專利名稱：水稻抗病相關(guān)基因OsDR6的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)水稻抗病相關(guān)基因OsDR6的分離克隆和功能驗(yàn)證。OsDR6基因是水稻抗病反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子。抑制OsDR6基因的功能可以顯著增強(qiáng)水稻抵抗病害的能力。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)的過(guò)程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩類(1)抗病基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。
根據(jù)目前人們對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑(Tang等，1996，Physical interaction ofavrPto and the Pto kinase defines a recognition event involved in plant disease resistance，Science 2742060-2063；Baker等，1997，Signaling in Plant-Microbe interactions，Science276726-733；Jia等，2000，Direct interaction of resistance gene and avirulence gene productsconfers rice blast resistance，EMBO J.194004-4014；Dangl和Jones，2001，Plant pathogens andintegrated defence responses to infection，Nature 411826-833；Nimchuk等，2001，Knowing thedancer from the danceR-gene products and their interactions with other proteins from host andpathogen，Curr.Opin.Plant Biol.4288-294)?？共』蚪閷?dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強(qiáng)，是很好的基因資源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少于30個(gè)，抵抗另一水稻重要病害—稻瘟病的抗病基因也只有大約40個(gè)；(2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有限；(3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔?，一個(gè)抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。
抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參于合成植物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參于信號(hào)傳導(dǎo)、阻止信號(hào)傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點(diǎn)是病原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Maleck等，2000，Use microarrays to monitortranscriptional changes during development of SAR，Nature Genet.26403-410；Schenk等，2000，Coordinated plant defense responses in Arabidopsis revealed by microarray analysis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711655-11660；Zhou等，2002，The defense-responsive genes showing enhancedand repressed expression after pathogen infection in rice(Oryzae sativa L.)，Science in China(Series C)45449-467)。目前，人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)已有報(bào)道，絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨(dú)作用時(shí)的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開(kāi)發(fā)的基因資源(1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參于的抗病反應(yīng)沒(méi)有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。但是，水稻中雖然鑒定了很多抗病相關(guān)基因(Zhou等，2002，Science in China(Series C)45449-467；Chu等，2004，Genome-wide analysis of defense responsive genes in bacterial blight resistance of rice mediatedby a recessive R gene，xa13，Mol.Gen.Genomics 271111-120)，這些基因在水稻抗病反應(yīng)中的作用機(jī)理、以及單個(gè)抗病相關(guān)基因是否會(huì)引起水稻抗病表型的改變都不清楚。
水稻是世界上重要的糧食作物，但病害的影響常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。因此，了解病害的發(fā)病機(jī)制，有助于利用高效途徑改良水稻品種的抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來(lái)的損失。
