的核酸。天然存在的突變可包括核苷酸序列的缺失(如截短的氨基或羧基末端)、取代、倒置或加入?？砂凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的核酸雜交法檢測(cè)并分離這些基因。編碼本發(fā)明的人Chp多肽的核苷酸序列可含有見于天然存在的基因、轉(zhuǎn)錄物或cDNA，如圖1所示序列中的密碼子，或者其可含有編碼同樣氨基酸序列的簡(jiǎn)并密碼子。例如，可望改變序列中的密碼子，以使序列更適于在預(yù)期宿主中表達(dá)。
本發(fā)明的核酸可包括，例如DNA、RNA、合成的核酸、肽核酸、修飾的核苷酸或它們的混合物。DNA可以是雙鏈或單鏈的。根據(jù)不同的目的，如提高抗核酸酶(如RNA酶H)抗性，改善體內(nèi)穩(wěn)定性等，包括核酸的核苷酸可通過各種已知的鍵，如酯、氨基磺酸酯、硫酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等連接(如參見美國專利5,378,825)。
可對(duì)核酸進(jìn)行各種修飾，如連接可檢測(cè)標(biāo)志(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素)、用于改善雜交、檢測(cè)或穩(wěn)定性的部分等。也可按照已知方法(如參見美國專利5,470,967、5,476,925和5,478,893)，使核酸附著在固相載體如硝酸纖維素、磁性或順磁性微球(如參見美國專利5,411,863、5,543,289；例如包括鐵磁、超磁、順磁、超順磁、氧化鐵及多糖)、尼龍、瓊脂糖、重氮化纖維素、乳膠固體微球、聚丙烯酰胺等上。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及寡核苷酸或核酸探針。例如，可使用這樣的寡核苷酸或核酸探針檢測(cè)、定量分析或分離試驗(yàn)樣品中的哺乳動(dòng)物Chp核酸，或鑒定Chp同系物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可利用核酸作為寡核苷酸探針，例如用于PCR、差異展示、與cDNA庫、表達(dá)庫等組合?？蔀楦鞣N不同的目的，如研究、診斷、法醫(yī)學(xué)等目的進(jìn)行檢測(cè)。為診斷目的，其可用于鑒定得自組織、細(xì)胞、體液等的樣品中核酸序列的存在和含量。在優(yōu)選的方法中，本發(fā)明涉及檢測(cè)核酸的方法，包括在有效地實(shí)現(xiàn)靶和寡核苷酸間雜交的條件下，使試驗(yàn)樣品中的靶核酸與寡核苷酸接觸，并檢測(cè)雜交情況。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸也可用于擴(kuò)增合成的核酸如PCR(例如參見Saiki et al.，1988，Science24153；美國專利4,683,202；PCR ProtocolsA Guide to Methodsand Applications，Innis et al.，eds.，Academic Press，New York，1990)或差式展示(例如參見Liang et al.，Nucl.Acid.Res.，213269-3275，1993；美國專利5,599,672；WO 97/18454)?？陕?lián)合其它基因如參予應(yīng)力纖維形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長、腫瘤發(fā)生的基因及本文提到的基因等的寡核苷酸來完成這種檢測(cè)。例如，也可使用美國專利5,683,877、5,656,430及Wu等人(Proc.Natl.Acod.Sci.，898779-8783，1992)所述的錯(cuò)配DNA修復(fù)技術(shù)，利用寡核苷酸檢測(cè)突變。
本發(fā)明的寡核苷酸可包括圖1所示的任何連續(xù)核苷酸序列或其互補(bǔ)序列。本發(fā)明的寡核苷酸(核酸)可以有任何所需的大小，例如大約10-200、12-100、優(yōu)選12-50、12-25、14-16，至少約15，至少約20個(gè)等核苷酸。寡核苷酸可具有非天然存在的核苷酸，如肌苷、AZT、3TC等。寡核苷酸與圖1的序列可以有100％同一性或互補(bǔ)性，或者其可具有錯(cuò)配或核苷酸取代，如1、2、3、4或5個(gè)取代。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸可以包括試劑盒，其中試劑盒包括所需的緩沖液(如磷酸鹽或Tris緩沖液等)、檢測(cè)組合物等。寡核苷酸可以是用本領(lǐng)域已知的放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的或未標(biāo)記的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是人Chp所特有的核苷酸序列。Chp的特有序列是指出現(xiàn)于Chp中如圖1之核苷酸序列中，但很少或不常見于其它核酸，特別是哺乳動(dòng)物如人、大鼠、小鼠等的核酸中沒有的確定次序的核苷酸。獨(dú)特的核苷酸序列包括編碼氨基酸4-32、216-224和29-34的序列或其互補(bǔ)序列。這樣的序列可作為探針用于本文或參考文獻(xiàn)所述的方法中。其中包括有意義和反義核苷酸序列。可常規(guī)測(cè)定本發(fā)明的獨(dú)特核酸序列。可使用包含這種獨(dú)特序列的核酸作為雜交探針，以基于Northern印跡鑒定含核酸混合物的樣品中人或小鼠Chp的存在?？稍诟叨葒?yán)格條件下(詳見上述)進(jìn)行雜交，以選擇與探針至少有95％相同性(即互補(bǔ)性)的核酸，但也可以使用次嚴(yán)格條件。獨(dú)特的Chp核苷酸序列也可在其5′或3′末端，與本發(fā)明中提到的各種核苷酸序列，包括Chp之其它部分或GFP酶等的編碼序列，以及表達(dá)控制序列等符合讀框的融合。
如已經(jīng)討論的，可如Sambrook等人(Molecular Cloning，1989)所述，依據(jù)所需的選擇性不同，在不同的條件下進(jìn)行雜交。例如，為了特異地檢測(cè)人或小鼠Chp，可在寡核苷酸只與靶有100％互補(bǔ)性時(shí)才與之雜交的條件下，使寡核苷酸與靶核酸雜交。如果希望選擇具有小于100％，例如至少約99％、97％、95％、90％、70％、67％核苷酸互補(bǔ)性的靶核酸；則可使用不同的雜交條件。
也可以從本發(fā)明的核酸制備反義核酸，優(yōu)選是圖1之編碼序列的反義核酸?？梢愿鞣N方式使用反義核酸，如調(diào)節(jié)或調(diào)制Chp的表達(dá)，如抑制Chp，以檢測(cè)其表達(dá)，或進(jìn)行原位雜交?？膳c美國專利5,576,208所述的方法類似使用這些寡核苷酸。為了調(diào)節(jié)或調(diào)制Chp的表達(dá)，可將反義寡核苷酸可操作地連接到表達(dá)控制序列上。
可按照任何已知方法標(biāo)記本發(fā)明的核酸?？墒褂?2P、35S、125I、3H或14C等一些常用放射性示蹤物標(biāo)記核酸?？墒褂梅派錁?biāo)記的核苷酸、多核苷酸激酶(有或沒有用磷酸酶去磷酸化)或連接酶(依據(jù)待標(biāo)記的末端而異)，按照在3′或5′末端進(jìn)行末端標(biāo)記等已知方法，進(jìn)行放射性標(biāo)記。也可以使用非放射性標(biāo)記，將本發(fā)明的核酸與具有免疫學(xué)性質(zhì)的殘基(如抗原、半抗原)、對(duì)某些試劑有特異親合性(配體)、能夠完成可檢測(cè)的酶反應(yīng)(酶或輔酶、酶底物或參與酶促反應(yīng)的其它物質(zhì))，或具有特征性物理性質(zhì)如螢光或發(fā)射或吸收預(yù)定波長光等的物質(zhì)結(jié)合使用。
可使用本發(fā)明的核酸(包括寡核苷酸、反義核酸等)，以Northern印跡、PCR、原位雜交等各種技術(shù)檢測(cè)完整器官、組織、細(xì)胞等中的Chp表達(dá)。這樣的核酸特別適用于檢測(cè)失調(diào)的表達(dá)，如Chp的細(xì)胞特異性和/或亞細(xì)胞改變?？梢詥为?dú)檢測(cè)Chp水平，或者可與其它基因產(chǎn)物特別是腦和睪丸特異性基因產(chǎn)物，或參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)的其它基因產(chǎn)物如PAK、PAK2、JNK、Ras、Rho等聯(lián)合檢測(cè)。
