專利名稱：發(fā)光試樣的測定方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使含有ATP再生酶的發(fā)光試藥與試樣起作用，來測定腺苷磷酸酯類的方法及裝置。
背景技術(shù)：
已知，當(dāng)檢測由細菌或食品引起的污染時，可利用熒光素酶及適當(dāng)?shù)脑囁幰韵佘杖姿?以下，稱為ATP)為指標(biāo)通過發(fā)光反應(yīng)來測定。
但是，該光的輸出極小，在現(xiàn)有技術(shù)中，為了得到可測定的輸出，在光檢測裝置中利用了光電倍增管。但是，由于該光電倍增管需要高電壓，故必須有電壓變換裝置及用于安全的對策。因而，具有除了裝置變得大型之外，成本也高這樣的缺點。
此外，作為光檢測裝置使用了雪崩光二極管也是已知的(WO 90/04775)。由于雪崩光二極管通常要求0℃～5℃的使用溫度，故該裝置需要用于雪崩光二極管的溫度穩(wěn)定系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有與該雪崩光二極管相鄰地安裝的、珀爾帖(Peltier)效應(yīng)型的熱泵，接受來自溫度控制電路的電流供給，以便對雪崩光二極管進行冷卻。因而，具有裝置也變得復(fù)雜，成本也高這樣的缺點。
因此，本發(fā)明人著眼于不需要高電壓、高電流的電源，不受溫度影響的硅光電二極管。但是，該硅光電二極管的靈敏度較低，有時難以檢出通常的生物發(fā)光。
另一方面，如特開平9-234099號中公開的那樣，本發(fā)明人的一部分提案了題為「生物發(fā)光試藥；使用了該試藥的腺苷磷酸酯的定量法；以及使用了該試藥的、與ATP變換反應(yīng)系有關(guān)的物質(zhì)的定量法」的發(fā)明。該發(fā)明為下述的方法，利用至少含有丙酮酸酯正磷酸鹽二激酶(EC2.7.9.1)，(以下，稱為PPDK)等的ATP再生酶的試藥構(gòu)成生物發(fā)光試藥，通過發(fā)光反應(yīng)以高靈敏度來檢測腺苷磷酸酯類。
因此，本發(fā)明人進一步認真研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)含有PPDK等的ATP再生酶的發(fā)光試藥所產(chǎn)生的發(fā)光量來檢測腺苷磷酸酯類，如果利用硅光電二極管測定該發(fā)光量，則可用簡便的裝置檢測出腺苷磷酸酯類、即污物，完成了本發(fā)明。
發(fā)明的公開按照本發(fā)明第1方面提供以下述方式進行的試藥的測定方法，利用含有ATP再生酶的發(fā)光試藥使腺苷磷酸酯類發(fā)光，利用硅光電二極管測定其發(fā)光量。
按照本發(fā)明第2方面還提供包含下列部件的發(fā)光試樣的測定裝置收存在收存室內(nèi)的檢查用器具；用于對來自上述檢查用器具的發(fā)光進行受光的硅光電二極管；以及基于由該硅光電二極管輸出的信號，對上述發(fā)光量進行運算使之?dāng)?shù)值化的運算裝置。
詳細地說，提供下述污染的測定裝置，包含用于收存對污物進行取樣、使該污物發(fā)光的檢查用器具的收存室；用于對其射出光進行受光的硅光電二極管；以及用于測定已受光的光的運算裝置，而且，具備操作面板及顯示面板。
硅光電二極管為受光靈敏度比光電倍增管稍低，但與低強度的光起作用而輸出可測定的電信號的半導(dǎo)體元件。硅光電二極管的電路部中，不需要高電壓或高電流的電源，作為電源可使用電池。又，與其它一般二極管、例如雪崩光二極管相比，硅光電二極管受溫度變化的影響小，不需要溫度穩(wěn)定裝置。再，與光電倍增管相比，硅光電二極管較牢固，即使暴露在強光下也不受壞影響。因而，與現(xiàn)有的裝置相比，本發(fā)明測定清潔度的測定裝置可大幅度地實現(xiàn)小型化、輕量化及低成本。