分離克隆抗病相關(guān)基因是對(duì)水稻抗病機(jī)理研究的前提。同時(shí)，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長(zhǎng)效的抗性。通過(guò)抑制作為抗病反應(yīng)負(fù)調(diào)控因子的抗病相關(guān)基因的功能進(jìn)行水稻品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離克隆水稻中攜帶的一個(gè)抗病相關(guān)基因完整DNA片段，并利用RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)通過(guò)使目標(biāo)基因沉默鑒定該基因在抗病反應(yīng)過(guò)程中所起作用，為利用這個(gè)基因改良水稻品種或其它植物抵御病害的能力奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明涉及分離一種包含OsDR6(Oryza sativa defense responsive 6)基因的DNA片段并鑒定其功能，該片段賦予植物對(duì)由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害產(chǎn)生感病反應(yīng)。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ IDNO1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。對(duì)其序列進(jìn)行分析表明它與擬南芥的AtMPK4(mitogen-activated protein kinase 4，細(xì)胞激動(dòng)素激活的蛋白激酶4)基因高度同源。抑制序列表SEQ ID NO1所示序列的表達(dá)可以增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病的抗性。
可以采用已經(jīng)克隆的OsDR6基因作探針，從cDNA和基因組文庫(kù)中篩選到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的OsDR6基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含OsDR6基因的序列或者包含一段OsDR6基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞抑制其自身的OsDR6基因的表達(dá)，產(chǎn)生抗病轉(zhuǎn)基因植物。采用這種轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造抗病植物是傳統(tǒng)育種技術(shù)所不能達(dá)到的。
在本發(fā)明的實(shí)施例部分，我們闡述了OsDR6基因的分離和功能驗(yàn)證過(guò)程以及該基因的特點(diǎn)；將OsDR6基因的一段片段和適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入植物體中抑制其自身OsDR6基因的表達(dá)，是創(chuàng)造抗病植株的一條途徑。
序列表、附圖及其說(shuō)明序列表SEQ ID No1.OsDR6基因的序列和它編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。


圖1.本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗病相關(guān)基因OsDR6以及驗(yàn)證OsDR6基因功能的流程圖。
圖2.用Northern雜交技術(shù)檢測(cè)水稻品種明恢63四葉期植株的離體葉片在抗病信號(hào)分子水楊酸(SA)、苯并噻二唑(BTH)、2，6-二氯異煙酸(INA)和茉莉酸(JA)處理后OsDR6基因的表達(dá)模式。用Northern雜交技術(shù)檢測(cè)水稻品系IRBB4接白葉枯菌株P(guān)XO61后OsDR6基因的表達(dá)模式。用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)明恢63接種稻瘟病菌株V86013后OsDR6基因的表達(dá)模式。ck代表對(duì)照(水處理)樣品，0代表沒(méi)有任何處理的樣品對(duì)照、15、30、60、90、120分別代表處理后15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘的樣品。4h、8h、12h、16h、1d、3d、5d代表接種后4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、1天、3天、5天的樣品。
圖3.OsDR6基因的結(jié)構(gòu)。線條表示內(nèi)含子；柱條表示外顯子，其中黑色部分代表編碼序列，白色部分代表5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)；數(shù)字表示各個(gè)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)。“ATG”和“TAA”分別是翻譯起始密碼和終止密碼。長(zhǎng)箭頭蛋白序列表SEQ ID NO1所示序列的DNA片段。短箭頭代表進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析中所用PCR引物位置。
圖4.(A)OsDR6基因的cDNA克隆EI106L06結(jié)構(gòu)，示載體pSPORT1上的EI106L06插入酶切位點(diǎn)和cDNA內(nèi)部的AccI酶切位點(diǎn)。(B)改造后攜帶表達(dá)OsDR6雙鏈RNA片段(755bp)的pCAMIA1301載體，即克隆D87R。RB和LB代表pCAMIA1301載體(Sun等，2004，Plant J.37517-527)上的T-DNA右和左邊界；GUS代表pCAMIA1301載體上的β-葡萄糖苷酸酶基因(標(biāo)記基因)；Hpt代表潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(篩選基因)。35S代表pMCG161載體構(gòu)件上的花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子；AdhI代表pMCG161載體構(gòu)件上的玉米乙醇脫氫酶基因內(nèi)含子I；OCS代表pMCG161載體構(gòu)件上的章魚堿合成酸基因終止子；Waxy-a代表pMCG161載體構(gòu)件上的水稻W(wǎng)axy基因內(nèi)含子。