根據(jù)預(yù)期的目的，可以在體外和體內(nèi)以各種不同的系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的核酸。例如，可將核酸插入表達(dá)載體中，然后再導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗鲀?nèi)，并在適于實(shí)現(xiàn)由核酸編碼之多肽的表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主。有效表達(dá)的條件包括任何適于由宿主細(xì)胞生產(chǎn)多肽的培養(yǎng)條件，包括有效的溫度、pH、培養(yǎng)基、加入到培養(yǎng)宿主細(xì)胞之培養(yǎng)基中的添加劑(如放大或誘導(dǎo)表達(dá)的添加劑，例如環(huán)己酰亞胺、丁酸酯，或編碼核酸與dhfr基因相鄰時(shí)加入氨甲蝶呤)、細(xì)胞密度、培養(yǎng)皿等?？捎萌魏斡行У姆椒ǎ缏鉊NA、磷酸鈣沉淀、電穿孔、注射、DEAE-Dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、與脂質(zhì)體融合、與提高其攝入細(xì)胞能力的藥劑結(jié)合、病毒轉(zhuǎn)染等方法將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。其中已導(dǎo)入了本發(fā)明之核酸的細(xì)胞為被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。核酸可以是染色體外的或整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)的。其可以是穩(wěn)定的或瞬時(shí)的。選擇與宿主細(xì)胞有相容性的表達(dá)載體。宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如COS-7、CV1、BHK、GHO、Hela、LTK、NIH3T3、293、PAE、人成纖維細(xì)胞、人原代腫瘤細(xì)胞、睪丸細(xì)胞)、昆蟲細(xì)胞如Sf9(草地夜蛾、S.frugipeda)和果蠅、細(xì)菌如大腸桿菌、鏈球菌、桿菌、酵母如釀酒酵母(如cdc突變體、cdc25、細(xì)胞周期和分裂突變體，如ATCC Nos.42563、46572、46573、44822、44823、46590、46605、42414、44824、42029、44825、44826、42413、200626、28199、200238、74155、44827、74154、74099、201204、48894、42564、201487、48893、28199、38598、201391、201392)、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(如小鼠或人等哺乳動(dòng)物)、成纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等。表達(dá)控制序列同樣是根據(jù)宿主相容性和所需目的，如高拷貝數(shù)、高含量、誘導(dǎo)、擴(kuò)增、受控表達(dá)等因素選擇的?？衫玫钠渌蛄邪ㄈ绲米許V40、CMV、RSV的增強(qiáng)子、可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、細(xì)胞類型特異性元件，或允許選擇性或特異性細(xì)胞表達(dá)的序列。可用于驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的啟動(dòng)子例如包括內(nèi)源性啟動(dòng)子、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中其它基因的啟動(dòng)子、細(xì)菌細(xì)胞的MMTV、SV40、trp、lac、tac或T7啟動(dòng)子等；或者是酵母的α因子、醇氧化酶，或PGH啟動(dòng)子。
例如為調(diào)制Chp功能目的，可以在同一宿主中引入另一個(gè)有用的基因。其可以是正常的基因或發(fā)生變異，例如突變、嵌合或多態(tài)性等。這樣的基因包括下列基因或信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的基因，如Ras家族、Cdc42Hs、Racs、Rhos、RAKS、JNK、Jun、WASP、IQGAP、POSH、ROR1、p67-phox、MLK3、MAP激酶、NCK、SOS、ERKs、p38、GEFs、GAPs、GDIs、Wiskott-Aldrich綜合征蛋白、FT酶、STE14、p53、Rb、Mt酶、GTP酶亞單位、Dbl、lbc、Ost、Lsc、STATS、Raf、src、Jun、fos、elk、MEK、Stell、Ste7等。
在核酸或蛋白質(zhì)電泳或?qū)游鲋校墒褂帽景l(fā)明的核酸或多肽作為大小標(biāo)志?？蓲呙栊蛄械南拗菩晕稽c(diǎn)、計(jì)算其大小并進(jìn)行相應(yīng)的限制性消化，以確定特定的限制性片段?？墒褂脠D1中所示的Chp cDNA作為核酸電泳中的分子量標(biāo)志。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及調(diào)節(jié)Chp基因參與的生物學(xué)途徑，特別是癌癥、過度增殖性疾病、腫瘤、神經(jīng)元代謝(如神經(jīng)元傳遞、軸突轉(zhuǎn)運(yùn))、細(xì)胞周期疾病、生殖疾病(如涉及精子、卵、受精卵產(chǎn)生的疾病)，以及對(duì)細(xì)胞分裂素和生長因子的反應(yīng)等病理學(xué)狀態(tài)。一般說來，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)有Chp或其同系物參與的生物反應(yīng)的方法，例如，Chp或其同系物參與最終導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)的生物化學(xué)途徑。例如，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及調(diào)制有Chp參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。因?yàn)檫@種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致包括某些基因的轉(zhuǎn)錄激活在內(nèi)的各種生物反應(yīng)，所以本發(fā)明涉及通過調(diào)制Chp活性控制這些基因表達(dá)的方法。本發(fā)明中，可按照美國專利5,767,075、5,753,446、5,728,536、5,667,314和5,459,036中所述的任何方法，例如使用Chp、其生物學(xué)活性片段或其同系物?？墒┯每笴hp抗體、顯性失活Chp基因(參見實(shí)施例)、PakR等各種藥劑，調(diào)制由Chp介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明還涉及鑒定用于調(diào)制哺乳動(dòng)物Chp多肽或其生物學(xué)活性片段之PAK激酶刺激活性或JNK激酶刺激活性之化合物的方法，包括在試驗(yàn)化合物存在下，使Chp多肽或其活化的生物學(xué)活性多肽片段與JNK或PAK多肽或其生物學(xué)活性片段，在Chp多肽或其生物學(xué)活性片段可有效地刺激JNK或PAK的激酶活性的條件下接觸，檢測(cè)激酶活性并在有和沒有試驗(yàn)化合物存在下比較激酶活性水平，以鑒定試驗(yàn)化合物是否可調(diào)制Chp多肽的刺激活性?？砂慈魏未涡蛲瓿蛇@些步驟，必要時(shí)也可省略一個(gè)或多個(gè)步驟。也可利用附加步驟。
可按任何所需的方式進(jìn)行激酶活性的檢測(cè)。例如，可在接觸步驟后分離JNK或PAK并檢測(cè)激酶活性?？墒褂每笿NK或PAK抗體，或抗與JNK或PAK符合讀框的融合之多肽表位的抗體，常規(guī)完成分離步驟?？墒褂眠m當(dāng)?shù)牡孜铮?2P-ATP，pH，緩沖液等，按照Bagrodia等人(J.Biol.Chem.27027995-27998，1995)或Coso等人(Cell 811137-1146，1995)所述的方法進(jìn)行激酶測(cè)定。可使用c-Jun、GST-c-Jun(79)、GST-ATF2(96)等底物進(jìn)行JNK激酶活性測(cè)定。當(dāng)使用放射性ATP時(shí)，可用放射自顯影等方法完成檢測(cè)。
本發(fā)明還涉及分離能夠調(diào)制哺乳動(dòng)物Chp和PAK之調(diào)節(jié)區(qū)域間，或與Chp正常結(jié)合或相互作用之其它多肽間的結(jié)合之化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定了用于調(diào)制Chp和PakR調(diào)節(jié)區(qū)域間結(jié)合的化合物。一種方法包括以下步驟在試驗(yàn)化合物可有效地調(diào)制Chp多肽與PakR調(diào)節(jié)區(qū)域間結(jié)合的條件下，使人Chp多肽，活化形式的Chp或其生物學(xué)上有活性的多肽片段(統(tǒng)稱“多肽”)接觸；并檢測(cè)有和沒有試驗(yàn)化合物存在時(shí)Chp多肽與RakR調(diào)節(jié)區(qū)域間的結(jié)合?？梢园慈魏未涡蛲瓿蛇@些步驟，必要時(shí)，也可省去一個(gè)或多個(gè)步驟。也可利用其它附加步驟。
這些試驗(yàn)化合物可以是任何預(yù)計(jì)有調(diào)制活性的藥劑。例如，這樣的化合物可包括Chp的多肽衍生物或模擬物，其包括一個(gè)作為拮抗劑的Chp區(qū)域，干擾或競(jìng)爭(zhēng)Chp與PakR結(jié)合區(qū)或與參予這種結(jié)合的效應(yīng)物之間的正常相互作用。其它藥劑例如包括天然存在的化合物、以組合化學(xué)方法合成的化學(xué)藥品、核酸(如aptamers)、反義核酸、抗Chp區(qū)域抗體、刺激Chp、TPA及其衍生物的天然配體等。另外，可利用GTP交換因子(如GEFs)、GAPs，以及調(diào)節(jié)G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)家族的其它因子和多肽作為試驗(yàn)化合物，如p115 RhoGEF、Lsc、DRhoGEF2或其片段等(例如參見Kozasa et al.，Science 2802109-2111，26 Jun.1998)。
