專利名稱：儲存并檢測加到固相載體上的核酸的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學領域，更具體來說，本發(fā)明涉及診斷學。本發(fā)明特別涉及對樣品中的目標核酸進行檢測和/或定量。
病原體感染在全世界都是常見的。這些感染例如包括病毒、細菌、真菌及寄生蟲感染。對感染的早期診斷對于進行有效的治療通常是優(yōu)選的，而有效的治療可以預防出現(xiàn)嚴重的病理性癥狀。早期診斷有時是治療可能性、延長生存時間和/或改善生活質(zhì)量的首要條件。這些感染的實例包括丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、瘧疾及HIV，例如HIV-1。
HIV-1在全世界迅速地流行性傳播，隨著病毒的傳播，循環(huán)的HIV-1病毒亞型已經(jīng)不再局限于地球上的某個地理位置。這樣的發(fā)展要求應用能同樣準確及精確地測定出HIV病毒的所有亞型的(核酸)診斷性測定。
流行病的全球化以及在資源貧窮國家(南撒哈拉沙漠非洲和東南亞)的特別嚴重性已經(jīng)驅(qū)使發(fā)達國家用藥物使用權(quán)計劃幫助欠發(fā)達國家對抗感染。然而，為了有效地幫助欠發(fā)達世界的HIV-1感染者，在例如監(jiān)測治療的有效性方面必須要有適宜的診斷措施。這些適宜的診斷措施特異地是病毒載量檢測，它可測定體液例如感染者的血液、血漿、母乳、精液、淋巴液、痰液、liquor、唾液和/或尿液內(nèi)的HIV-1 RNA的量。同樣的，適宜的核酸載量檢測對于其它的感染相關(guān)性疾病也是必需的。
適宜的核酸荷載檢測的現(xiàn)狀是技術(shù)標準過高，使得將這些檢測應用于遠離技術(shù)資源的地方例如在南撒哈拉沙漠非洲和/或東南亞是不容易的。這要求在基礎建設方面的大量投資，而這在這些地區(qū)是不可能的。另一個可選擇的解決方法是在發(fā)達地區(qū)(例如歐洲和北美)的實驗室分析患者的樣品。然而因為后勤問題，這種選擇是不可能實現(xiàn)的。必須在低于0℃的溫度下，通常在干冰盒中，將冰凍狀態(tài)的個體的體液樣品例如血液或血漿樣品運送到實驗室。這種運送臨床材料的方法是非常昂貴的并需要在起運的地方可取得干冰。后者在欠發(fā)達世界的國家通常是不能實現(xiàn)的。因為花費及干冰的不可獲得性，因此在實驗室遠距離測定樣品(“服務性測定(service testing)”)對于這些國家以及這些國家的受感染者都不是一種選擇。只有完善了診斷措施，對欠發(fā)達國家的藥物使用權(quán)計劃才能成功。
本發(fā)明提供了一種測定至少一種樣品中的目標核酸的方法，包括-將上述樣品加到能至少部分吸收上述樣品的固相載體上；-干燥上述載體；-至少將上述載體的有代表性的部分提供給一種核酸分離溶液，使得從上述載體中提取出上述核酸的有代表性的量；以及-測定上述核酸的有代表性的量。
用本發(fā)明的方法將例如體液樣品的樣品固定，這樣就可以通過例如普通郵寄的正常后勤手段將樣品從取得樣品的地方(例如欠發(fā)達國家的當?shù)蒯t(yī)院或?qū)嶒炇?起運并運送到世界上其它地方的服務性測定實驗室。上述方法使得通過平信郵寄將干燥的樣品運送到遠距離的實驗室用于測定樣品中的目標核酸成為可能。
利用本領域已知的技術(shù)可以實現(xiàn)本發(fā)明的方法。例如，可以用吸管將設定量的液體樣品加到固相載體上。上述固相載體不是關(guān)鍵，它可以包括任何本領域已知的固相載體，只要它能至少部分吸收上述樣品。例如，上述固相載體可以由二氧化硅組成。不過，上述載體優(yōu)選地由濾紙組成。不僅濾紙的重量輕，它還能較好地吸收液體樣品。這對于郵寄非常重要的。上述濾紙可以包括平常的未經(jīng)處理的濾紙如來自Schleicher及Schuell的903紙，或經(jīng)處理的能固定用于快速純化的核酸的濾紙。本領域的兩種實例是來自Schleicher及Schuell的IsoCode紙或來自Whatman的FTA處理的紙。為了安全的樣品操作以及樣品穩(wěn)定性，這兩種紙都是抗菌的、抗真菌的以及抗病毒的，它抑制細菌及真菌的生長并殺滅與基質(zhì)相接觸的病毒。用于儲存并運送干燥的液體樣品的適宜載體的另一個實例是Lifestock(美國5139742)設計的裝置。該裝置含有一個小刀以及直接連接于小刀的毛細管，它能收集、儲存及運送在毛細管內(nèi)的干燥血液，因此它相當于用濾紙的方法。
可以用本領域已知的不同技術(shù)干燥上述載體。優(yōu)選地空氣干燥上述樣品。這種方法是廉價及有效的。
載體的有代表性的部分意思是能指示加到上述固相載體的樣品的量的部分。例如，上述有代表性的部分可以包括整個上述樣品。上述有代表性的部分也可以包括上述樣品的一半的量。在這種情況下，另一半樣品可以用于進行第二個試驗。上述第二個試驗可以是不同的試驗，或可以是相似的試驗。在后一種情況下，某個結(jié)果可以由重復試驗得到，該結(jié)果更為準確。