本發(fā)明中使用的發(fā)光試藥為含有PPDK等ATP再生酶的試藥，也可附加到熒光素、熒光素酶發(fā)光試藥中使用。含有ATP再生酶的發(fā)光試藥不僅與ATP，還與腺苷二磷酸(以下，稱為ADP)、腺苷一磷酸(以下，稱為AMP)及核糖核酸(以下，稱為RNA)反應(yīng)而發(fā)光，而且呈現(xiàn)為穩(wěn)定的高強度的發(fā)光。因而，可彌補與光電倍增管相比，硅光電二極管受光靈敏度稍低這樣的缺點。
本申請發(fā)明中所謂的污物為包含ATP、ADP、AMP、RNA等腺苷磷酸酯類的污物，可優(yōu)選地舉出在清潔度檢查中已檢查的污物。
本申請發(fā)明中所謂的ATP再生酶，只要是對于從AMP生成ATP的反應(yīng)起觸媒作用的酶就什么都可以。例如，可舉出磷酰烯醇丙酮酸酯連接酶(EC2.7.9.2)。又，也可把腺苷酸激酶(EC2.7.4.3)與丙酮酸酯激酶(EC2.7.1.40)組合使用，從AMP生成ATP?？蓛?yōu)選地使用PPDK。
本發(fā)明中使用的PPDK為在鎂金屬離子存在下與AMP、磷酰烯醇丙酮酸及焦磷酸起作用，對生成ATP、丙酮酸及焦磷酸的反應(yīng)起觸媒作用的酶。其理化性質(zhì)及制法是已知的，可容易地得到(參照特開平9-234099號)。
作為含有ATP再生酶的發(fā)光試藥，例如把PPDK附加到包含熒光素、熒光素酶及金屬鹽的發(fā)光試藥中使用，但是，如果同時附加磷酰烯醇丙酮酸及焦磷酸則可得到更好的效果。通過使用這種試藥，除了測定作為污物指標(biāo)分量的ATP之外還能同時測定AMP，并能以高靈敏度檢測少量的污物。如果在含有上述ATP再生酶的發(fā)光試藥中還并用對于從ADP生成ATP的反應(yīng)起觸媒作用的酶和/或RNA分解酶，則除了ATP及AMP的檢測之外還能同時測定ADP及RNA，也能檢測更少量的污物。
在實施本發(fā)明時，用棉棒擦被試驗表面的污物，把上述棉棒浸入到含有用于從細菌類等污物中提取ATP、ADP、AMP或RNA等腺苷磷酸酯類的界面激活劑的提取試藥中。把這樣得到的取樣液與含有PPDK等ATP再生酶的發(fā)光試藥混合，用污染測定裝置測定從該已混合的發(fā)光試藥中發(fā)出的發(fā)光量，由此，可檢測檢體的污染。較為理想的是，如果使用棉棒、提取試藥及發(fā)光試藥已形成為一體的清潔度檢查用器具、即擦取檢查用器具就能更簡便地進行檢查。
如果用具備了含有該PPDK等ATP再生酶的發(fā)光試藥的擦取檢查用器具來構(gòu)成裝置，就能提供小型化、輕量化、低成本且靈敏度高的清潔度檢查方法。即，用擦取檢查用器具的棉棒擦進行試驗的檢體表面，把該棉棒浸入到該器具中具備的提取試藥中，使所得到的試樣液與同樣在該器具中具備的、含有PPDK等ATP再生酶的發(fā)光試藥反應(yīng)，連擦取檢查用器具一起設(shè)置在清潔度檢查裝置中，從所得到的發(fā)光量來測定污物的量。
這樣，由于在本發(fā)明中作為發(fā)光試藥使用了含有PPDK等ATP再生酶的發(fā)光試藥，故發(fā)光較強且穩(wěn)定，即使使用硅光電二極管也能檢測其發(fā)光，可使裝置小型化、輕量化、
附圖的簡單說明

圖1為示出污染的測定裝置的概略剖面圖；圖2為示出運算裝置具體例的框圖；圖3為具有顯示面板及操作面板的污染測定裝置的正視圖；以及圖4為詳細地示出了擦取檢查用器具的剖面圖。
用于實施發(fā)明的最佳形態(tài)以下，基于附圖，詳細地說明本發(fā)明較為理想的幾個實施例。
圖1中，污染測定裝置1具有作為外殼的本體2。在該本體2內(nèi)收存擦取污物進行生物發(fā)光反應(yīng)的擦取檢查用器具3；使該擦取檢查用器具3的發(fā)光聚光的聚光透鏡4；使來自該透鏡4的光變換成電信號的硅光電二極管5；以及對于來自該硅光電二極管的電信號進行處理的運算裝置46。