一般地說，這些方法、測(cè)定或試驗(yàn)可在便于檢測(cè)的環(huán)境中進(jìn)行以達(dá)到預(yù)期目的，即實(shí)現(xiàn)并調(diào)制激酶刺激作用或?qū)崿F(xiàn)并調(diào)制結(jié)合。優(yōu)選使試驗(yàn)化合物在可發(fā)生激酶刺激作用或結(jié)合的環(huán)境中與Chp多肽接觸。所說的環(huán)境可以是體外或體內(nèi)的。這樣的環(huán)境包括有效的條件?？稍跊]有試驗(yàn)化合物的情況下確定這些條件以確立基線活性，例如，象在對(duì)照中的情況一樣?？梢允褂眠m當(dāng)?shù)柠}、緩沖液、還原和/或氧化劑及pH值等常規(guī)選擇有效的反應(yīng)條件。
術(shù)語“調(diào)制”是指增強(qiáng)、提高、激發(fā)(作為激動(dòng)劑)、促進(jìn)、降低、減小、阻斷或拮抗(作為拮抗劑)刺激活性。調(diào)制作用可使活性比基線值增加1、2、3、10倍等以上調(diào)制可使其活性降至基線值以下。
其活性可被調(diào)制的哺乳動(dòng)物Chp多肽或其生物學(xué)活性片段(統(tǒng)稱“多肽”)優(yōu)選的是人Chp多肽或其生物學(xué)活性片段。Chp多肽可具有如圖1所示的天然存在的序列、活化的序列(見上文，“活化的形式”，例如其中40位甘氨酸被纈氨酸取代的“活化形式”)；或其具有激酶刺激或結(jié)合活性的其它變體。哺乳動(dòng)物Chp也可包括一個(gè)或多個(gè)其上述的區(qū)域，或與其它蛋白質(zhì)區(qū)域的組合。也可鑒定無活性的Chp多肽(如參見有關(guān)顯性失活等位基因的說明)，目的在于鑒定用于恢復(fù)其活性的化合物。
可使用在試驗(yàn)樣品中、細(xì)胞溶解物中或全細(xì)胞中加入了各成分的混合物完成這些方法。例如，可在由Chp多肽、JNK或PAK多肽及其它成分組合成的反應(yīng)混合物中檢測(cè)激酶刺激活性或結(jié)合活性。在該方法中，可作為細(xì)胞成分或可溶性提取物，加入基本上純化的Chp多肽。在各種情況下，Chp多肽可從天然來源、重組來源(即以基因工程技術(shù)生產(chǎn)“重組”多肽，例如，對(duì)質(zhì)粒、載體、裸DNA等將其基因?qū)爰?xì)胞系中，并在細(xì)胞中表達(dá)之)，或生產(chǎn)得到?？勺鳛槿诤匣蚍侨诤系鞍自诓溉閯?dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞系或細(xì)菌中表達(dá)Chp多肽。
優(yōu)選在由Chp編碼序列(如cDNA、基因、基因組片段等)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中表達(dá)Chp。在后一種情況下，Chp是作為細(xì)胞的異源成分存在的；術(shù)語“異源”是指例如由轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化等過程被人工導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的編碼序列編碼的Chp。Chp優(yōu)選以高水平在細(xì)胞(細(xì)菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等)中表達(dá)?？墒褂萌魏我环N細(xì)胞系，包括正常的、突變的、溫度敏感性突變的細(xì)胞系等。人Chp編碼序列是優(yōu)選的編碼序列(參見圖1)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如按照實(shí)施例中所述的方法檢測(cè)激酶刺激活性。其中用可在細(xì)胞中表達(dá)的核酸轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，以將Chp和PAK或JNK編碼序列導(dǎo)入所說的細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)中?？蓪⒕幋a序列可操作地連接到在細(xì)胞內(nèi)有功能的任何所需的啟動(dòng)子(如可誘導(dǎo)的和構(gòu)成性啟動(dòng)子)上。PAK和JNK多肽優(yōu)選包括一個(gè)作為“手柄”的標(biāo)志，其在細(xì)胞中表達(dá)并受Chp刺激后可被重新得到用于激酶測(cè)定。該“標(biāo)志”一般為多肽序列，如myc或已經(jīng)產(chǎn)生抗體的血凝素。因此，“標(biāo)志”可以是多肽表位，即可以產(chǎn)生抗體的任何多肽序列。如前所述，可使用野生型的、活化的Chp，或其生物學(xué)活性片段。一旦用編碼序列轉(zhuǎn)染了細(xì)胞，并在適當(dāng)條件下保溫一定時(shí)間后，即可溶解細(xì)胞并測(cè)定其激酶活性?！皹?biāo)志”有利于借助免疫沉淀重新得到JNK或PNK用于激酶測(cè)定。也可以使用原位技術(shù)對(duì)完整細(xì)胞進(jìn)行激酶測(cè)定。可在轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后及啟動(dòng)子誘導(dǎo)后等任何時(shí)間將試驗(yàn)化合物加到細(xì)胞中。
如所討論的，可以按照任何方法進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)，例如可以使用標(biāo)記的結(jié)合配體(如PakR)，在固相或液相中完成競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可在完整細(xì)胞中完成鑒定調(diào)制Chp結(jié)合之化合物的方法。作為例證，在實(shí)施例中，利用在限定的溫度下不能存活的溫度敏感性酵母細(xì)胞系(如cdc25-2)。使Ras補(bǔ)充到質(zhì)膜中，將使致死性表型得以恢復(fù)。為了利用這一優(yōu)點(diǎn)，可以在構(gòu)建Chp序列時(shí)使之含有符合讀框的質(zhì)膜導(dǎo)向序列，如v-src豆蔻?；蛄?。用含有質(zhì)膜導(dǎo)向序列的Chp多肽和含有Ras及能夠結(jié)合Chp之區(qū)域的融合蛋白轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，可補(bǔ)救溫度敏感性缺陷。Chp融合多肽俘獲Ras融合蛋白，使之能夠到達(dá)質(zhì)膜。因此，通過在限定的溫度下培養(yǎng)細(xì)胞，只有Chp結(jié)合到Ras融合蛋白上的細(xì)胞才能存活。除了Ras的生物學(xué)活性部分外，Ras融合蛋白可包括具有結(jié)合Chp能力的任何多肽，例如PakR，特別是PakR-Ras(61)δF(“餌”)。根據(jù)本發(fā)明，可以用編碼Chp膜定向多肽和“餌”的核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞。可以在任何時(shí)間向細(xì)胞中加入試驗(yàn)化合物。如果該化合物干擾Chp和其配體(如PakR)之間的相互作用，細(xì)胞將不能存活。按這種方法，可以鑒定拮抗劑及減少或降低結(jié)合的其它化合物。還可利用該方法鑒定那些調(diào)節(jié)結(jié)合的化合物(包括使用一系列不同濃度的試驗(yàn)化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并計(jì)算LD50)。后者允許鑒定那些增強(qiáng)或降低Chp與其結(jié)合配體(餌)之間結(jié)合的化合物。
本發(fā)明還涉及鑒定可用于調(diào)制Chp多肽或其生物學(xué)活性多肽片段之細(xì)胞骨架再組織活性的化合物。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將有效地刺激細(xì)胞骨架再組織的Chp多肽或其生物學(xué)活性多肽片段導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。該方法包括在試驗(yàn)化合物足以有效調(diào)制多肽在刺激所說的細(xì)胞骨架再組織中的作用的條件下，使該細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸。可以用各種方法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞骨架的作用，其中包括使用可與細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白或其它成分(如粘著斑蛋白)結(jié)合的藥劑進(jìn)行肉眼觀察。這樣的藥劑包括標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(如羅丹明、熒光素)、抗肌動(dòng)蛋白或粘著斑蛋白的抗體，或識(shí)別Chp或其一部分(例如，在實(shí)施例中，它與可使用抗體檢測(cè)的多肽融合)的抗體?？稍谟泻蜎]有試驗(yàn)化合物時(shí)看到細(xì)胞骨架(如參見Symons et al.，Cell 84723-734，1996；Nobes and Hall，Cell 8153-62，1995)。
