專利名稱：水稻抗病相關(guān)基因及其編碼蛋白與獲得一種提高水稻廣譜抗病性品系的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是從水稻日本睛中克隆出AsMW基因全長cDNA。通過水稻遺傳轉(zhuǎn)化，獲得AsMW基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，分別對轉(zhuǎn)基因植株及非轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行白葉枯病抗病性分析及水楊酸含量的測定。結(jié)果表明《sMW基因與水稻廣譜抗病性能顯著相關(guān)。
背景技術(shù)：
水稻不僅是重要的糧食作物，還是植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要的模式生物。在水稻生產(chǎn)過程中，由于受稻瘟病、紋枯病、白葉枯病等病害的影響，一直是糧食生產(chǎn)面臨的ー個重要難題。在現(xiàn)行防治條件下，全國平均毎年因各種稻病造成稻谷減產(chǎn)達(dá)200億公斤。目前生產(chǎn)上仍然主要以農(nóng)藥防治為主，但是使用農(nóng)藥防治病害有一定農(nóng)藥殘留，影響到糧食安全，并且有些水稻的病毒病，目前沒有特效農(nóng)藥防治，病害一旦發(fā)生將使水稻減產(chǎn)10%-20%。水稻的病害給生產(chǎn)上帯來巨大的損失，直接影響到國家的糧食安全。因此，研究和防治水稻病害具有十分重要的意義。實(shí)踐證明培育和利用抗病品種是解決上述問題最經(jīng)濟(jì)而有效的方法。傳統(tǒng)的抗病育種由于需要抗病種質(zhì)資源的長期保存、周期性的繁殖和鑒定，必然耗資多、工作量大，而且還不可避免地伴隨著部分種植資源的丟失；即使獲得新的抗源，植株水平的雜交重組也存在新抗病性狀與不良性狀同時引入的問題，從而很難擺脫育種周期長、抗性親本缺乏及效率低的窘境，很難得以推廣。而通過基因工程改良的目前往往大多是使用一些?；目共』?R基因)來改良和提高植物的抗病性能。但是這種特異的抗性基因經(jīng)常會隨著病原菌小種的變異而失去抗性。植物在長期進(jìn)化過程中，為了抵抗病原微生物的侵害，植物體內(nèi)存在著可誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)，包括SAR (System Acquired Resistance系統(tǒng)獲得抗性)和ISR (InducedSystemic Resistance誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性)。SRA途徑是目前研究最多的途徑。植物病原侵染后，非侵染部位在一段較長時期內(nèi)都保持著對這種病原及一些其它病原的增強(qiáng)抗性，即系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired Resistance, SAR,)或廣譜抗性。控制這種SAR的一個關(guān)鍵基因是(non-expresser of PR genes)。Λ7%/基因編碼一個錨定蛋白重復(fù)序列蛋白(ankyrin repeat),于1997年在模式生物擬南芥中克隆并報(bào)道。ΛΡ/tV正調(diào)控?cái)M南芥中的SAR反應(yīng)，在擬南芥中過量表達(dá)#/況2后，可明顯增強(qiáng)擬南芥對病原微生物的抗性，而#/況7的缺失會導(dǎo)致PR基因不表達(dá)，以及植株SAR抗性的喪失。目前擬南芥中又克隆了MNNPR4等一系列控制植物SAR反應(yīng)的關(guān)鍵基因。(suppressor of npr-1, constitutive,I)，是ー類TIR-NBS-LRR類型廣譜抗病基因，在擬南芥中已經(jīng)克隆并已報(bào)道。#似(modifierof scnl)是SAR信號通路中的另一重要廣譜抗性基因，編碼ー個含Nup96的核孔蛋白。在