核酸的有代表性的量意思是能指示上述樣品中所含有的核酸量的量。上述有代表性的量可以包括上述樣品中所含有的上述核酸的全部的量。同樣的，上述有代表性的量可以包括上述樣品中所含有的上述核酸的一部分。
本發(fā)明優(yōu)選地提供了本發(fā)明的一種方法，其中將至少100μl樣品加到上述載體。更優(yōu)選的，將至少250μl樣品加到上述載體。最優(yōu)選的，將至少500μl樣品加到上述載體。由于樣品的大體積，所以仍可測定出低滴度的目標核酸?，F(xiàn)有檢測方法的一個主要缺點是只能檢測出濃度高于特定閾值的核酸。這就意味著帶有低載量病原體核酸的感染個體沒有被診斷為被感染，因此不能在適當?shù)脑缙跁r間點得到治療。在本發(fā)明之前，因為觀察到抑制作用，大量的體液樣品例如血液或血漿樣品不適合用于測定。例如，已經(jīng)報導全血中存在的血紅蛋白及碳酸酐酶干擾了聚合酶鏈反應(4)。因為血紅素及其降解產(chǎn)物可自濾紙洗脫，因此PCR混合物變?yōu)樯詈稚?5)。為了提高PCR擴增，在PCR反應前用甲醇處理樣品(6)。這包含了一個額外的步驟，就會帶來污染的危險并降低測定結(jié)果的可靠性。另外，報導具有螯合性的金屬離子在高溫和低離子強度下可成為降解DNA的催化劑(7)。
令人驚奇的是，用本發(fā)明的方法可以將大量的樣品儲存于干燥的固相載體并用于隨后的分析。沒有觀察到上述的抑制作用并且不需要將甲醇處理作為預處理?，F(xiàn)在用本發(fā)明的方法分析大的樣品中所存在的目標核酸是可能的。因此，現(xiàn)在可以測定出樣品中的低濃度的目標核酸。本發(fā)明的方法適合于篩選個體的一種或多種特異病原體的存在，例如HIV-1。同樣的，可以用本發(fā)明的方法研究患病或高危患病的個體。一旦發(fā)現(xiàn)了一種或多種外源性核酸，就可以確定出它屬于哪種類型的微生物。例如利用不同類型的探針可以通過雜交方法實現(xiàn)這一點。同樣的，可以利用測定核酸序列的技術(shù)或分析該序列與任何已知序列的同源性。因此在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括鑒定上述目標核酸。
而在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括定量分析上述核酸。令人驚奇的是，用本發(fā)明的方法不僅檢測目標核酸是可能的，測定上述樣品中的上述核酸的量也是可能的。利用本發(fā)明的方法，在儲存和/或分離和/或檢測過程中都沒有出現(xiàn)顯著量的核酸的丟失/降解。在實施例中顯示，如果使用本發(fā)明的方法，從儲存于固相載體的干燥樣品中測到的目標核酸的量與當上述樣品直接用于分析時所測到的上述目標核酸的量相當。
現(xiàn)在可以研究固相載體上的干燥樣品中所含的病原體的核酸的量。因此，現(xiàn)在不僅可以確定出疾病的存在，也可以確定出疾病的分期?，F(xiàn)在對設施不全地區(qū)的個體進行診斷是可能的，例如對資源貧窮國家居民進行診斷。例如血液樣品的體液樣品可以被收集于例如濾紙的固相載體上。上述濾紙可以被運送到例如在西歐的實驗室。隨后，可以測定目標核酸的量并據(jù)此確定疾病的狀態(tài)。通過測定上述核酸的量是否隨著時間而減少也可以確定治療是否有效。
在一個方面，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明的方法，其中上述固相載體含有至少兩個樣品。優(yōu)選的，上述樣品取自同一個體。更優(yōu)選的，上述樣品取自上述個體的同種體液。例如上述樣品可以包含兩份血液。用本發(fā)明的方法可以獨立地測定每一個上述血液樣品。這樣可以重復測定上述個體的血液中的目標核酸的存在和/或目標核酸的量。這可以得到更準確的結(jié)果。此外，每個樣品可以被不同的個人/不同的研究所所檢測。獨立的第二次檢測可以發(fā)現(xiàn)個人所犯的錯誤和/或因為設備不可靠而造成的錯誤。
在另一個可選擇的實施方案中，上述兩個樣品被用于不同的目的。例如，用一種樣品測定病毒核酸的量，而用另一個樣品測定細菌核酸的量。可以用兩個樣品獲得病毒核酸與染色體DNA之間的比例(這對于CMV是重要的)、或者線粒體與細胞的DNA/RNA之間的比例或測定所含的mRNA或核糖體RNA的比例。然而，僅用一種樣品也可以進行大多數(shù)這樣的檢測。
在一個實施方案中，上述固相載體包括一系列至少兩種取自不同時間點的樣品。這樣可以隨訪疾病隨著時間的發(fā)展病程。這個實施方案也特別適合于確定治療是否有效。例如，在治療起始以及隨后的規(guī)律間隔內(nèi)，將樣品加到上述固相載體上。這樣上述固相載體不僅用做于轉(zhuǎn)運的目的，也用于在環(huán)境溫度下穩(wěn)定地儲存且不降解目標核酸。在一定長的時間后，可以將這些固相載體運送到合適的研究所。用本發(fā)明的方法通過定量每個樣品中的病理性核酸的量可以確定治療是否有效。可以確定上述核酸的量是否隨著時間而減少。