調(diào)制Chp功能的另一種方法是調(diào)節(jié)參與其表達(dá)的途徑，如調(diào)制其轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定性、翻譯、轉(zhuǎn)錄后修飾、加工(如在內(nèi)部切割位點(diǎn)上切割)等?？墒褂貌煌乃巹┤绶戳x核酸、核酶、aptamer、合成的化合物，或天然存在的化合物等調(diào)節(jié)表達(dá)。
本發(fā)明還涉及鑒定其轉(zhuǎn)錄受Chp調(diào)制的基因的方法。例如，可將活化的Chp導(dǎo)入細(xì)胞中，并于Chp存在和不存在下分析其表達(dá)/轉(zhuǎn)錄模式?？蛇M(jìn)行常規(guī)的表達(dá)分析。例如，可以設(shè)計(jì)高密度寡核苷酸芯片排列，以監(jiān)測(cè)表達(dá)。這樣的芯片可含有人基因組的全部或其亞組(如參見Anderson et al.，Topics in Current Chemistry，Vol.194，pages117-129，1998；Southern，Current Biology 785-88，1996；Marshall and Hodgson，Nature Biotechnology 1627-31，1998)。
本發(fā)明還涉及鑒定可調(diào)制Chp之天然配體和信號(hào)的方法。例如，可使表達(dá)Chp的細(xì)胞與各種細(xì)胞產(chǎn)物接觸，然后測(cè)定對(duì)其中有Chp參與之信號(hào)途徑的激活。在一個(gè)實(shí)施方案中，在細(xì)胞中表達(dá)異源Chp；使這樣的細(xì)胞與已用cDNA文庫轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或其產(chǎn)物接觸。按照本文所述的方法(如激酶活性、細(xì)胞骨架再排列等)常規(guī)檢測(cè)Chp活化作用。如果被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或其產(chǎn)物導(dǎo)致Chp活化，然后即可分離并鑒定這些被轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的cDNA。
可使用按上述任何測(cè)定方法鑒定的化合物于細(xì)胞、組織、整個(gè)生物體內(nèi)、原位、體外(試管、固相載體等)、體內(nèi)或在任何所需的環(huán)境中調(diào)制Chp活性。一般說來，具有這種體外活性的化合物可用于體內(nèi)調(diào)制與Chp有關(guān)的生物學(xué)途徑，如細(xì)胞周期障礙、應(yīng)力反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、有絲分裂、分化、酵母感染(例如當(dāng)調(diào)制酵母Chp同系物時(shí))、致育疾病、神經(jīng)學(xué)病變、癌癥、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生等。
為了治療疾病，可將化合物或混合物配制成包含藥用載體及技術(shù)人員已知的其它賦形劑的藥物組合物(如參見Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，1990)。這樣的組合物中可另外含有有效量的其它化合物。
本發(fā)明還涉及特異性識(shí)別Chp的抗體。Chp特異性抗體是指識(shí)別Chp內(nèi)或包括Chp的限定的氨基酸序列，如圖1所示之人序列的抗體。一般特異性抗體與見于圖1的氨基酸序列，即，表位結(jié)合比與不同的表位結(jié)合的親合力要高，例如，經(jīng)免疫印跡測(cè)定或其它常規(guī)免疫測(cè)定所檢測(cè)到的和/或測(cè)得的。因此，可使用對(duì)人Chp的表位特異的抗體檢測(cè)樣品中，例如含有人Chp基因產(chǎn)物的組織樣品中該表位的存在，以將其與沒有該表位的樣品區(qū)分開。如Santa Cruz Biotechnology Inc.，Research Product Catalog中所述這些抗體是有用的，可相應(yīng)地進(jìn)行配制，例如配制成100μg/ml?？砂凑杖魏嗡璧姆椒ㄖ苽渲亟M的、嵌合的、人源化的多克隆或單克隆抗體。另外可參見已知的重組免疫球蛋白庫篩選(Orlandi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，863833-3837，1989；Huse et al.，Science 2561275-1281，1989)和淋巴細(xì)胞群體的體外刺激(Winter and Milstein，Nature 349293-299，1991)等方法。例如，為了生產(chǎn)單克隆抗體，可給小鼠、山羊或兔皮下和/或腹腔內(nèi)施用可有效地引發(fā)免疫反應(yīng)量的，加有或不加有佐劑的具有圖1所示序列的多肽。該抗體也可以是單鏈的，或者是FAb片段?？贵w可以是IgG、亞型IgG2a、IgG1等。也可以施用裸DNA以產(chǎn)生抗體和免疫反應(yīng)(如參見美國專利5,703,055、5,589,466和5,580,859號(hào))。
用于誘導(dǎo)抗體的Chp或其片段本身或與載體組合不一定具有生物學(xué)活性，但必須具有免疫原活性。用于誘導(dǎo)Chp特異性抗體的肽可具有由至少5個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列。Chp氨基酸的缺片段，例如5個(gè)氨基酸的片段可以與另一種蛋白質(zhì)如KLH，或另一種有用的載體，及用于生產(chǎn)抗體的嵌合分子相融合。
可利用幾種不同的方法制備Chp特異性抗體。例如，一種方法包括從純化的Chp(例如以反相HPLC分離法純化的)得到多達(dá)75mg量的變性的Chp?？墒褂么俗冃缘牡鞍踪|(zhì)采用標(biāo)準(zhǔn)程序免疫小鼠或免；其中用于免疫小鼠的適用量為大約100μg，而免疫兔則可能使用多達(dá)1mg。為了鑒定小鼠雜交瘤，可以放射性碘化變性的蛋白質(zhì)，并根據(jù)其產(chǎn)生抗體的能力用于篩選潛在的小鼠B細(xì)胞雜交瘤。這種方法只需要小量的蛋白質(zhì)，20mg即足以標(biāo)記并篩選幾千個(gè)克隆。
在另一種方法中，分析由cDNA推測(cè)的Chp氨基酸序列，以確定高免疫原性的區(qū)域。合成包括這些區(qū)域的多肽，并將其用于適當(dāng)?shù)拿庖叱绦蛞援a(chǎn)生抗體。按照Ausubel FM等人(1989，Current Protocolsin Molecular Biology，Vol.2，John Wiley & Sons)所述的方法進(jìn)行分析以選擇適當(dāng)?shù)谋砦?。用于免疫的最佳氨基酸序列通常是在多肽的C末端、N末端和那些間插的，親水性區(qū)域，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于其天然構(gòu)象時(shí)這些區(qū)域很可能暴露于外部環(huán)境。一般是使用AppliedBiosystems 431A型肽合成儀，以fmoc化學(xué)保護(hù)法合成長度約15個(gè)殘基的選定的肽，并使之與馬來酰亞氨苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS；參見Ausubel FM等人，上述文獻(xiàn))反應(yīng)，以偶聯(lián)到匙孔血藍(lán)蛋白(KLH，Sigma)上。必要時(shí)，可在肽的N末端導(dǎo)入半胱氨酸以與KLH偶聯(lián)。用肽-KLH復(fù)合物加弗氏完全佐劑免疫兔。將肽結(jié)合到塑料固相上，用1％BSA封閉后再與抗血清反應(yīng)，洗滌后再與標(biāo)記的(放射性或熒光標(biāo)記的)、親和純化的特異性山羊抗兔IgG反應(yīng)，以檢驗(yàn)所得到的抗血清的抗肽活性。
也可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備并篩選雜交瘤。用標(biāo)記的Chp篩選，以鑒定能產(chǎn)生有預(yù)期特異性之單克隆抗體的融合體，從而檢測(cè)所需的雜交瘤。在典型方法中，用親和純化的特異性兔抗小鼠(或適當(dāng)?shù)目笽g)抗體(10mg/ml)包被平板(FAST，Becton-Dickinson，Palo Alto，Calif.)的各小孔。用1％BSA封閉包被的小孔，洗滌并暴露于雜交瘤的上清液。保溫后再與標(biāo)記的Chp(1mg/ml)接觸。產(chǎn)生抗體的克隆將與一定量標(biāo)記的Chp結(jié)合。擴(kuò)展該克隆并以有限稀釋(1細(xì)胞/3孔)對(duì)其進(jìn)行2輪克隆。將克隆化的雜交瘤注入原始的小鼠體內(nèi)以產(chǎn)生腹水，并以蛋白A柱親和層析法從小鼠腹水液中純化單克隆抗體。按照Harlow和Lane(1988，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory)，或Goding(1986，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice，2nd Ed.Academic PressN.Y.)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法制備具有至少108M、優(yōu)選109-1010或更強(qiáng)的親合性的單克隆抗體。