過表達(dá)的擬南芥中，植株體內(nèi)水楊酸的含量明顯提高并誘導(dǎo)相應(yīng)病程相關(guān)蛋白PRl和PR2的表達(dá)，從而增強(qiáng)植株對各種病原微生物的抗病性能。然而，但目前在水稻中還未見報(bào)道本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對于水稻中的^modifier of scnl in rice),與擬南芥中的M0S3相比，具有相似的序列，都含有ー個Nup96的核孔蛋白，控制著物質(zhì)與信息的出核與入核運(yùn)輸，同時表現(xiàn)出對各種病原菌的廣譜抗性。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明利用重疊PCR技術(shù)(overlap PCR)首次在水稻日本睛中分離克隆出ー個廣譜抗病相關(guān)基因OsMOS基因cDNA全長所述基因序列和蛋白序列如序列表SEQ ID NO: I和SEQID NO:2 所示。本發(fā)明利用基因工程方法，通過使目的基因過表達(dá)，構(gòu)建了 AsMW過表達(dá)載體。提供了一種較佳的實(shí)施方案，使所述基因在相關(guān)表達(dá)載體中高效表達(dá)。本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化上述表達(dá)載體宿主細(xì)胞的一套較佳的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)施方案。本發(fā)明涉及克隆及分析ー種OsMOS基因的cDNA全長。該基因提高水稻自由態(tài)水楊酸的含量并賦予水稻對白葉枯病引起的病害產(chǎn)生抗性。從而鑒定該基因在抗病反應(yīng)中的所起的作用，為利用該基因培育水稻廣譜抗病性能奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明闡述As#似基因的克隆及功能驗(yàn)證過程。轉(zhuǎn)入植株后，為提高植物廣譜抗病性提供了ー種方法。有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
MOS為SAR信號途徑中的關(guān)鍵基因，在植株的廣譜抗病性中起著十分重要的作用。本發(fā)明首次在水稻中報(bào)道與擬南芥相關(guān)基因OsMOS,并通過重疊PCR克隆出水稻fls#a cDNA全長。將AsMW導(dǎo)入水稻中，使其過表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因后代水稻。首次功能驗(yàn)證了 AsMW過表達(dá)明顯提高了水稻體內(nèi)自由態(tài)水楊酸的含量，在幼葉期及孕穗期對白葉枯病有著明顯的抗性。為減少水稻病蟲害，提高水稻廣譜抗病性，提供ー種新的解決途徑。


圖I為轉(zhuǎn)基因植株與對照植株的自由態(tài)水楊酸的含量柱狀 圖2為圖2轉(zhuǎn)基因植株與對照植株在幼葉期及孕穗期對白葉枯病的不同抗性，其中A為幼葉期，B為孕穗期；
圖3為水稻日本睛RNA的電泳圖。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例I
I.Trizol法提取日本睛總RNA
(1)稱取O. Ig 新鮮、幼嫩的日本睛葉片 QOryza. Sati va L. spp. japonica, varnipponbare,AA genome,鑒定人程備久教授)，加液氮迅速研磨，轉(zhuǎn)移到I. 5mL的離心管(液氮預(yù)冷)中。并在離心管中加入ImL Trizol，冰上放置IOmin ；
(2)4°C, 13000rpm,離心 20min ；
(3)轉(zhuǎn)移上清于一新管，加入250uL的5MNaCl，250uL氯仿/異戊醇，劇烈震蕩15S，冰上放置3 min ；
(4)4°C，13000rpm,15min ；(5)轉(zhuǎn)移清于另ー個新離心管中，加500uL異丙醇混勻，室溫放置IOmin；
(6)4°C，13000rpm,15min ；
(7)棄去上清，加入500uL75%こ醇，洗滌；
(8)4°C,7500rpm,5min,倒掉こ醇,倒放在紙上,室溫放干；
(9)カロ20 30uL DEPC水，65 °C水浴保溫15_30min后，離心；
(10)檢測。電泳檢測取2μ L DEPC水溶解的RNA，加入I μ L上樣緩沖液(O. 25%ニ甲苯青，O. 25%溴酚藍(lán)，30%甘油水溶液)，I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，20分鐘后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見明顯的3條帶，分別為55，185，285。18 S為28S的兩倍亮。并通過NanoDrop檢測，Α260/Α280為I. 933，RNA濃度為1779. 40 ng/μ L。表明水稻日本睛RNA提取成功。如圖3所示。兩步法反轉(zhuǎn)錄(promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒)