如圖3所示，在上述本體2上設(shè)置了操作面板7及顯示面板8。如圖2所示，這些操作面板7及顯示面板8與運算部46電連接。操作面板7指示測定用的規(guī)格。顯示面板8顯示測定結(jié)果。
本體2具有用于收存擦取檢查用器具3的收存室9。把擦取檢查用器具3放置在設(shè)置于上述收存室9內(nèi)的臺式構(gòu)件10上，使之總是保持為恒定位置。配置在擦取檢查用器具3背面上的反射鏡11使更大的發(fā)光量通過聚光透鏡4傳送給硅光電二極管5。
圖2示出圖1所示污染測定裝置1的電功能框圖。
圖2中，污染測定裝置1具有電源電路部41；放大器42；A/D變換部43；運算部46；顯示部8；操作部7；以及外部接口47。
電源電路部41可接受直流電源及交流電源此二者。
放大器42用于根據(jù)擦取檢查用器具3發(fā)光的強弱、即來自硅光電二極管5的電信號的強弱，對其輸出進行電壓變換及放大。由A/D變換部43對于由該放大器42輸出的信號進行數(shù)字化、供給運算部46。
運算部46由CPU44及存儲器構(gòu)成。CPU44把由硅光電二極管5輸出的信號數(shù)值化并使顯示部8顯示其數(shù)值，或者與預(yù)先存儲在存儲器45中的污染度數(shù)據(jù)進行比較運算、把數(shù)值比該污染度閾值高的情況作為有清洗的必要性加以判斷并使顯示部8顯示這個意思。
操作部7進行測定數(shù)據(jù)的保存、或?qū)⒃摂?shù)據(jù)通過外部接口47朝向打印機的發(fā)送、或朝向遙遠地點的發(fā)送，或者進行朝向存儲器45的數(shù)據(jù)輸入。
在上述擦取檢查用器具3中，作為發(fā)光試藥只要能夠利用PPDK等ATP再生酶的，就什么樣的結(jié)構(gòu)都可以，作為一例示于圖4。
圖4中，擦取檢查用器具3主要由檢體取樣器12及作成試管狀的發(fā)光試藥容器13構(gòu)成。該檢體取樣器12由檢體擦取器14；提取液容器15；作成管狀的檢體取樣器12的取樣器本體16構(gòu)成。
利用例如由鋁箔形成的密封材料18把發(fā)光試藥容器13的開口部17封閉，密閉發(fā)光試藥容器13。
檢體擦取器14由棉棒21及保持該棉棒21的保持構(gòu)件22構(gòu)成。上述棉棒21由棒狀的棉軸19及在其下端部形成為卵狀而設(shè)置的棉部20構(gòu)成。
上述保持構(gòu)件22具有下段的小直徑部23及上段的大直徑部24。在小直徑部23與大直徑部24的邊界上形成了臺階部25。該臺階部25與上述取樣器本體16的上端部26適當(dāng)接觸，使檢體取樣器14在取樣器本體16中向下運動時總是停止在一定的位置上。
檢體取樣器14以裝卸自由的方式安裝于取樣器本體16內(nèi)。為了在用上述棉棒21對檢體表面進行了擦取后對污物進行取樣，把該檢體取樣器14安裝于取樣器本體16內(nèi)。
把用于提取通過擦檢體而附著于棉棒21的棉部20上的污物的提取液32封入上述提取液容器15內(nèi)。在該提取液容器15的上下端部進行了開口，在用密封材料27把下部密封后注入上述提取液32，其次，用密封材料28把上部密封、封入提取液32。該密封材料27、28是由利用上述棉棒21的按壓容易破開的程度的材料、例如鋁箔形成的。
檢體取樣器12的取樣器本體16由上下端部開放的管狀構(gòu)件構(gòu)成。在該取樣器本體16的下方內(nèi)壁面上形成了作成環(huán)狀的凸起部29。在該凸起部29的下方延伸設(shè)置了與該凸起部29一體形成的飛散防止部30。把上述發(fā)光試藥容器13向上方推上去，由此，利用飛散防止部30的銳角部31破開密封材料18。由棉部20提取的污物與提取液一起落入發(fā)光試藥容器13中而被送出，進行發(fā)光反應(yīng)，檢測污物。
其次，說明上述擦取檢查用器具3的作用。