產(chǎn)生抗體的有用序列包括KLNAKGVRTLSRCRWKK(氨基酸215-231)、RELSEAEPPPLPASTPPPRRRSAPPELG及其片段。
特定的Chp抗體可用于診斷以Chp的量或分布上的差異為特征的前病理學(xué)狀態(tài)、及慢性或急性疾病。Chp的診斷檢驗(yàn)包括利用抗體和標(biāo)記物檢測(cè)人(或小鼠等)體液、組織或其提取物中的Chp。
可以使用經(jīng)過修飾或沒修飾的本發(fā)明的多肽和抗體。通?？蓪⒍嚯暮涂贵w與提供可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)共價(jià)或非共價(jià)連接進(jìn)行標(biāo)記。科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中均已廣泛報(bào)導(dǎo)過各種標(biāo)記物和連接技術(shù)。適用的標(biāo)記包括放射核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、磁性顆粒等。美國專利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中提供了使用這些標(biāo)記的技術(shù)教導(dǎo)。另外如美國專利4,816,567(并入本文作為參考)中所述，可以生產(chǎn)重組免疫球蛋白。
使用Chp特異性多克隆或單克隆抗體，檢測(cè)可溶性或膜結(jié)合的Chp的多種方法是本領(lǐng)域中已知的。例子包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)。優(yōu)選使用可與EC上兩個(gè)非干擾性表位反應(yīng)的單克隆抗體進(jìn)行以兩位點(diǎn)單克隆為基礎(chǔ)的免疫測(cè)定，但也可以利用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法(如參見Maddox，Del.etal.(1983)J.Exp.Med.1581211)。
可以多種方式使用與Chp結(jié)合的抗體和其它配體，包括作為治療、診斷及研究工具，例如用Western印跡法、ELISA、RIA或免疫沉淀法定量動(dòng)物、組織或細(xì)胞內(nèi)Chp多肽的水平、鑒定其細(xì)胞定位和/或分布、純化Chp多肽或其部分、調(diào)節(jié)其功能等。本發(fā)明涉及這樣的測(cè)定方法，進(jìn)行該方法所用的組合物和試劑盒?？墒褂帽景l(fā)明的抗體，按照上述和其它方法檢測(cè)組織、細(xì)胞、體液、血液、尿液、腦脊液等各種樣品中的Chp多肽或其片段。本發(fā)明的方法包括a)在本領(lǐng)域已知可有效地實(shí)現(xiàn)結(jié)合的條件下，使配體與圖1所示的肽接觸，b)檢測(cè)配體和肽之間的特異性結(jié)合?！疤禺愋越Y(jié)合”是指配體連接到如圖1所包括的特定氨基酸序列或其衍生物上。
可以使用Chp特異性抗體以免疫親和層析法純化天然的或重組的Chp。一般說來，可將抗Chp抗體共價(jià)偶聯(lián)到活化的層析樹脂上，以構(gòu)成免疫親和柱。
以硫酸銨沉淀法或固相化蛋白A(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)純化法從免疫血清中制備多克隆免疫球蛋白，并用同樣的方法從小鼠腹水液中制備單克隆抗體。將部分純化的Ig共價(jià)連接到層析樹脂例如CnBr活化的Sepharose(Pharmacia LKBBiotechnology，Piscataway，N.J.)上。按照制造商推薦的方法將抗體偶聯(lián)到樹脂上，封閉樹脂，然后洗滌衍生的樹脂。
利用免疫親和柱從細(xì)胞中制備含Chp部分，以純化Chp?？梢匀芙馊?xì)胞或經(jīng)加入去污劑進(jìn)行差速離心或按其它本領(lǐng)域熟知的方法制得的亞細(xì)胞部分，以得到該制劑。另外，含有信號(hào)序列的可溶性Chp可以有用的量被分泌到培養(yǎng)細(xì)胞的生長培養(yǎng)基中。
使含有可溶性Chp的制劑通過免疫親和柱，并在含去污劑的高離子強(qiáng)度緩沖液條件下洗柱，以優(yōu)先吸附Chp。然后在破壞抗體/Chp結(jié)合的條件(如pH2-3或有高濃度離液劑如尿素或硫氰酸離子存在的緩沖液)下洗脫柱，并收集Chp。
另外，也可使用合成肽庫或aptamers制備可與本發(fā)明的Chp多肽或其衍生物結(jié)合的配體(如參見Pitrung et al.，美國專利5,143,854；Geysen et al.，1987，J.Immunol.Methods 102259-274；Scott et al.，1990，Science 249386；Blackwell etal.，1990，Science 2501104；Tuerk et al.，1990，Science 249505)。
也可使用抗體或其衍生物抑制Chp或其片段的表達(dá)?？梢詥为?dú)或與其它基因產(chǎn)物一起檢測(cè)Chp多肽的水平。具體地說，可以將Chp多肽的量(例如其表達(dá)水平)與同一或不同樣品中其它多肽(如肌動(dòng)蛋白)的量進(jìn)行比較(例如求出兩者間的比例)。一般說來，可按照例如美國專利5,397,712、5,434,050、5,429,947中所述的方法將Chp特異性試劑用于診斷和/或法醫(yī)學(xué)研究。
本發(fā)明還涉及如按照美國專利5,434,050中公開的方法制備的Chp多肽。例如可在結(jié)合試驗(yàn)中，于體內(nèi)、體外或原位系統(tǒng)等中使用標(biāo)記的多肽鑒定與Chp結(jié)合或連接的物質(zhì)，示蹤C(jī)hp在細(xì)胞中的運(yùn)動(dòng)。
可以分離本發(fā)明的核酸、多肽、抗體、Chp、配體等。術(shù)語“分離的”是指物質(zhì)以一種在其原有環(huán)境中見不到的形式存在，例如更濃縮、更純，并與其它成分分開等。分離的核酸可包括具有從活體動(dòng)物染色體DNA中分離之Chp序列的核酸。該核酸可以是載體的一個(gè)部分，或被插入到染色體中(借助特異性基因?qū)?，或在其正常位置以外的位置上發(fā)生隨機(jī)整合)，并且以其在天然環(huán)境中見不到的形式存在時(shí)仍是被分離的。本發(fā)明的核酸或多肽也可以是基本上純化的?！盎旧霞兓摹笔侵负怂峄蚨嚯氖欠蛛x的并且基本上沒有其它核酸或多肽，即該核酸或多肽是原始的和有活性的成分。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如含有Chp的非人哺乳動(dòng)物，例如小鼠?？梢园凑找阎姆椒ㄖ苽滢D(zhuǎn)基因動(dòng)物，這些方法包括將重組基因注射到1細(xì)胞胚胎的前核中、在胚胎干細(xì)胞中摻入人工酵母染色體、基因?qū)蚍椒ā⑴咛ジ杉?xì)胞技術(shù)等(如參見美國專利4,736,866、4,873,191、4,873,316、5,082,779、5,304,489、5,174,986、5,175,384、5,175,385、5,221,778；Gordon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.777380-7384，1980；Palmiter et al.，Cell 41343-345，1985；Palmiter et al.，Ann.Rev.Genet.，20465-499，1986；Askew et al.，Mol.Cell Biol.134115-4124，1993；Games et al.，Nature 373523-527，1995；Valancius andSmithies，Mol.Cell.Biol.111402-1408，1991；Stacey et al.，Mol.Cell.Biol.141009-1016，1994；Hasty et al.，Nature350243-246，1995；Rubinstein et al.，Nucl.Acid Res.212613-2617，1993)?？蓪⒈景l(fā)明的核酸導(dǎo)入小鼠(Hogan et al.，1986，Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)、豬(Hammer et al.，Nature 315343-345，1985)、羊(Hammer et al.，Nature 315343-345，1985)、牛、大鼠或靈長類等非人哺乳動(dòng)物體內(nèi)。也可參見，例如Church，1987，Trends in Biotech.513-19；Clark et al.，1987，Trends in Biotech.520-24；和DePamphilis et al.，1988，Bio Techniques，6662-680。另外，市場(chǎng)上可委托生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠。可使用這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作測(cè)試Chp功能的動(dòng)物模型，作為蛇的食物，作為檢測(cè)株系來源的遺傳標(biāo)記(即，其中已插入了Chp或其片段)等?？砂凑彰绹鴮＠暾?qǐng)08/866,058和09/000,846中所述方法制備和使用這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如Chp剔除的動(dòng)物)。含有Chp突變體(如活化的Chp)或Chp剔除的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可合并有其它基因突變，如參予同樣或相似信號(hào)傳導(dǎo)途徑之基因的剔除或突變。這樣的基因包括Ras、Cdc42Hs、Racs、Rhos、PAKS、JNK、Jun、WASP、IQGAP、POSH、POR1、p67-phox、MLK3、MAP激酶、NCK、SOS、ERKs、p38、GEFs、GAPs、GDIs、Wiskott-Aldrich綜合征蛋白、FT酶、STE14、p53、Rb、Mt酶、GTP酶亞單位、Dbl、lbc、Ost、Lsc，以及上述、下述、或本文所引文獻(xiàn)中提到的任何基因。根據(jù)使用目的和所需表型的不同，動(dòng)物可以是純合的或雜合的。