圖5.陽(yáng)性T0代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D87RZ1-20、D87RZ1-28、D87RZ1-10)接種白葉枯病菌PXO61三周后形成的病斑明顯比感病水稻品種中花11(對(duì)照)的短。中花11為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料。
圖6.用Northern雜交技術(shù)檢測(cè)OsDR6基因在對(duì)照材料(中花11)和T0代遺傳轉(zhuǎn)化植株(D87RZ1)中的表達(dá)量。D87RZ1-3是陰性轉(zhuǎn)化植株，其它植株是陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，圖1描敘了鑒定和分離克隆OsDR6基因以及驗(yàn)證OsDR6基因功能的流程。根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實(shí)施例一OsDR6基因在水稻品種中的表達(dá)模式分析擬南芥中編碼AtMPK4的基因是抗病反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控基因(Asai等，2002，MAP kinasesignaling cascade in Arabidopsis innate immunity，Nature，415977-983)。為了檢測(cè)AtMPK4基因在水稻中的同源基因是否也是抗病反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，我們用BLASTP分析方法(Altschul等，1997，Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation of protein database search programs，Nucleic Acids Res.253389-3402)、以AtMPK4基因編碼的氨基酸序列檢索水稻品種明恢63的EST (expressed sequence tag)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Zhang等，2005，F(xiàn)eatures of the expressedsequences revealed by a large-scale analysis of ESTs from a normalized cDNA library of the eliteindica rice cultivar Minghui 63.Plant J.42772-780)，發(fā)現(xiàn)推測(cè)的cDNA EI106L06的編碼序列與擬南芥AtMPK4蛋白的同源性為84％(E值＝e-180)，提示cDNA EI106L06所代表的基因可能就是水稻中與擬南芥AtMPK4基因同源的基因，它可能也是抗病反應(yīng)的負(fù)調(diào)控基因。我們將cDNA EI106L06所代表的基因命名為OsDR6(Oryza sativa defense responsive 6)。
采用M13-R和M13-F通用引物、美國(guó)Perkin Elmer公司的測(cè)序試劑盒(Big Dye Kit)、以雙脫氧核苷酸末端終止法(美國(guó)Perkin Elmer公司)分別從cDNA克隆EI106L06兩端測(cè)序。得到一長(zhǎng)1537bp的cDNA序列。
為了進(jìn)一步證實(shí)OsDR6基因參于抗病反應(yīng)的調(diào)控，我們采用Northern雜交技術(shù)(Chu等，2004，Mol.Gen.Genomics 271111-120)和RT-PCR(reverse transcriptase-PCR)技術(shù)(Zhou等，2002，Science in China(Series C)45449-467)分析了OsDR6基因在抗病信號(hào)分子水楊酸(SA)、苯并噻二唑(BTH)、2，6二氯異煙酸(INA)和茉莉酸(JA)以及白葉枯病菌PXO61和稻瘟病菌V86013誘導(dǎo)后的表達(dá)模式?？共⌒盘?hào)分子的處理方法是取四葉期水稻葉片剪成2厘米的長(zhǎng)度后用100μM的抗病信號(hào)分子溶液浸泡處理(Agrawal等，2000，A novel rice(Oryzasativa L.)acidic PR1 gene highly responsive to cut，phytohormones，and protein phosphataseinhibitors，Biochem.Biophys.Res.Commun.274157-165)。白葉枯病菌接種采用剪葉法(Kauffman等，1973，An improved technique for evaluating resistance of rice varieties toXanthomonas oryzae，Plant Dis.Rep.57，537-541)對(duì)成株期的水稻進(jìn)行接種。稻瘟病菌接種采用噴霧法對(duì)四葉期的水稻進(jìn)行接種(Chen等，2001，Pathotypes of Pyricularia grisea in rice fieldsof central and southern China，Plant Dis.85843-850)。RT-PCR技術(shù)中的OsDR6基因特異PCR引物是MPK2F(5’-ATGAATTCTGTACCAGTTGCTACGAGGG-3’)和MPKR(5’-ATAAGCTTCTCTGAGCTCTTAGTAGGGAGG-3’)。
分析結(jié)果顯示抗病信號(hào)分子都誘導(dǎo)增強(qiáng)OsDR6基因的表達(dá)(圖2)；白葉枯病菌和稻瘟病菌接種后短暫抑制OsDR6基因的表達(dá)，但隨后OsDR6基因的表達(dá)增強(qiáng)(圖2)。這些結(jié)果證實(shí)OsDR6基因不僅參于抗白葉枯病反應(yīng)的調(diào)控，也參于抗稻瘟病反應(yīng)的調(diào)控。