同樣的，可以定期地從患病個體中取得樣品。隨后可以定量每個樣品中的病原體的核酸的量。這樣可以進一步地了解上述疾病的病程，例如病原體的核酸的量是否隨著時間而增加等等。
分別地將每個樣品運送到上述研究所是不必要的?？梢栽谝欢螘r間內(nèi)收集大量樣品而只運送一次。這樣可以節(jié)省時間和花費。此外，因為上述樣品被一起運送，所以對運送樣品的分別的儲存及分類是不必要的。減少了樣品丟失的危險。
為了更正確地用本發(fā)明的方法定量目標核酸的量，可以將已知量的參照核酸加到上述固相載體上?？梢远可鲜鰠⒄蘸怂嵋约澳繕撕怂帷Ｍㄟ^比較上述參照核酸的測定量與上述參照核酸的加入量，可以測定出目標核酸定量的準確性。如果上述測定量與加入量有輕微差異，那么對于上述目標核酸也可能存在著同樣的差異。因此，可以校正所測定的上述目標核酸的量以得到更準確的結(jié)果。
此外，用參照核酸可以測定出含有一部分樣品的有代表性的部分。如果將含有一部分所述樣品的有代表性的部分提供給上述核酸分離緩沖液，并且參照核酸的測定量顯示是加入量的1/3，那么這表明目標核酸的測定量也近似是上述樣品中含有的核酸的量的1/3。因此，參照核酸表明如果將所述樣品的一部分放置于上述核酸分離緩沖液中，用參照核酸可以放大本發(fā)明的核酸的測定量的系數(shù)。參照核酸優(yōu)選地以與上述目標核酸基本一樣的方式沿著上述固相載體擴散。在這種情況下，在本發(fā)明的方法中使用上述固相載體的哪一部分都沒有顯著差異。準確地定量目標核酸的另一種方法是通過其與其它核酸的量的相關(guān)性。通過這個方法，或在同一反應或在不同的反應、或在同一種樣品或在任何一種其它的樣品中建立任何DNA與DNA、任何RNA與DNA或反之亦然、以及任何RNA與RNA等靶分子之間的比例是有可能的。本發(fā)明可以包括測定宿主核酸之間的比例的應用，例如線粒體DNA與核DNA的量的比例作為對特定的HIV的治療反應的測定，或包括測定病原體核酸與宿主核酸的比例的應用，例如CMV DNA對宿主的核DNA的量的比例。其它應用可以包括在基因表達譜分析領域內(nèi)每個細胞的mRNA的量。
本發(fā)明也提供了本發(fā)明的一個方法，其中上述有代表性的部分基本上包括上述至少一種樣品的整個部分。本發(fā)明者表明用本發(fā)明的方法甚至對大樣品進行對目標核酸的可靠的檢測和/或定量是有可能的。如果使用整個大樣品，可以檢測并定量甚至低濃度的核酸。
通過切割例如濾紙的固相載體上的可見斑可以提供上述載體的有代表性的部分。這種切割可以用剪刀完成，也可以完全自動化完成，例如用來自Wallack的裝置可以鉆出相同的固相載體的表面。使這類手工鉆孔便利化的另一種方法是將上述固相載體預先鉆孔，之后加入樣品并干燥。在到達實驗室用于分析時，通過特殊設計的裝置或現(xiàn)有裝置例如來自Eppendorf的Safe-lock管完整地鉆出該預鉆孔的部分是便利的，也可以使用所述斑點的有代表性的部分。然而，優(yōu)選地使用整個載體，因為它可以保證測定整個樣品。根據(jù)本發(fā)明，例如濾紙的固相載體沒有顯著地影響目標核酸的檢測和/或定量。因此，優(yōu)選的本發(fā)明的方法是上述有代表性的部分基本上包括整個上述固相載體。
如果在本發(fā)明的一個方法中，上述固相載體含有至少兩個樣品，上述有代表性的部分優(yōu)選地包含其中一種上述樣品。上述有代表性的部分可以被用于檢測及/或定量目標核酸。如上面所解釋的，含有上述第二個樣品的有代表性的部分可以被用于重復測定。同樣的，可以進行另一種測定。
在一個方面提供了本發(fā)明的方法，其中上述核酸分離溶液包含離液(chaotropic)核酸分離裂解緩沖液。更優(yōu)選地使用Boom等描述的核酸分離緩沖液。上述固相載體優(yōu)選由濾紙構(gòu)成，因為濾紙是廉價的，能較好地吸收液體樣品并且是輕便的有助于運輸。通常，在室溫下洗脫上述核酸需要至少30分鐘，或在更高的溫度下甚至更短的時間，而直接應用于裂解緩沖液的體液中的核酸通常在10分鐘內(nèi)被釋放出來。提高溫度將有助于從固相載體中有效并快速地洗脫核酸。
本發(fā)明的一種方法特別適合于檢測病毒核酸，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸。病毒核酸可以出現(xiàn)于潛伏期，該潛伏期可以持續(xù)相當長的時間。此外，例如HIV、HTLV和HHV病毒通常在個體出現(xiàn)任何明顯的癥狀之前已經(jīng)在上述個體內(nèi)存在有相當長的時間。在此期間，病毒經(jīng)常已經(jīng)被傳播給其它人。此外，早期的治療可以提高治愈的機會、延長生存時間和/或改善生活質(zhì)量。因此用本發(fā)明的方法檢測個體內(nèi)病毒核酸的存在是特別重要的。被檢測的病毒核酸包括來自肝炎病毒A、B、C、細小病毒等等的序列。優(yōu)選地，上述病毒核酸包括HIV和/或HTLV。更優(yōu)選的，上述病毒核酸包括HIV-1。