一般地說，可以按照美國專利5,501,969、5,506,133、5,441,870；WO 90/00607和WO 91/15582中所述方法制備和使用本發(fā)明的核酸、多肽、抗體等。
有關(guān)本發(fā)明的核酸、多肽、抗體等的其它方面可參見分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)科學(xué)及免疫學(xué)的教科書(如參見Davis et al.，Basic Methodsin Molecular Biology，Elsevir Sciences Publishing，Inc.，N.Y.1986；Hames et al.，Nucleic Acid Hybridization，IL Press，1985；Sambrook et al.，Molecular Cloning，1989；FM.Ausubelet al.(編)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.；Nicholas C.Dracopoli et al.(編)，CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley & Sons，Inc.；JohnE.Coligan et al.(編)，Current Protocols in Immunology，JohnWiley & Sons，Inc.)。
實(shí)施例與PAK特異性相互作用的新的Cdc42Hs同系蛋白質(zhì)(chp)的分離。我們使用了改進(jìn)的Sos補(bǔ)充系統(tǒng)(SRS)(Aronheim et al.，Mol.Cell Biol.173094-3102，1997)鑒定與PAK65相互作用的蛋白質(zhì)。這個(gè)新的二雜合系統(tǒng)有助于檢測(cè)質(zhì)膜內(nèi)表面上的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用。SRS系統(tǒng)是基于將Ras交換因子Sos導(dǎo)向質(zhì)膜即足以拯救酵母中的溫度敏感性cdc25等位基因這一發(fā)現(xiàn)而建立的。利用這一發(fā)現(xiàn)，我們通過將膜定向的哺乳動(dòng)物cDNA庫轉(zhuǎn)化到帶有與Ras融合的餌的cdc25-2溫度敏感性酵母菌株中構(gòu)建了新的二雜合酵母篩選系統(tǒng)(Aronheim et al.，Mol.Cell Biol.173094-3102，1997)。餌與膜上展示的蛋白質(zhì)之間的相互作用將導(dǎo)致Ras向質(zhì)膜中的補(bǔ)充，進(jìn)而增加細(xì)胞存活性。
將PAK2調(diào)節(jié)區(qū)(PakR)融合在缺少CAAX盒之RasL61的N末端，并亞克隆到pADNS質(zhì)粒中，定名為PakR-Ras(61)F。將大鼠腦垂體cDNA文庫構(gòu)建到含有如前所述的V-src豆蔻酰化序列(Aronheim et al.，Mol.Cell Biol.173094-3102，1997)的pYES載體中。文庫的表達(dá)處于GAL1、半乳糖可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制之下。用文庫和PakR-Ras(61)F融合體轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使大約0.5×106轉(zhuǎn)化體于24℃生長4天，然后鋪敷在36℃半乳糖平板上。分離5個(gè)以半乳糖依賴方式生長的克隆，然后檢查相互作用的特異性。1、2、5和6號(hào)克隆只有當(dāng)用PakR-Ras(61)F餌共轉(zhuǎn)化時(shí)才能夠于36℃生長，而用無關(guān)的餌Ras(61)F-JDP2共轉(zhuǎn)化時(shí)則不能生長，這一結(jié)果提示其相互作用依賴于餌PAK65。相反，用兩種餌共轉(zhuǎn)化時(shí)，8號(hào)克隆能夠于36℃下生長。此后，核苷酸序列揭示了8號(hào)克隆是Sos的同系物，后者本身被導(dǎo)向膜時(shí)，能夠激活酵母Ras并使之在有限制的溫度下生長。1、2和5號(hào)克隆完全相同，并與GTP酶、Cdc49Hs和Rac1表現(xiàn)有序列同源性。因?yàn)樵揷DNA在我們的篩選中獨(dú)自出現(xiàn)3次，所以我們決定對(duì)該克隆作進(jìn)一步的分析。下文將描述6號(hào)克隆的表征。該克隆與Cdc42Hs表現(xiàn)有大約52％的序列相同性，因此將其定名為Cdc42Hs同系蛋白質(zhì)—Chp，其編碼約36kDa的蛋白質(zhì)。令人感興趣的是，除了同源于Cdc42Hs外，Chp在N和C末端還含有與Cdc42Hs無關(guān)的序列。在Chp的N末端發(fā)現(xiàn)了Chc42Hs中所沒有的另外28個(gè)氨基酸。該附加序列包括SH3結(jié)合區(qū)所特有的聚脯氨酸。Chp的C末端并不含有所有Ras相關(guān)GTP酶均保留的經(jīng)典的CAAX盒(Didsbury et al.，J.Biol.Chem.26416378-16382，1989)。CAAX區(qū)負(fù)責(zé)脂質(zhì)修飾和Rho家族中所有小GTP酶的膜附著。相反，Chp則含有與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)沒有任何序列同源性的32個(gè)附加氨基酸。
Chp轉(zhuǎn)錄。為了檢測(cè)Chp的組織分布，我們使用Northern印跡分析法(Clontech)，使相當(dāng)于Chp之GTP酶區(qū)域(相應(yīng)于氨基酸102-151)的特異性探針與大鼠多種組織的mRNA雜交。該區(qū)域與家族的其它成員只有62％相同性。測(cè)知大約1.5Kb的單一種類mRNA在腦和睪丸中以高水平存在，而在脾和肺組織中則含量較低。令人感興趣的是，有人報(bào)導(dǎo)了Rac相關(guān)蛋白質(zhì)的小尺寸mRNA(1.0和1.4Kb)(Didsburyet al.，J.Biol.Chem.26416378-16382，1989)。與相當(dāng)于C和N末端及全長度Chp的探針雜交得到相似的結(jié)果。
Chp表達(dá)。為了確定Chp的大小和Chp在293細(xì)胞系中的表達(dá)，產(chǎn)生抗相當(dāng)于位于C末端的Chp獨(dú)特區(qū)域的肽(氨基酸216KLNAKGVRTLSRCRWKK232)的多克隆抗體。為了比較內(nèi)源性Chp與克隆的cDNA的大小，我們將Chp cDNA融合到myc表位標(biāo)志序列上，并使用該質(zhì)粒在293細(xì)胞中過表達(dá)Chp。在SDS-PAGE上分離被轉(zhuǎn)染或未被轉(zhuǎn)染之293細(xì)胞的全細(xì)胞提取物，然后用抗myc抗體進(jìn)行Western印跡分析，并將硝酸纖維素濾膜與親和純化的抗Chp抗體一起保溫。結(jié)果表明，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的Chp的大小相同于使用抗Chp抗體在未被轉(zhuǎn)染之293細(xì)胞系中測(cè)得的蛋白質(zhì)。
PAK與活化的Chp突變體的相互作用。Pak調(diào)節(jié)區(qū)(PakR)與活化形式的Rac和Cdc42相互作用。我們選擇試驗(yàn)PakR與Chp的結(jié)合?；谂cCdc42及其它Rho GTP酶的序列同源性，我們制得了預(yù)期在其GDP/GTP結(jié)合狀態(tài)下不同的各種Chp突變體。為了制得組成上有活性的Chp，我們用纈氨酸取代甘氨酸40。在Rac和Cdc42Hs中第12位(G12V)上等同氨基酸的取代產(chǎn)生了GTP酶水解作用有缺陷的活性等位基因。另外，我們對(duì)Chp上的等同位置進(jìn)行了突變并將氨基酸45取代為天冬酰胺。將其它Rho GTP酶中相應(yīng)第17位的氨基酸取代為天冬酰胺，產(chǎn)生了鎖定為GDP結(jié)合無活性形式的顯性失活等位基因(Erickson et al.，J.Biol.Chem.27126850-26854，1996)。用編碼融合有豆蔻?；蛄兄煌珻hp突變體的質(zhì)粒連同PakR-Ras(61)F餌共轉(zhuǎn)染cdc25-2酵母菌株。組成上有活性的Chp(Chp Ac.)和野生型Chp(WT Chp)與PakR相互作用，而與顯性失活形式的Chp不發(fā)生這種相互作用。同樣，組成上有活性的和野生型的Cdc42Hs與PakR，但不與顯性失活Chp相互作用。特別是在同樣測(cè)定條件下，只有活化的突變體Rac1與PakR，但不與野生型或顯性失活RacN17相互作用。這一數(shù)據(jù)提示，Chp與PakR之間的特異性相互作用取決于GTP酶的活化狀態(tài)。野生型Chp與Cdc42Hs，但不與Rac1相互作用，可能是由于這些GTP酶對(duì)酵母核苷酸交換因子Cdc24有不同的敏感性。然后Cdc42Hs和Chp與推測(cè)的交換因子相互作用將給GTP酶裝上GTP，從而產(chǎn)生活性形式的Cdc42Hs和Chp。