實(shí)施例二確定OsDR6基因的基因組序列和基因結(jié)構(gòu)分析1.OsDR6基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)以O(shè)sDR6基因的cDNA序列EI106L06作模板，用BLAST方法檢索核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中來(lái)自水稻品種日本晴的一條位于水稻10號(hào)染色體、長(zhǎng)300029bp序列(核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)注冊(cè)號(hào)AE017115)的一段序列(第55596至59326bp處)與EI106L06的同源性達(dá)到100％(E值＝0)，提示AE017115中包含與OsDR6同源的基因，即OsDR6的等位基因。
利用GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)、GeneFinder(http://genomic.sanger.ac.uk/gf/gf.shtml)、Gene Feature Searches(http://dot.imgen.bem.tmc.edu:9331/)、GeneMark(http://genemark.biology.gatech.edu/GeneMark/hmmchoice.html)等多個(gè)基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)軟件分析預(yù)測(cè)AE017115序列中與cDNA EI106L06同源基因的結(jié)構(gòu)，同時(shí)比較分析EI106L06序列，分析判斷EI106L06是OsDR6基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
2.確定明恢63中的OsDR6基因的基因組序列我們根據(jù)OsDR6基因在水稻品種日本晴中的等位基因(序列AE017115第55596至59326bp處的基因)的序列設(shè)計(jì)了5條PCR引物MPK1F(5’-ATGAATTCCCATGGATTCCTCCTCCGGC-3’)、MPK2F(5’-ATGAATTCTGTACCAGTTGCTACGAGGG-3’)、MPKR(5’-ATAAGCTTCTCTGAGCTCTTAGTAGGGAGG-3’)、MPK3F(TCTTCATCACCCATACTTG)和MPK3R(5’-TGTCCATGCCTCTACATT-3’)，采用分步擴(kuò)增方法，從明恢63中擴(kuò)增OsDR6基因的不同DNA片段(圖3)。將PCR擴(kuò)增片段與pUC19載體(美國(guó)Amersham Bioscience公司)連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(Sun等，2004，Plant J.37517-527)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得3個(gè)陽(yáng)性克隆。采用M13-R和M13-F通用引物、美國(guó)Perkin Elmer公司的測(cè)序試劑盒(BigDye Kit)、以雙脫氧核苷酸末端終止法(美國(guó)Perkin Elmer公司)分別從陽(yáng)性克隆兩端測(cè)序。序列拼接后得到一長(zhǎng)3850 bp的DNA序列，它包括完整的OsDR6基因組序列。
3.OsDR6基因結(jié)構(gòu)分析比較分析OsDR6基因的基因組序列和cDNA序列，確定OsDR6基因由3735個(gè)核苷酸組成，包含7個(gè)外顯子(位于序列表SEQ ID NO1的12-277bp、547-676bp、1701-1838bp、2020-2352bp、2570-2753bp、2827-3007bp和3442-3746 bp處)和6個(gè)內(nèi)含子(位于序列表SEQ ID NO1的278-546bp、677-1700bp、1839-2019bp、2353-2569bp、2754-2826bp和3008-3441bp處)。OsDR6基因的5’端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)由93個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO1的12-104bp處)，3’端UTR由316個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO1的2997-3007bp和3442-3746bp處)。OsDR6基因的編碼區(qū)由1128個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO1的105-277bp、547-676bp、1701-1838bp、2020-2352bp、2570-2753bp和2827-2996bp處)，編碼376個(gè)氨基酸。
實(shí)施例三OsDR6基因編碼產(chǎn)物的分析根據(jù)BLAST分析結(jié)果，OsDR6基因編碼的蛋白質(zhì)與擬南芥AtMPK4基因的編碼產(chǎn)物(National Center for Biotechnology Information(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)號(hào)S40470)同源，氨基酸一致性為84％(E值＝e-180)，與擬南芥AtMPK5的編碼產(chǎn)物(NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)號(hào)S40471)的氨基酸一致性為74％(E值＝e-161)，與玉米鹽誘導(dǎo)的SIMK1(salt-induced MAP kinase 1)蛋白(NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)號(hào)AAR11450.1)氨基酸一致性為93％(E值＝0.0)。因?yàn)樯鲜鰯M南芥和玉米的基因都編碼細(xì)胞激動(dòng)素激活的蛋白激酶，故OsDR6基因的編碼產(chǎn)物極有可能是一種細(xì)胞激動(dòng)素激活的蛋白激酶實(shí)施例四OsDR6基因的功能驗(yàn)證本發(fā)明采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)、通過(guò)抑制水稻品種中花11中OsDR6基因的表達(dá)，驗(yàn)證該基因的功能。