在一個實施方案中提供了一種本發(fā)明的方法，其中上述方法包括對突變體進行基因型分析(genotyping)。這對于具有快速變化型的基因組的生物體是特別有用的，例如(逆轉(zhuǎn)錄)病毒。例如基因型分析可用于確定某種治療對于個體患者是否可能是適合的。此外，如果發(fā)現(xiàn)新的突變體，可以采用現(xiàn)有的藥物制劑，或可以發(fā)展新藥物。
本發(fā)明的方法特別適合于檢測體液中的目標核酸，例如血液、血漿、母乳、精液、淋巴液、血清、痰、liquor、唾液和/或尿液。這些體液樣品容易得到。取得這些樣品不會造成患者的許多不便，而如果例如進行活檢將造成患者的許多不便。此外，取得體液樣品不需要特殊的裝置，而在欠發(fā)達國家以及邊遠地區(qū)往往缺乏這些裝置。優(yōu)選的本發(fā)明的方法是上述樣品包括一滴從手指或足跟穿刺取得的全血。新生兒常進行這樣的手指或足跟穿刺，因此取得上述材料不需要進一步地困擾個體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，上述樣品是血漿樣品。血漿樣品可以更準確地測定游離病毒顆粒的量，而例如血液樣品也包括整合于細胞內(nèi)的病毒核酸。對游離病毒顆粒，基本上不含整合于細胞內(nèi)的病毒核酸的測定，是例如病毒毒性、病毒傳播能力等等特性的特殊指示。因此，如果要測定這些特性，血漿樣品是特別優(yōu)選的。為了保證至少收集到最少必需量的體液，可以將預先設定的表面印記于或以任何其它的方法應用于固相載體上。其目的是表面將完全被所需的體液所填充。既然等體積的全血將比相同量的體液例如血清或母乳形成更小的覆蓋面積，因此在相同的固相載體上印記有一些針對于不同體液的表面，或者具有為特定的體液特殊設計的載體可能是必要的。這樣就保證收集到最少準確量的體液。
對于目標核酸的檢測，擴增步驟(例如PCR或NASBA)常常是必要的。之后可以用本領域已知的方法檢測擴增的核酸。因此本發(fā)明的方法優(yōu)選地包括擴增步驟。上述擴增優(yōu)選地包括實時監(jiān)視擴增。它使得所生成的核酸在擴增反應期間是直接可視的。例如可以用分子信號探針或其它類型的探針實現(xiàn)這一點。一旦這些探針退火于模板，就可以生成在擴增反應期間能被監(jiān)視的熒光信號。熒光的強度是所生成的核酸的量的指示。用已知量的核酸可以生成校準曲線。然后可以將具有未知量核酸的樣品的熒光信號與上述校準曲線進行比較。這樣就可以測定出在上述樣品中的上述核酸的量，因為熒光的強度與核酸的量是相關(guān)的。
在另一個實施方案中，利用終點閱讀系統(tǒng)(end-point read-out system)進行上述核酸的檢測和/或定量。這些系統(tǒng)例如包括比色檢測、酶檢測和/或量尺檢測。
本發(fā)明也提供了一種含有樣品的干燥的固相載體在檢測、鑒定和/或定量上述樣品中的目標核酸中的用途。如上所述，可以便利地儲存并運送上述干燥的固相載體，之后可以進行可靠的核酸檢測及定量。上述固相載體優(yōu)選地至少含有干燥形式的相當于100μl的血液或其衍生物。上述載體更優(yōu)選地至少含有干燥形式的相當于250μl的，最優(yōu)選地至少含有干燥形式的相當于500μl的血液，或其衍生物。通過本發(fā)明的這種用途，可以研究大體積樣品，可以測定和/或定量低濃度的核酸。血液的衍生物意思是血液的一種成分的至少一部分，例如血清和/或血漿。已經(jīng)被人工處理的血液也在血液的衍生物的范疇內(nèi)。固相載體被這樣設計，它可以較好地包括能吸收體液的載體本身，連接有一部分紙或表面，在這些紙或表面上可以書寫或印記信息，例如患者的信息、取樣日期或多個取樣日期、治療方案、條形碼、身份證號等。這些特異地用于這類信息的表面被準確地連接于帶有樣品的載體上，因此保證不會丟失信息。這類表面通?？梢院斜仍嚬芩母嗟男畔?。理論上，對這種方案的任何修改都是可能的。
本發(fā)明也包括用于測定、鑒定和/或定量樣品中的目標核酸的試劑盒，包括-能至少部分吸收上述樣品的固相載體；以及-核酸分離溶液。
上述試劑盒優(yōu)選地包括用于核酸擴增的元件。上述元件例如包括用于實時監(jiān)視擴增的元件，以及用于終點檢測/定量擴增的元件。本發(fā)明的試劑盒例如對于只有少數(shù)醫(yī)院的資源貧窮國家是有用的。這些醫(yī)院可以在邊遠地區(qū)的居民中發(fā)放上述固相載體，例如濾紙。一旦收集到樣品，它們可以被儲存并被運送回這些醫(yī)院。如果上述醫(yī)院被適當?shù)匮b備，用上述核酸分離溶液可以研究上述樣品。當然，發(fā)達國家的醫(yī)院也可以用本發(fā)明的試劑盒收集并測定樣品。用于檢測、鑒定和/或定量的試劑盒可以包括有從患者中安全地提取到體液所必需的收集材料。理論上，對于如尿液、母乳或唾液的外在體液，必須采取不同于樣品為如血液、血清或淋巴液的內(nèi)在體液時的其它的安全預防措施。對于內(nèi)在的體液，試劑盒可以包括能至少部分吸收上述樣品的固相載體、以及核酸分離溶液、一副檢查手套、一個清洗皮膚的酒精棉球、手指或足跟穿刺裝置、繃帶、信封例如寫有目的地實驗室的地址以及留有寫識別號碼或患者編號的空間，并被內(nèi)側(cè)封閉用于安全的郵寄運輸、以及保持樣品干燥并預防真菌或細菌生長的干燥器。其它可能的收集裝置可以包括特別設計的一次性使用的裝置，如美國專利5139742中所描述的裝置荷蘭Amersfoort的Livestock Control Holding B.V.的一次性液體測定裝置。這些內(nèi)容物的任何組合，或用其它類型的用于儲存和/或運送任何含核酸的體液的內(nèi)容物/裝置代替都是可能的。