Chp C末端區(qū)對(duì)Pak65結(jié)合的作用。為了研究Chp氨基和羧基末端序列的作用，我們進(jìn)一步刪除C和/或N末端以使Chp Ac突變。將Chp突變體連同PakR餌一起轉(zhuǎn)化到cdc25-2酵母菌株中。缺少其C末端區(qū)域的Chp不能結(jié)合PakR，而刪除N末端則對(duì)PakR結(jié)合沒有顯著的影響。這一結(jié)果提示延長的C末端直接參與結(jié)合RakR，或者丟失該區(qū)域?qū)?dǎo)致阻止RakR結(jié)合的Chp構(gòu)象改變。
Chp選擇性激活JNK MAP激酶途徑。我們和其它組的研究顯示，組成上有活性的Cdc42HsV12和RacV12刺激JNK和p38MAP激酶級(jí)聯(lián)(Minden et al.，Cell 811147-1157，1195；Coso et al.，Cell811137-1146，1995)。為了試驗(yàn)是否Chp也對(duì)JNK級(jí)聯(lián)具有相似作用，我們用各種不同形式的Chp連同編碼血凝素表位(HA)并帶有JNK2、ERK2或p38標(biāo)記的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。從被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的提取物中免疫沉淀出JNK、ERK和p38，然后使用常規(guī)底物進(jìn)行體外激酶測(cè)定。野生型和活化的Chp均可刺激JNK激酶。相反，顯性失活形式的Chp并不激活HeLa細(xì)胞中的JNK途徑。如Cdc42和Rac GTP酶的情況一樣，Chp并不顯著地激活ERK2。另外，令人驚奇的是，Chp并不誘導(dǎo)激活p38激酶。這些數(shù)據(jù)提示，與Rac和Cdc42Hs相反，Chp是JNK-MAP激酶級(jí)聯(lián)的，而不是ERK或p38途徑的選擇性激活劑。
Chp與COP共定位在高爾基氏器上。為了確定Chp的細(xì)胞定位，我們將連接到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體上的Myc標(biāo)記的Chp微量注入PAE細(xì)胞中，并用抗myc抗體著染細(xì)胞以顯示Chp的表達(dá)。Chp無例外地濃集到核附近組裝高原基氏器的部位。用識(shí)別高爾基蛋白的抗體-COP對(duì)所注射的細(xì)胞進(jìn)行共染色，可見Chp與外被體蛋白-COP共定位于高爾基氏器處。另外，最近證明內(nèi)源性Cdc42Hs與COP共定位于高爾基氏器上(Erickson et al.，J.Biol.Chem.27126850-26854，1996)。
Chp參與誘導(dǎo)片狀偽足。為了試驗(yàn)Chp是否在控制肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架中起作用，我們將編碼活化的Chp突變體的質(zhì)粒微量注射到細(xì)胞中，并染色顯示Chp表達(dá)或聚合的肌動(dòng)蛋白。Chp濃集在高爾基氏器核附近的一側(cè)，并且被注射的細(xì)胞出現(xiàn)了形態(tài)學(xué)改變誘導(dǎo)了片狀偽足。另外，可見注射Chp的細(xì)胞中缺少應(yīng)力纖維。有關(guān)各種Chp突變體介導(dǎo)的特異性形態(tài)學(xué)改變的充分表征，尚有待進(jìn)一步研究。
材料和方法質(zhì)粒和構(gòu)建體Chp表達(dá)載體將Chp cDNA與myc表位標(biāo)記符合讀框的融合到pCan哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，以產(chǎn)生哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。將ChpcDNA與Src豆蔻?；盘?hào)符合讀框的融合到pYes2表達(dá)載體(Invitrogen Ins)中，以產(chǎn)生酵母表達(dá)載體。按常規(guī)方法將編碼不同的Cdc42突變體的質(zhì)粒亞克隆到pYes2表達(dá)載體中。
Chp誘變按照制造商的說明使用Chameleon誘變?cè)噭┖?Stratagene Inc.)進(jìn)行Chp誘變。
Northern印跡分析使用購自Clontech公司的試劑盒并按生產(chǎn)商提供的使用說明進(jìn)行Northern印跡分析。用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Stratagene Inc.)產(chǎn)生特異性探針。將探針與濾膜于68℃保溫2小時(shí)。室溫下用含有0.1％SDS的2×SSC將濾膜洗3次，然后再于55℃用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗兩次。
Western印跡分析在十二烷基硫酸鈉(SDS)-12.5％聚丙烯酰胺凝膠上分辨蛋白質(zhì)提取物(50g/泳道)，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上后；用抗myc抗體或親和純化的Chp抗體探查之。在第二次保溫過程中，使用結(jié)合到辣根過氧化物酶上的抗小鼠抗體或蛋白A。使用SuperSignal化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒(Promega Inc.)顯現(xiàn)硝酸纖維素膜印跡。針對(duì)連接到KLH上的C末端肽215KLNAKGVRTLSRCRWKK 213產(chǎn)生Chp抗體。將10mg肽偶聯(lián)到10ml瓊脂糖凝膠上進(jìn)行抗體純化。用PBS平衡凝膠后將粗血清過凝膠柱，洗滌后用甘氨酸緩沖液(pH2.0)洗脫抗體。
酵母遺傳操作使用已知方法(參見Aronheim et al.，Mol.CellBiol.173094-3102，1997)進(jìn)行常規(guī)酵母轉(zhuǎn)染和遺傳操作。
轉(zhuǎn)染和體外激酶測(cè)定用CaPO4沉淀法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。用驅(qū)使不同的Chp突變體(5g)表達(dá)的pCan表達(dá)質(zhì)粒及驅(qū)使不同的HA表位標(biāo)記的激酶(5g)表達(dá)的Sr表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，提取蛋白質(zhì)并按已知方法(Hibi et al.，Genes Dev.172135-2148，1993)進(jìn)行體外激酶測(cè)定。用于HA-ERK2、HA-JNK2和HA-p38的下列質(zhì)粒和下列純化的底物(5g/測(cè)定)分別是髓鞘堿性蛋白(MBP)、GST-c-Jun1-79和GST-ATF2。
微量注射和免疫熒光顯微鏡檢在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)PAE細(xì)胞并鋪板在蓋玻片上。將使用注射緩沖液(5mM谷氨酰胺、130mM KCL)稀釋到50ng/ml濃度的編碼Chp的表達(dá)載體微量注射到約100個(gè)亞匯合PAE細(xì)胞的核中。將被注射的細(xì)胞37℃保溫16-20小時(shí)并在4％甲醛中固定。用含有0.1％Triton X-100的PBS透化細(xì)胞并于原始抗Myc或抗COP單克隆抗體(Dr.Richard Khan提供)存在下保溫60分鐘。用含有0.1％Triton X-100的PBS洗蓋玻片并與第二抗體(德克薩斯紅綴合的抗小鼠抗體)保溫30分鐘。為了看到F肌動(dòng)蛋白，再次洗細(xì)胞并與FITC綴合的鬼筆環(huán)肽一起保溫。在配有適于熒光檢測(cè)的濾光片的顯微鏡(Zeiss Axiophot)上進(jìn)行熒光顯微照相。
權(quán)利要求
1.分離的全長度人Chp多肽，或其生物學(xué)活性多肽片段。
2.權(quán)利要求1的分離的Chp多肽，其中所說的多肽具有PAK調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合活性，PAK激酶刺激活性，JNK激酶刺激活性，細(xì)胞骨架再組織活性，或Chp特異性免疫原活性。
3.權(quán)利要求1的分離的人Chp多肽，其包括圖1中列出的氨基酸1至氨基酸236。
4.權(quán)利要求1的分離的人Chp多肽，其包括圖1中列示的氨基酸1至氨基酸236并具有圖1中列出的DNA序列。
5.權(quán)利要求1的分離的人Chp的生物學(xué)活性片段，其中所說的片段包括如圖1所列示的氨基酸1-32、32-211、211-236和215-231。
6.權(quán)利要求1的分離的人Chp的生物學(xué)活性片段，其中所說的片段基本上是由圖1所列示的氨基酸1-32、32-211、211-236和215-231組成的。
7.分離的全長度Chp，或其生物學(xué)活性片段，其由在高度嚴(yán)格條件下與圖1所示DNA序列雜交的，并且與所說的DNA序列具有至少95％序列相同性的核苷酸序列的互補(bǔ)序列所編碼。