這個(gè)技術(shù)途徑的主要機(jī)理將目標(biāo)基因的部分片段以反向重復(fù)的形式與能夠表達(dá)雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)的載體連接，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化將該載體導(dǎo)入植物中。獲得的轉(zhuǎn)化植株大量表達(dá)與目標(biāo)基因部分片段同源的dsRNA。這些dsRNA迅速形成短干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)。這些siRNA與目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄子(mRNA)互補(bǔ)配對(duì)，在細(xì)胞內(nèi)特殊酶的作用下使目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄子降解，從而在mRNA水平上抑制目標(biāo)基因的功能。研究者可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株表型的改變，驗(yàn)證目標(biāo)基因的功能。RNA干擾技術(shù)已被廣泛用于基因功能的驗(yàn)證(Smith等，2000，Total silencing by intron-splicedhairpin RNAs，Nature 407319-320)。
本發(fā)明中cDNA克隆EI106L06是包含OsDR6基因完整編碼區(qū)的全長(zhǎng)cDNA，載體是pSPORT1(儲(chǔ)昭暉等，2002，水稻全生育期均一化cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和鑒定，科學(xué)通報(bào)471656-1662)，cDNA EI106L06被插入在pSPORT1載體的SalI和NotI多克隆位點(diǎn)；分析EI106L06的序列顯示它內(nèi)部具有限制性內(nèi)切酶AccI的消化位點(diǎn)(圖4A)。本發(fā)明首先用限制性內(nèi)切酶AccI和NotI消化cDNA克隆EI106L06，使cDNA EI106L06的3’端被截短782個(gè)核苷酸，然后使截短后的載體自連；截短后的EI106L06克隆只包含OsDR6基因的一部分cDNA片段(755bp，位于序列表SEQ ID NO1的12-277bp、547-676bp、1701-1838bp和2020-2240bp處)。用下列dsF和dsR序列作為PCR引物，以截短后的EI106L06克隆為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到待轉(zhuǎn)化的DNA片段。為了便于PCR產(chǎn)物的克隆，dsF和dsR引物的5’-端標(biāo)有下劃線的部分為限制性酶SpeI和AscI或者SacI和AvrII的消化位點(diǎn)，隨后的3’-端的序列則分別與載體pSPORT1多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的序列匹配。
SpeIAscIdsF5’-TAACTAGTGGCGCCTGCAGGTACCGGTCCG-3’SacIAvrIIdsR5’-TAGAGCTCGCCTAGGTGCACGCGTACGTACGTAAGC-3’將pMCG161載體(McGinnis等，2005，Transgene-induced RNA interference as a tool forplant functional genomics.Methods Enzymol.3921-24)中能夠表達(dá)dsRNA的構(gòu)件酶切下，插入pCAMIA1301載體(見(jiàn)Sun等，2004，Plant J.37517-527；王石平等，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書，專利申請(qǐng)?zhí)?2139212.9)的EcoRI和HindIII多克隆位點(diǎn)處；使改造后的pCAMIA1301載體攜帶能夠表達(dá)dsRNA的構(gòu)件(圖4B)。
構(gòu)建OsDR6基因片段的第一重復(fù)鏈(正向鏈)用AscI和AvrII消化部分PCR產(chǎn)物及改造后的pCAMIA1301載體，消化完全后在75℃水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶，置于冰上，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)(圖4B)。電轉(zhuǎn)后獲得的克隆質(zhì)粒用dsF和dsR引物擴(kuò)增篩選陽(yáng)性克隆。
構(gòu)建OsDR6基因片段的第二重復(fù)鏈(反向鏈)用SacI和SpeI消化剩余的PCR產(chǎn)物和連接了第一重復(fù)鏈的克隆質(zhì)粒，消化完全后在75℃水浴10min滅活限制性內(nèi)切酶，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)(圖4B)。電轉(zhuǎn)后獲得的克隆質(zhì)粒用SacI和SpeI雙酶消化反應(yīng)篩選陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆命名為D87R。
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Lin和Zhang，2005，Optimising the tissue cultureconditions for high efficiency transformation of indica rice，Plant Cell Rep.23540-547)將D87R導(dǎo)入水稻品種中花11。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名為D87RZ1(其中前面部分為遺傳轉(zhuǎn)化載體名稱，Z1代表水稻品種中花11)。本發(fā)明共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株36株。對(duì)全部轉(zhuǎn)化植株在成株期階段接種白葉枯病菌株P(guān)XO61，發(fā)現(xiàn)13株轉(zhuǎn)化植株的抗性顯著增強(qiáng)，與陰性轉(zhuǎn)化植株相比，這些抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化植株的病斑面積(病斑長(zhǎng)/病葉長(zhǎng)×％)減少33-58％(表1)(圖5)。