同時也提供了至少含有干燥形式的相當于500μl的血液或其衍生物的固相載體。優(yōu)選地，上述固相載體含有至少兩個樣品。如果上述樣品是同種類型，那么上述樣品都可以被分開測定，造成一個重復測定。此外，通過獨立地測定另一個樣品可以控制第一個測定的結(jié)果。同樣的，可將上述樣品用于不同的目的。
同時也提供了含有在不同的日期取得的一系列樣品的本發(fā)明的固相載體。如前上述，這些固相載體適合于隨訪疾病隨時間變化的病程，和/或測定特定的治療是否有效。本發(fā)明的固相載體優(yōu)選地含有已知量的參照核酸。
在下面的實施例中進一步地解釋了發(fā)明。實施例只用于闡明本發(fā)明。它始終都不限制本發(fā)明的范圍。替代性的實施方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例實施例1將血液及血漿以50μl的小滴點到S&S 903紙(Schleicher & Schull)上并在空氣中干燥。同時將200μl相同的血液及血漿樣品直接加到如Boom等(1990)所描述的裂解緩沖液中。干燥后，將濾紙上的斑點在室溫下保存直到3周，大概可以在室溫下保存斑點數(shù)月。用剪刀剪下濾紙上的斑點并加到含有如Boom等(1990)所描述的裂解緩沖液的試管中。將50μl血液或血漿的濾紙斑加到三個不同的試管中1)含有9ml裂解緩沖液的50ml試管中；2)含有15ml裂解緩沖液的15ml試管中或3)含有1ml裂解緩沖液的1.5ml的Eppendorf管中。
室溫下將試管在搖晃板上輕輕搖晃3個小時。在此孵育期間，血液或血漿斑從濾紙中溶解到裂解緩沖液內(nèi)。隨后用干凈鑷子將濾紙從試管中取出。在不同的試管之間，用熱水-氯-熱水-70％乙醇依次清洗鑷子。
將1.106拷貝的系統(tǒng)對照RNA分子加到含有裂解緩沖液及樣品的試管中，使得可以識別出更晚階段的假陰性反應。用與野生型HIV-1一樣的引物擴增系統(tǒng)對照RNA，并用反應中的可識別探針檢測。因為長度的差異，在缺少(或存在非常少量)野生型HIV-1 RNA時，只能擴增及檢測系統(tǒng)對照RNA。
用Boom等(1990)所描述的方法或用購自Qiagen(Qiagen GmbH，Max Volmer Strasse 4，40724 Hilden，Germany)或Biomerieux(以前的Organon Teknika，Boseind 15，5281 RM Boxtel，The Netherlands)的專用分離試劑盒進一步純化現(xiàn)在存在于裂解緩沖液中的核酸，按廠商的說明書使用試劑盒。將分離到的核酸儲存于-80℃直到進一步分析。通常將5μl核酸用作De Baar等描述的測定HIV-1 RNA的量的NASBA擴增反應(1，2)的輸入量。
標準的NASBA核酸擴增反應是在20μl反應體積中進行并包括40mM Tris-pH 8.5、70mM KCl、12mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mMdNTP′s(每種)、2mM rNTP′s(每種)、0.2μM引物(每種)、(P1AAT TCTAAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA和P2CTC AAT AAA GCT TGC CTT GA)、0.05μM野生型HIV-1序列的分子信號(MB045FAM-CGA CGT AGT AGTGTG TGC CCG TCT GTACGTCG-dabcyl)、0.05μM系統(tǒng)對照RNA的分子信號(MB054ROX-CCGACT CTC TAC ACA CCAGAC AAA AAA CGA GTCGG-dabcyl)、0.05μM野生型HIV-1序列的分子信號、0.05μM系統(tǒng)對照RNA的分子信號、375mM山梨醇、0.105μg/μl牛血清白蛋白、6.4單位AMV RT、32單位T7 RNA聚合酶、0.08單位RNase H以及輸入的核酸。在加入酶之前，將整個混合物(除了酶)加熱到65℃以變性RNA的任何二級結(jié)構(gòu)并容許引物退火。將混合物冷卻到41℃后，加入酶。擴增在恒溫熒光計(CytoFluor2000或EasyQ Reader)中41℃進行60分鐘，每分鐘測定分子信號探針的熒光信號。
為了達到定量化，擴增了針對特異性引物的靶序列的稀釋系列，并繪制出反應達到陽性時的時間點(達到陽性的時間，TTP)對核酸輸入量的曲線。這樣就生成了校準曲線，可以用它讀出用未知輸入量的反應的TTP值并推算出輸入量。