首先，從取樣器本體16拔出檢體擦取器14，利用棉部20擦檢體表面對污物進行取樣。其次，在把對污物進行了取樣的檢體擦取器14插入到取樣器本體16內(nèi)之后，把發(fā)光試藥容器13推上去把該容器13的密封材料18推到飛散防止部30的銳角部31上、把該密封材料18戳破。
其次，如果壓下檢體擦取器14，則棉棒21破開密封材料28，棉部20進入提取液容器15的內(nèi)部。在檢體擦取器14的保持構(gòu)件22的臺階部25與取樣器本體16的上端部26適當(dāng)接觸之前，還壓下上述檢體擦取器14，利用棉棒21破開密封材料27。
其后，使整個擦取檢查用器具3在上下方向上輕輕地搖動，上述提取液32落入發(fā)光試藥容器13內(nèi)，發(fā)光試藥33與含有細菌或污物的提取液32混合，該部分例如通過發(fā)光反應(yīng)而發(fā)光。然后，把擦取檢查用器具3安裝到污染測定裝置1的收存室9內(nèi)，來測定發(fā)光量、即污物的量。
在本發(fā)明中，作為上述擦取檢查用器具3中的發(fā)光試藥33，使用含有PPDK等ATP再生酶的發(fā)光試藥。
以上，示出了檢體擦取之例，但是，作為另一例，也可以做成把成為檢查對象的液體、固體、粉末等投入到收存了試藥的試管內(nèi)，以便測定其污物的量。
又，本發(fā)明的裝置，作為試樣不僅能測定生物發(fā)光的，還能測定化學(xué)發(fā)光或熒光的試樣。
其次，示出實施例，以數(shù)值方式示出本申請發(fā)明的效果。酶的單位為國際單位。
實施例1含有PPDK的發(fā)光試藥的組成DETA(乙二胺四醋酸鹽)1.0mM二硫蘇糖醇 1.0mM硫酸銨 3.75mM焦磷酸 0.3mM
磷酰烯醇丙酮 2.1mM熒光素 0.75mM硫酸鎂 7.5mMBSA(牛血清白朊)0.5％蔗糖 5.0％熒光素酶 2.5mg/mlPPDK 1.5U/ml腺苷磷酸脫氨基酶 0.05U/mlHEPES(50mM)pH7.8提取試藥的組成氯化芐叉毒芹 0.02％HEPES(10mM)pH7.8把上述組成的、含有PPDK的發(fā)光試藥冷凍干燥后封入圖4所示的擦取檢查用器具3的發(fā)光試藥容器13內(nèi)，同時，把上述組成的提取試藥封入提取液容器15內(nèi)(有PPDK)。
另一方面，把從上述組成中只去除了PPDK的發(fā)光試藥冷凍干燥后同樣封入發(fā)光試藥容器內(nèi)。但是，把與上述相同的提取試藥設(shè)置在提取液容器15內(nèi)(無PPDK)。
作為由食品引起的污物標(biāo)本，在把擦取檢查用器具3的棉棒21浸入到用超純水把市售的酵母精、牛肉精、麥芽精、啤酒及牛乳稀釋成各濃度液體內(nèi)之后，壓入棉棒保持器，把棉棒頭部浸入到提取試藥內(nèi)，又壓入棉棒保持器，把溶入了污物的提取試藥送入到加入了發(fā)光試藥的冷凍干燥物的發(fā)光試藥容器13內(nèi)，使之進行發(fā)光。
其次，連擦取檢查用器具3一起設(shè)置在使用了硅光電二極管的污染測定裝置1中，測定了發(fā)光量。用相對發(fā)光量RLU來表示測定值，其結(jié)果示于表1。
表1使用了硅光電二極管的污物測定裝置產(chǎn)生的各試樣的測定值

從表1可知，在使用了不包含PPDK的發(fā)光試藥的情況(無PPDK)下，由于只得到ATP引起的發(fā)光量。此外，發(fā)光量急劇衰減而不穩(wěn)定，故在大多數(shù)情況下測定值為0。另一方面，在含有PPDK的發(fā)光試藥的情況(有PPDK)下，由于除了ATP之外、還得到了食品中大量包含的AMP引起的發(fā)光、發(fā)光量也穩(wěn)定，故能夠以高靈敏度來測定污物。
實施例2為了分配米飯把使用過的飯與在水里輕輕洗涮，用在實驗例1中使用了的擦取檢查用器具3的棉棒21擦取其表面的約10cm2，同樣使其發(fā)光并測定發(fā)光量。無PPDK的情況的測定值為0，但有PPDK的情況的測定值為834RLU。