表1.部分T0代轉(zhuǎn)化植株(D87RZ1)對(duì)白葉枯病菌株P(guān)XO61的反應(yīng)


(1)每株轉(zhuǎn)化基因植株接種3-5片葉，21天后調(diào)查病斑和病葉長(zhǎng)度，每個(gè)數(shù)據(jù)來(lái)自于多個(gè)葉片的平均值。
(2)陰性轉(zhuǎn)化植株，其它植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。
為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化植株的抗病能力減弱是否與OsDR6基因表達(dá)量相關(guān)，本發(fā)明對(duì)13株轉(zhuǎn)化植株抽提總RNA，用Northern雜交檢測(cè)基因表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化植株中OsDR6基因的表達(dá)量變化與植株的表型變化密切相關(guān)(圖6)?？共⌒栽鰪?qiáng)的轉(zhuǎn)化植株中OsDR6基因的表達(dá)量與對(duì)照材料中花11相比顯著減少。而抗病表型無(wú)明顯變化的陰性轉(zhuǎn)化植株D87RZ1-3中OsDR6基因表達(dá)量與中花11相比無(wú)明顯變化。該結(jié)果說(shuō)明了OsDR6基因的編碼產(chǎn)物在水稻抗白葉枯病反應(yīng)發(fā)揮負(fù)調(diào)控因子的作用。抑制水稻中OsDR6基因的表達(dá)，可增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病的抗性。
序列表SEQ ID NO1<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻抗病相關(guān)基因OsDR6<130>
<141>2005-10-21<160>2
<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3850<212>DNA<213>Oryza sativa<220>
<221>gene<222>(12)..(3746)<223>
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<221>Intron
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<221>Intron<222>(3008)..(3441)<223>
<220>
<221>3’UTR<222>(2997)..(3007)<223>
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<221>3’UTR<222>(3442)..(3746)<223>
<220>
<221>5’UTR<222>(12)..(104)<223>
<400>1
cctcctccta ctccgatcaa cgactagtcg cggcgaccaa gagccaaacc ctacgcctcc60tcccctcccc ctccacctcg tcctccccgc gagcggcggc ggcc atg gat tcc tcc 116Met Asp Ser Ser1tcc ggc ggc gcg ggc ggc ggc ggc ggc gcg cag atc aag ggg atg ggg 164Ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Ile Lys Gly Met Gly5 10 15 20acg cac ggg ggc cgc tac gtg ctg tac aac gtg tac ggg aac ttc ttc 212Thr His Gly Gly Arg Tyr Val Leu Tyr Asn Val Tyr Gly Asn Phe Phe25 30 35gag gtc tcc tcc aag tac gcc cct ccc atc cgc ccc atc ggc cgg ggc 260Glu Val Ser Ser Lys Tyr Ala Pro Pro Ile Arg Pro Ile Gly Arg Gly40 45 50gcc tac ggc att gtc tg gtgcgtttgc ctcgccctcc cctcccctcc 307Ala Tyr Gly Ile Val Cys55cgagttatgc gtgtgggttt actaattaat agcgaatccg agttgctatt tttgttcgaa367aattcgcgag ggcgtttatg tgttcgtgac acatcgcgta gatttggctc cggatgttgt427gttttaggca taaggatgtg tgggggaaat gggtcacggc ggcccaaaaa tgttatggtt487tgactgcttg agtagatgtg attatattgt agtagtaatt ttgtttttcc tatttgtag 546c gcg gct gtt aac tcg gag aac ggc gag gaa gtt gcc atc aag aag att595Ala Ala Val Asn Ser Glu Asn Gly Glu Glu Val Ala Ile Lys Lys Ile60 65 70ggc aat gca ttc gac aac cat atc gat gcc aag cgg aca ctg aga gaa 643Gly Asn Ala Phe Asp Asn His Ile Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu75 80 85 90atc aag ctg ctt cgc cac atg gac cac gag aat gtaagagctg tttgtttaaa696Ile Lys Leu Leu Arg His Met Asp His Glu Asn95 100ttggttttcg acattcctag tgattattga tcgaacttgg ccttaccact attaggtaat756ttattgggtg tgatttacat ttagtttaca ttggtaacta acttttccta aggacatttt816tcgagtgcaa acaccatatt ccataatttg ttagaaaagc ggcagcaaca ctttagacct876ttctgtagtt acttacttgc ttgtaaagag tgcattacta attgctatta ttggttatga936tagattaatt gtactccact gaaagatcat cctatccctt atattccact cattgcttca996ctcatactct gctatcaagt tgtgtgacta gttggactag tcgacaagtc atccaagggg1056