下面的表1中顯示了實施例1中的測定結(jié)果。系統(tǒng)對照RNA的結(jié)果說明不存在假陰性結(jié)果，且表1中所報導的所有陰性結(jié)果都是不存在HIV-1序列或其存在的濃度低于該測定的檢測范圍所產(chǎn)生的真陰性數(shù)據(jù)。
A.如上文中所述用TTP檢測定量測定出這些結(jié)果。給出的結(jié)果為對數(shù)值。Neg.代表陰性結(jié)果，LQL代表陽性結(jié)果但太低而不能準確定量。
B.沒有對200μl直接加到裂解緩沖液的血液、50μl血漿斑以及50μl血液斑進行定量測定，只用陽性(Pos.)或陰性(Neg.)結(jié)果定性。
表1中的數(shù)據(jù)清楚地說明用將樣品直接加到裂解緩沖液中得到的結(jié)果與先將樣品點到紙上、干燥然后加到裂解緩沖液中得到的結(jié)果之間有著很好的相關(guān)性。
實施例2將來自1個婦女的加入了4種濃度的6個不同分離株的病毒的母乳按50μl小滴分4次點到S&S 903紙(Schleicher & Schull)上，在空氣中干燥并在室溫下儲存最少1周。干燥后，將濾紙上的斑點在室溫下保持直到3周，大概可以在室溫下保存斑點數(shù)月。同時將200μl相同的母乳樣品直接加到如Boom等(1990)所描述的裂解緩沖液中。用剪刀剪下濾紙上的斑點并加到含有4ml如Boom等(1990)所描述的裂解緩沖液的試管中。
室溫下將試管在搖晃板上輕輕搖晃3個小時。在此孵育期間，血液或血漿斑從濾紙中溶解到裂解緩沖液內(nèi)。隨后用干凈鑷子將濾紙從試管中取出。在不同的試管之間，用熱水-氯-熱水-70％乙醇依次清洗鑷子。
將1,000,000拷貝的系統(tǒng)對照RNA分子加到含有裂解緩沖液及樣品的試管中，使得可以識別出更晚階段的假陰性反應。用與野生型HIV-1一樣的引物擴增系統(tǒng)對照RNA，并用反應中的可識別探針來檢測。因為長度的差異，在不存在(或存在非常少量的)野生型HIV-1 RNA時，只能擴增及檢測系統(tǒng)對照RNA。用Boom等(1990)所描述的方法或用購自Qiagen(Qiagen GmbH，Max Volmer Strasse 4，40724 Hilden，Germany)或Biomerieux(以前的Organon Teknika，Boseind 15，5281 RM Boxtel，TheNetherlands)的專用分離試劑盒進一步純化現(xiàn)在存在于裂解緩沖液中的核酸，按廠商的說明書使用試劑盒。將分離到的核酸儲存于-80℃直到進一步分析。通常將5μl核酸用作De Baar等描述的測定HIV-1 RNA的量的NASBA擴增反應的輸入量。
標準的NASBA核酸擴增反應是在20μl反應體積中進行并包括40mM Tris-pH 8.5、70mM KCl、12mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mMdNTP(每種)、2mM rNTP(每種)、0.2μM引物(每種)、(P1AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG GAG AGG GGC GCC ACT GCT AGA GA和P2CTC AATAAA GCT TGC CTT GA)、0.05μM野生型HIV-1序列的分子信號(MB045FAM-CGA CGT AGT AGTGTG TGC CCG TCT GTACGTCG-dabcyl)、0.05μM系統(tǒng)對照RNA的分子信號(MB054ROX-CCGACT CTC TAC ACA CCAGAC AAA AAA CGA GTCGG-dabcyl)、375mM山梨醇、0.105μg/μl牛血清白蛋白、6.4單位AMV RT、32單位T7 RNA聚合酶、0.08單位RNase H以及輸入的核酸。在加入酶之前，將整個混合物(除了酶)加熱到65℃以變性RNA的任何二級結(jié)構(gòu)并容許引物退火。將混合物冷卻到41℃后，加入酶。擴增在恒溫熒光計(CytoFluor 2000或EasyQ Reader)中41℃進行60分鐘，每分鐘測定分子信號分子的熒光信號探針。
為了達到定量化，擴增了一系列針對特異性引物的靶序列的稀釋物，并繪制出反應成為陽性時的時間點(達到陽性的時間，TTP)對核酸輸入量的曲線。這樣就生成了校準曲線，可以用它讀出用未知輸入量的反應的TTP值并推算出輸入量。
比較了對點斑的及直接加到裂解緩沖液的相同樣品的測定結(jié)果并在下面的圖1中顯示了分析。系統(tǒng)對照RNA的結(jié)果說明不存在假陰性結(jié)果以及圖1中所報導的所有陰性結(jié)果都是缺乏HIV-1序列或其存在的濃度低于測定的檢測范圍所產(chǎn)生的真陰性數(shù)據(jù)。