8.權(quán)利要求7的分離的全長度Chp或其生物學(xué)活性片段，其可得自天然來源。
9.權(quán)利要求7的分離的全長度Chp，除了氨基酸40為纈氨酸或氨基酸45為天冬酰胺以外，其氨基酸序列如圖1所示。
10.權(quán)利要求7的分離的全長度Chp或其生物學(xué)活性片段，其具有PAK調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合活性，PAK激酶刺激活性，JNK激酶刺激活性，細(xì)胞骨架再組織活性，或Chp特異性免疫原活性。
11.包括編碼全長度人Chp多肽或其生物學(xué)活性多肽片段之核苷酸序列的分離的核酸。
12.權(quán)利要求11的分離的核酸，其中所說的編碼的多肽具有PAK調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合活性，PAK激酶刺激活性，JNK激酶刺激活性，細(xì)胞骨架再組織活性，或Chp特異性免疫原活性。
13.權(quán)利要求11的分離的核酸，其中核苷酸序列編碼如圖1所示的氨基酸1至氨基酸236。
14.權(quán)利要求11的分離的核酸，其具有圖1中所示的核苷酸序列。
15.權(quán)利要求11的分離的核酸，其中核苷酸序列被可操縱地連接到表達(dá)控制序列上。
16.權(quán)利要求11的分離的核酸，其中核酸不中斷地編碼所說的多肽。
17.權(quán)利要求11的分離的核酸，其中核酸進(jìn)一步包括可檢測(cè)的標(biāo)記。
18.在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)由核酸編碼的人Chp多肽的方法，包括在有效地表達(dá)所說多肽的條件下培養(yǎng)包含權(quán)利要求11之核酸的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所說的宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所說的宿主細(xì)胞是酵母。
21.權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括分離含有所說多肽之所說宿主細(xì)胞的膜部分。
22.用權(quán)利要求18的方法生產(chǎn)的分離的人Chp多肽。
23.含有權(quán)利要求11的核酸的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
24.包含權(quán)利要求11之核酸的載體。
25.在高度嚴(yán)格條件下與圖1所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的，并且與所說的核酸有至少95％序列相同性的分離的核酸或其互補(bǔ)序列。
26.權(quán)利要求25的分離的核酸，其序列編碼具有PAK調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、細(xì)胞骨架再組織活性、或Chp特異性免疫原活性的多肽。
27.基本上由選自圖1所示核苷酸序列之12-100個(gè)堿基對(duì)的任何連續(xù)序列或其互補(bǔ)序列組成的分離的核酸。
28.權(quán)利要求27的分離的核酸序列，其進(jìn)一步包括可檢測(cè)的標(biāo)記。
29.權(quán)利要求27的分離的核酸，在所說的序列中至少有1個(gè)但不超過5個(gè)核苷酸取代，并且在高度嚴(yán)格條件下與之或其互補(bǔ)序列雜交。
30.鑒定能夠調(diào)節(jié)人Chp多肽或其生物學(xué)活性多肽片段之JNK激酶刺激活性或PAK激酶刺激活性的化合物的方法，其包括在試驗(yàn)化合物存在下，使人Chp多肽或其生物學(xué)活性多肽片段，在使所說的Chp多肽可有效地刺激JNK或PNK之激酶活性的條件下，與JNK或PAK多肽或其生物學(xué)活性片段接觸，檢測(cè)所說的激酶活性，并且比較有和沒有試驗(yàn)化合物存在時(shí)的激酶活性量，以鑒定試驗(yàn)化合物是否調(diào)節(jié)所說的Chp多肽的所說刺激活性。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所說的接觸是在其中已導(dǎo)入并表達(dá)了編碼所說Chp多肽和所說JNK或PAK多肽之核酸的細(xì)胞中進(jìn)行的。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所說的JNK或PAK多肽進(jìn)一步包括多肽表位。
33.權(quán)利要求32的方法，其進(jìn)一步包括溶解含有所說的已表達(dá)的Chp多肽和JNK或PAK多肽的所說細(xì)胞；在使所說的抗體有效地結(jié)合所說的表位以形成復(fù)合物的條件下，使所說的溶胞產(chǎn)物與抗多肽表位的抗體接觸；分離所說的復(fù)合物，并且檢測(cè)所說的分離的復(fù)合物中的激酶活性。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所說的多肽表位是讀框內(nèi)與所說的JNK或PAK多肽融合的myc或血凝素多肽序列。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所說的人Chp是經(jīng)用纈氨酸取代40位氨基酸即甘氨酸而修飾的。
36.分離用于調(diào)節(jié)人Chp與PakR調(diào)節(jié)區(qū)之間結(jié)合的化合物的方法，其包括在使所說的分子有效地調(diào)節(jié)所說的Chp多肽與所說的PakR調(diào)節(jié)區(qū)域之間結(jié)合的條件下，使人Chp多肽或其生物學(xué)活性多肽片段與試驗(yàn)化合物接觸；并且在有和沒有所說的試驗(yàn)化合物存在下，檢測(cè)所說的Chp多肽與所說的PakR調(diào)節(jié)區(qū)域之間的結(jié)合。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所說的接觸是在其中已導(dǎo)入并表達(dá)了編碼所說的Chp多肽和PakR調(diào)節(jié)區(qū)域之核酸的酵母細(xì)胞系中進(jìn)行的。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所說的Chp多肽是在讀框內(nèi)與N末端V-src豆蔻酰化序列融合的，并且所說的PakR調(diào)節(jié)區(qū)是讀框內(nèi)與Ras融合的。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所說的酵母細(xì)胞系是cdc25-2。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所說的接觸是在其中已導(dǎo)入并表達(dá)了編碼所說的Chp多肽和PakR調(diào)節(jié)區(qū)域的核酸的酵母細(xì)胞系中進(jìn)行的；其中所說的Chp多肽可操縱地連接到可誘導(dǎo)啟動(dòng)子上并在讀框內(nèi)與N末端V-src豆蔻?；蛄腥诤希f的PakR調(diào)節(jié)區(qū)在讀框內(nèi)與Ras融合。
41.鑒定可調(diào)節(jié)人Chp多肽或其生物學(xué)活性片段之細(xì)胞骨架再組織活性的化合物的方法，其包括在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入可有效地刺激所說細(xì)胞的細(xì)胞骨架再組織的活化形式的人Chp多肽，或其生物學(xué)活性片段；在使試驗(yàn)化合物有效地調(diào)節(jié)所說多肽在刺激所說細(xì)胞之細(xì)胞骨架再組織中的作用，從而可觀察所說的細(xì)胞骨架以檢測(cè)這種作用的條件下，使所說的細(xì)胞與所說的試驗(yàn)化合物接觸；并且在有和沒有所說的試驗(yàn)化合物存在下觀察所說的細(xì)胞骨架。
42.對(duì)人Chp的多肽序列特異的分離的抗體。
43.權(quán)利要求42的分離的抗體，其與選自圖1的氨基酸序列結(jié)合。
44.權(quán)利要求42的分離的抗體，其中所說的多肽序列是KLNAKGVRTLSRCRWKK。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的全長度Chp多肽,其生物學(xué)活性多肽片段,及編碼該多肽或其片段的核酸。該多肽在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有各種不同的活性,如包括PAK調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合活性、PAK激酶刺激活性、JNK激酶刺激活性、細(xì)胞骨架識(shí)別活性,或Chp特異性免疫原活性。本發(fā)明涉及Chp或其同系物的所有方面,包括調(diào)制劑、激活劑、配體等的測(cè)定法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1367836SQ99816445
公開日2002年9月4日 申請(qǐng)日期1999年8月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月7日
發(fā)明者A·阿博, A·阿諾希姆 申請(qǐng)人:昂尼克斯藥物公司