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185 190 195 200aca gag tat gtg gtc act cgt tgg tat cga gca cca gag ctg ctg ttg 2226Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu205 210 215aac tgc tcg cag tat act gct gct att gat gtc tgg tca gtt gga tgc 2274Asn Cys Ser Gln Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys220 225 230ata ctt ggt gaa att gtg act cgt caa ccc ctg ttt cct gga agg gat 2322Ile Leu Gly Glu Ile Val Thr Arg Gln Pro Leu Phe Pro Gly Arg Asp235 240 245tac att cag caa cta aaa ttg atc act gag gtaaggcttg tctggttcat 2372Tyr Ile Gln Gln Leu Lys Leu Ile Thr Glu250 255tgcttgcata cttttaatgt ctgcataaac gtaatttttt atttgtactt gaataagaga 2432tacattactt gaactctgaa tatgtaaatg tgtttttttt tgggtccatt tttttttctg 2492ttttctttgc ttttctaaaa tgtatccctg taacccaagt ggtatcaata ttaatcagac 2552ccttttctct tcaaaag ctg ata ggg tcg cca gat gac tca agc cta ggg 2602Leu Ile Gly Ser Pro Asp Asp Ser Ser Leu Gly260 265ttt ctt cgg agt gat aat gca aga aga tac atg aaa cag cta cca cag 2650Phe Leu Arg Ser Asp Asn Ala Arg Arg Tyr Met Lys Gln Leu Pro Gln270 275 280 285tac cca agg cag gac ttc cgc ttg cgc ttc cgc aac atg tct gct ggt 2698Tyr Pro Arg Gln Asp Phe Arg Leu Arg Phe Arg Asn Met Ser Ala Gly290 295 300gca gtc gat ctg tta gag aaa atg ctg gtg ttt gac cca agc aga cgg 2746Ala Val Asp Leu Leu Glu Lys Met Leu Val Phe Asp Pro Ser Arg Arg305 310 315ata act g gtacattgac tttacaccaa ctactccact tttgttgcct ttactgtaaa2803Ile Thrttgaacatta tttttccatg cag tt gat gag gct ctt cat cac cca tac ttg 2855Val Asp Glu Ala Leu His His Pro Tyr Leu325gct tct ctt cat gac atc aat gaa gaa ccc acc tgc cca gca cct ttc 2903Ala Ser Leu His Asp Ile Asn Glu Glu Pro Thr Cys Pro Ala Pro Phe
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1.賦予水稻對(duì)白葉枯病產(chǎn)生抗性的DNA序列，它是SEQ ID NO1中所示的DNA序列，它包括完整的OsDR6基因。
2.OsDR6基因的編碼區(qū)，它是SEQ ID NO1中第105-277位、第547-676位、第1701-1838位、第2020-2352位、第2570-2753位和第2827-2996位所示的DNA序列或者是編碼與SEQ ID NO1編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的DNA序列在增加水稻對(duì)白葉枯病抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及包含水稻抗病相關(guān)基因OsDR6的DNA片段的分離克隆和功能驗(yàn)證。利用基于RNA干擾(RNA interference，RNAi)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將OsDR6基因的部分DNA片段與能夠表達(dá)雙鏈RNA的載體連接并轉(zhuǎn)化感病水稻品種，抑制感病水稻品種中OsDR6基因的表達(dá)。OsDR6基因表達(dá)量顯著降低的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)，證明OsDR6基因是水稻抗白葉枯病反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子，可以通過(guò)抑制它的功能增強(qiáng)水稻的抗病能力。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1952145SQ20051001964
公開(kāi)日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者王石平, 袁斌, 付晶 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)