實施例3將88個HIV-1感染個體的血漿以200μl小滴點到S&S 903紙(Schleicher & Schull)上，并在空氣中干燥并在室溫下儲存最少24小時。同時將200μl相同的血漿樣品直接加到如Boom等(1990)所描述的裂解緩沖液中。鉆孔出濾紙上的斑點并加到含有4ml如Boom等(1990)所描述的裂解緩沖液的試管中。室溫下將試管在搖晃板上輕輕搖晃3個小時。在此孵育期間，血液或血漿斑從濾紙中溶解到裂解緩沖液內(nèi)。隨后用干凈鑷子將濾紙從試管中取出。在不同的試管之間，用熱水-氯-熱水-70％乙醇依次清洗鑷子。
用Boom等(1990)所描述的方法或用購自Qiagen(Qiagen GmbH，Max Volmer Strasse 4，40724 Hilden，Germany)或Biomerieux(以前的Organon Teknika，Boseind 15，5281 RM Boxtel，The Netherlands)的專用分離試劑盒進一步純化現(xiàn)在存在于裂解緩沖液中的核酸，按廠商的說明書使用試劑盒。將分離到的核酸儲存于-80℃直到進一步分析。通常將5μl核酸用作De Baar等描述的測定HIV-1 RNA的量的NASBA擴增反應[2，3]的輸入量。
標準的NASBA核酸擴增反應是在20μl反應體積中進行并包括40mM Tris-pH 8.5、70mM KCl、12mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mMdNTP(每種)、2mM rNTP(每種)、0.2μM引物(每種)、0.05μM野生型HIV-1序列的分子信號、0.05μM系統(tǒng)對照RNA的分子信號、375mM山梨醇、0.105μg/μl牛血清白蛋白、6.4單位AMV RT、32單位T7 RNA聚合酶、0.08單位RNase H以及輸入的核酸。在加入酶之前，將整個混合物(除了酶)加熱到65℃以變性RNA的任何二級結(jié)構(gòu)并容許引物退火。將混合物冷卻到41℃后，加入酶。擴增在恒溫熒光計(CytoFluor 2000或EasyQReader)中41℃進行90分鐘，每分鐘測定分子信號分子的熒光信號。
為了達到定量化，擴增了一系列針對特異性引物的靶序列的稀釋物，并繪制出反應成為陽性時的時間點(達到陽性的時間，TTP)對核酸輸入量的曲線。這樣就生成了校準曲線，可以用它讀出用未知輸入量的反應的TTP值并推算出輸入量。
比較了對點斑的及直接加到裂解緩沖液的相同樣品的測定結(jié)果并在下面的圖2中顯示了分析。
圖2中的數(shù)據(jù)清楚地說明用將樣品直接加到裂解緩沖液中得到的結(jié)果與先將樣品點到紙上、干燥然后加到裂解緩沖液中得到的結(jié)果之間有著很好的相關(guān)性。當用Pearson相關(guān)性檢測分析時，發(fā)現(xiàn)直接血漿的相關(guān)系數(shù)(r)為0.919以及干燥血漿為0.959。


圖1.從直接分析的或先點斑及干燥于濾紙的母乳中得到的定量的HIV-1數(shù)據(jù)的比較。檢測的底限(cut of)為log2，在圖中用實線表示。軸上的數(shù)字代表在檢測中所發(fā)現(xiàn)的HIV-1 RNA的對數(shù)拷貝數(shù)。
圖1中的數(shù)據(jù)清楚地說明用將樣品直接加到裂解緩沖液中得到的結(jié)果與先將樣品點到紙上、干燥然后加到裂解緩沖液中得到的結(jié)果之間有著很好的相關(guān)性。
圖2.從直接分析的或先點斑及干燥于濾紙的血漿中得到的定量的HIV-1數(shù)據(jù)的比較。測定的檢測下限為log2，在圖中用實線表示。軸上的數(shù)字代表在檢測中所發(fā)現(xiàn)的HIV-1 RNA的對數(shù)拷貝數(shù)。
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權(quán)利要求
1.一種用于檢測至少一個樣品中的目標核酸的方法，包含-將所述樣品加到能至少部分吸收所述樣品的固相載體上；-干燥所述載體；-至少將所述載體的有代表性的部分提供給一種核酸分離溶液，使得能從所述載體中提取出有代表性的量的所述核酸；以及-測定所述有代表性的量的所述核酸。
2.一種用于檢測并定量至少一個樣品中的目標核酸的方法，包含-將所述樣品加到能至少部分吸收所述樣品的固相載體上；-干燥所述載體；-至少將所述載體的有代表性的部分提供給一種核酸分離溶液，使得能從所述載體中提取出有代表性的量的所述核酸；以及-測定所述有代表性的量的所述核酸。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中將至少100μl樣品加到所述固相載體上。
4.權(quán)利要求3的方法，其中將至少250μl樣品加到所述固相載體上。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，包含鑒定所述核酸。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中將至少兩個樣品提供給所述固相載體。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，包含將已知量的參照核酸加到所述固相載體上。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述有代表性的部分基本上包含全部所述至少一個樣品。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述有代表性的部分基本上包含全部所述固相載體。