(O反轉(zhuǎn)錄體系
總 RNA2μ
25mM Mgcl24μ
Reverse Transcription IOX Buffer2
IOmM dNTP Mixture2
Ribonuclease inhibitor (ll^g /l^L)0. 5
Oligo (dT) 15 Primer (0.5Kg/KL)Ι
MMLV Reverse Transcriptase (15u/ )Ι
Nuclease-Free Water7. 5
Total20
(2)小心混勻，42°C溫浴40min，然后95°C加熱5min，冰上放置5min終止反應(yīng)，即獲得相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。重疊PCR擴(kuò)增OsMOS基因
根據(jù)AsMW基因中內(nèi)含子的分布情況，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)4對引物(AF，AR，BF,BR)，其中AF含酶切位點(diǎn)及 H I，BR含酶切位點(diǎn)5^ I。AR與BF反向重復(fù)。引物序列如下參見SEQ NO :5-8，具體為
AF :5’-cgcGGATCCATGTCTTCCGACCCGGTGTT-3’
AR :5’-AGTATTCATTGTAAAGAGCCAGAGCGTCAT-3’
BF :5’-ATGACGCTCTGGCTCTTTACAATGAATACT-3’
BR :5’-gccGAGCTCTCAGTCCCTGCAAAGTATGT-3
弓丨物AF，AR擴(kuò)增出OsMOS A段，引物BF，BR擴(kuò)增出OsMOS B段，然后利用弓丨物AF、BR，通過重疊PCR擴(kuò)增對As#似基因cDNA全長。段的擴(kuò)增 (I) PCR反應(yīng)體系
IOXPCRbuffer5μ
IOmM dNTP5μ
10 μΜ 引物 AFI μ
10 μΜ 引物 ARI μ Pfu polymerase0. 5
cDNA2μ
ddH2035. 5μ
Total50|^L
(2)最佳反應(yīng)條件為94で預(yù)變性 IOmin
94で變性30 s
52 °C退火30 s35個循環(huán)
72 °C 延伸3 min
72 °C延伸IOmin
3. 2 OsMOS B段的擴(kuò)增
(1)PCR反應(yīng)體系
IOXPCRbuffer5μ
IOmM dNTP5μ
10 μΜ 引物 BFI μ
10 μΜ 引物 BRI μ
Pfu polymeraseO. 5M-L
cDNA2μ
ddH2035. 5μ
Total50M-L
(2)最佳反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性IOmin94°C 變性 30 s
58°C退火30 s35個循環(huán)
72°C延伸3 min
72°C 延伸IOmin
3. 3 fls#0 cDNA 全長(A 段 + B 段)
(1)PCR反應(yīng)體系
IOXPCRbuffer5μ
IOmM dNTP5μ
10 μΜ 引物 AFI μ
10 μΜ 引物 BRI μ
Pfu polymerase0. 5M-L I
A段PCR回收產(chǎn)物WL
B段PCR回收產(chǎn)物WL
ddH2035. 5μ
Total50M-L
(2)最佳反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性IOmin94°C 變性 30 s
57°C退火30 s35個循環(huán)
72°C延伸5 min72°C 延伸 IOmin
擴(kuò)增后的產(chǎn)物在含有0.5 Kg/mL溴化こ錠(Ethidium Bromide)的O. 8 %瓊脂糖凝膠上電泳。OsMOS A段大小為1475 bp，其核苷酸序列為序列表SEQ ID No:3 ； OsMOS B段大小為1543 bp，其核苷酸序列為序列表SEQ ID No:4 -,OsMOS全長為3018 bp，其核苷酸序列為序列表SEQ ID No: I。
5.PCR擴(kuò)增片段的純化
(1)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分離要純化的片段；
(2)用干凈的無菌手術(shù)刀切下目的DNA條帶放入預(yù)稱重的I.5 mL eppendorf管；
(3)每O.I g瓊脂糖凝膠需加入200 uL SI溶液；
(4)于50で溫育，直至瓊脂糖完全融解；