實施例3在包裝咖啡提取液的裝置中，在水里輕輕清洗分注口附近之后，用在實驗例1中使用了的擦取檢查用器具3的棉棒21擦取該分注口表面的約10cm2，同樣使其發(fā)光并測定發(fā)光量。無PPDK的情況的測定值為0，但有PPDK的情況的測定值為675RLU。
實施例4在中國湯面的制造裝置中，在水里輕輕清洗切斷面條的切刀之后，用在實驗例1中使用了的擦取檢查用器具3的棉棒21擦取該切刀表面的約10cm2，同樣使其發(fā)光并測定發(fā)光量。無PPDK的情況的測定值為0，但有PPDK的情況的測定值為1660RLU。
實施例5在實施例1中，把含有PPDK的發(fā)光試藥的組成的試藥的情況定為有PPDK，把從該組成中只去除了PPDK的組成的發(fā)光試藥的情況定為無PPDK。把有PPDK及無PPDK各200μl分別取樣到試管中，并附加了用超純水把市售的烏龍茶稀釋成0.01％的各100μl。將其設(shè)置在污染測定裝置1中，測定了發(fā)光量。用相對發(fā)光量RLU來表示測定值。無PPDK的情況的測定值為6RLU，但有PPDK的情況的測定值為618RLU。
工業(yè)上利用的可能性如上所述，可以把本發(fā)明的污染測定裝置構(gòu)成為，把發(fā)光量測定裝置、棉棒、提取試藥及發(fā)光試藥全部收存在攜帶用外殼內(nèi)，可以搬運，作為清潔度檢查用整套工具是有用的。
可以把上述發(fā)光量測定裝置應(yīng)用于其它多種試樣的試驗，例如食品工業(yè)中的原料及最終制品的試驗、試藥、水質(zhì)及臨床用試樣等的試驗中。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)光試樣的測定方法，其特征在于，利用含有ATP再生酶的發(fā)光試藥使腺苷磷酸酯類發(fā)光，利用硅光電二極管測定其發(fā)光量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的發(fā)光試樣的測定方法，其特征在于，上述ATP再生酶為丙酮酸酯正磷酸鹽二激酶。
3.一種發(fā)光試樣的測定裝置，其特征在于，包含收存在收存室內(nèi)的檢查用器具；用于對來自上述檢查用器具的發(fā)光進行受光的硅光電二極管；以及基于由上述硅光電二極管輸出的信號，對上述發(fā)光量進行運算使之?dāng)?shù)值化的運算裝置。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的發(fā)光試樣的測定裝置，其特征在于，上述檢查用器具為擦取檢查用器具。
5.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的發(fā)光試樣的測定裝置，其特征在于，上述檢查用器具為試管。
6.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的發(fā)光試樣的測定裝置，其特征在于，上述擦取檢查用器具具有含有ATP再生酶的發(fā)光試藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的發(fā)光試樣的測定裝置，其特征在于，上述ATP再生酶為丙酮酸酯正磷酸鹽二激酶。
全文摘要
在本發(fā)明中,提供測定腺苷磷酸酯類來測定檢體污物的方法。利用含有ATP再生酶的發(fā)光試藥(33)使上述腺苷磷酸酯類發(fā)光。利用硅光電二極管(5)檢測該發(fā)光量來測定污物。
文檔編號C12M1/34GK1338003SQ9981638
公開日2002年2月27日 申請日期1999年12月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月28日
發(fā)明者榊原達哉, 五十嵐俊教, 村上成治, 羽毛田靖 申請人:龜甲萬株式會社 被以下專利引用 (2),