10.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述有代表性的部分包含所述樣品中的一個樣品。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述核酸分離溶液包含離液核酸分離裂解緩沖液。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述核酸包含RNA。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述RNA包含線粒體RNA、病毒RNA和/或信使RNA。
14.權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中檢測的是病毒核酸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述病毒核酸包含逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸。
16.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述病毒核酸包含HIV和/或HTLV。
17.權(quán)利要求13-16中任一項的方法，其中所述病毒核酸包含HIV-1。
18.權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中所述載體包含濾紙。
19.權(quán)利要求1-18中任一項的方法，包含對突變體進行基因型分析。
20.權(quán)利要求1-19中任一項的方法，其中所述樣品包含一種稀少的體液。
21.權(quán)利要求1-20中任一項的方法，其中所述樣品包含血液、血漿、母乳、痰液、liquor、唾液和/或尿液。
22.權(quán)利要求1-21中任一項的方法，其中所述樣品包含取自手指或足跟穿刺的一小滴全血。
23.權(quán)利要求1-21中任一項的方法，其中所述樣品是血漿樣品。
24.權(quán)利要求1-23中任一項的方法，其中所述核酸檢測和/或定量包含擴增步驟。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述擴增步驟包含實時監(jiān)視的擴增。
26.權(quán)利要求1-25中任一項的方法，其中用終點閱讀系統(tǒng)進行所述核酸的檢測和/或定量。
27.權(quán)利要求1-26中任一項的方法，其中確定不同核酸之間的比例。
28.一種含有樣品的干燥的固相載體在檢測、鑒定和/或定量所述樣品中的目標核酸中的用途。
29.權(quán)利要求28的用途，其中所述固相載體至少包含干燥形式的相當于100μl的血液或其衍生物。
30. 一種用于檢測、鑒定和/或定量樣品中的目標核酸的試劑盒，包含-能至少部分吸收所述樣品的固相載體；以及-核酸分離溶液。
31.權(quán)利要求30的試劑盒，進一步包含用于核酸擴增的元件。
32.一種固相載體，其至少包含干燥形式的相當于500μl的血液或其衍生物。
33.權(quán)利要求32的固相載體，包含至少兩個樣品。
34.權(quán)利要求32或33的固相載體，包含在不同日期取得的一系列樣品。
35.權(quán)利要求32-34中任一項的固相載體，包含已知量的參照核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測至少一個樣品中的目標核酸的方法，包含將所述樣品加到能至少部分吸收所述樣品的固相載體上；干燥所述載體；至少將所述載體的有代表性的部分提供給一種核酸分離溶液，使得能從所述載體中提取出所述核酸的有代表性的量；以及測定所述核酸的有代表性的量。采用本發(fā)明的方法，可將例如體液樣品的樣品固定，由此使得能夠通過正常的后勤方法將它們從取樣地點(例如欠發(fā)達國家的當?shù)蒯t(yī)院或?qū)嶒炇?起運并運送到世界上其它地方的服務性測定實驗室。為了檢測低滴度的目標核酸，優(yōu)選將至少 100μl，更優(yōu)選將至少250μl樣品加到固相載體上。在此也提供了用于檢測、鑒定和/或定量樣品中的目標核酸的試劑盒，其包含能至少部分吸收所述樣品的固相載體；以及核酸分離溶液。
文檔編號C12Q1/70GK1665939SQ03815771
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月4日
發(fā)明者埃斯特·雷吉娜·德羅伊, 馬里納斯·彼得魯斯·德巴爾 申請人:普里馬根控股公司