(5)每5Ug(不足5 ug，以5 Ug計(jì))DNA需加入5 uL DNA結(jié)合液(玻璃粉懸液)，輕輕顛倒混勻，冰上放置10 min ；
(6)室溫6000 rpm 離心 20 s ；
(7)棄上清，加700uLこ醇洗液，輕輕抽吸，使玻璃粉懸浮，冰上放置5 min ；
(8)重復(fù)(6)、(7)步,6000rpm,離心20 s ;棄上清,小心去除全部殘液;
(9)加30 50uL TE，輕輕吹打懸浮玻璃粉，50で溫育10 min ；
(10)室溫6000rpm離心20 s,吸上清至新的eppendorf管，于4 °C或-20 °C保存?zhèn)溆谩?br> 6.過表達(dá)載體的構(gòu)建
將上述純化的OsMOS基因全長序列，連接到克隆載體pMD18-T Vector (寶生物公司)，再轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞(寶生物公司)中，挑選陽性菌落接種到5mL含100mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm的搖床中培養(yǎng)12-16小時，提取質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，測序驗(yàn)證正確。然后通過及 H !,Sac I分別酶切含有As#似的PMD18陽性克隆以及P1301植物表達(dá)載體(本實(shí)驗(yàn)室保存，P1301植物表達(dá)載體的制備方法參照專利號201110208640. 8)。酶切反應(yīng)體系為30 μ ，如下所示
權(quán)利要求
1.一種水稻抗病相關(guān)基因，其特征在于，它具有序列表中SEQ ID N0:1所示的核酸序列或其互補(bǔ)序列。
2.一種水稻抗病相關(guān)基因的編碼蛋白，SEQ ID N0:2，或相對于SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列有一個或多個氨基酸缺失、替代或插入且具有OsMOS廣譜抗病生物活性的蛋白的氨基酸序列。
3.—種表達(dá)載體，其特征在于所述載體包含權(quán)利要求I所述的全長核酸序列以及與該核酸序列的上游表達(dá)調(diào)控元件，以組成型啟動子CaMV35S啟動基因表達(dá)，以潮霉素為篩選標(biāo)記，構(gòu)建OsMOS基因過表達(dá)載體。
4.一種宿主細(xì)胞,其特征在于,來自水稻,被權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，并將目的基因整合到其基因組上。
5.獲得一種提高水稻廣譜抗病性品系的制備方法，其特征在于 (1)將權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體導(dǎo)入4所述植物的細(xì)胞內(nèi)； (2)培養(yǎng)所述植物的細(xì)胞以產(chǎn)生再生的植物； (3)使權(quán)利要求I所述的一個水稻抗病相關(guān)基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而獲得廣譜抗病性有所提聞的植物品系。
全文摘要
本發(fā)明屬于水稻基因工程技術(shù)領(lǐng)域的利用廣譜抗病相關(guān)基因OsMOS提高水稻抗病性能的方法。本發(fā)明從水稻日本晴中克隆出OsMOS基因全長cDNA，連接到植物載體中,以組成型啟動子CaMV35S啟動基因的表達(dá)，構(gòu)建OsMOS基因的過表達(dá)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過多重PCR檢測篩選標(biāo)記基因潮霉素及目的基因OsMOS，并對轉(zhuǎn)基因水稻的體內(nèi)自由態(tài)水楊酸(FreeSA)進(jìn)行測定，白葉枯病抗性接種鑒定。結(jié)果表明OsMOS過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株FreeSA的含量明顯高于對照植株，對白葉枯病具有更高的抗病性。從而提供了一種獲得水稻廣譜抗病性植株品系的方法。
文檔編號C12N15/84GK102628052SQ20121011923
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月23日
發(fā)明者吳青青, 周玉瓊, 朱蘇文, 江海洋, 程備久 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)