專(zhuān)利名稱(chēng)：：篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及篩選方法，具體地講，涉及篩選DNA文庫(kù)、以便鑒定在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能導(dǎo)致所述宿主細(xì)胞的表型發(fā)生至少一種改變的DNA分子的方法。DNA文庫(kù)能夠方便地儲(chǔ)存和分析多核苷酸，以及它們的轉(zhuǎn)錄(mRNA)和表達(dá)產(chǎn)物(肽，多肽或蛋白質(zhì))。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“DNA文庫(kù)”意在包括DNA分子的總稱(chēng)，其中，所述文庫(kù)的各個(gè)成員編碼不同的單個(gè)基因和/或其片段和/或變體?；蛘?，所述文庫(kù)的每一個(gè)成員編碼不同的多種基因和/或其片段和/或變體。DNA文庫(kù)的篩選通常是直接研究異源DNA序列和/或它的表達(dá)產(chǎn)物，很少或不考慮它對(duì)細(xì)胞的影響。另外，大部分已知的DNA文庫(kù)篩選方法不是快速、高處理量、便于使用的技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于篩選DNA文庫(kù)的方法，包括(i)提供進(jìn)行電生理學(xué)測(cè)定的基質(zhì)，在該基質(zhì)上可以排布至少一個(gè)細(xì)胞；(ii)提供能表達(dá)至少一種異源DNA序列的至少一個(gè)細(xì)胞；(iii)將至少一個(gè)細(xì)胞排布在所述基質(zhì)上，以便可以檢測(cè)和/或測(cè)定所述細(xì)胞的電生理學(xué)的變化；和(iv)鑒定具有至少一種表現(xiàn)型改變的至少一個(gè)感興趣的細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中，篩選DNA文庫(kù)能夠精確研究具有已知和未知功能的核苷酸序列，包括與所述細(xì)胞表現(xiàn)型相關(guān)的基因以及它們的表達(dá)肽，多肽和蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是，所述感興趣的細(xì)胞和/或遺傳材料是分離的，以便能夠進(jìn)一步研究所述異源DNA，例如通過(guò)測(cè)序研究。優(yōu)選的是，將所述進(jìn)一步研究的結(jié)果保存在信息載體上。最優(yōu)選的是，所述信息載體是選自下列一組中的一種或多種紙件，電子郵件，計(jì)算機(jī)磁盤(pán)和互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)頁(yè)。優(yōu)選的是，提供多個(gè)細(xì)胞。最優(yōu)選的是，每個(gè)細(xì)胞包括不同的異源DNA序列。因此，所述多個(gè)細(xì)胞共同構(gòu)成了DNA文庫(kù)。優(yōu)選的是，能表達(dá)給定DNA文庫(kù)的細(xì)胞群體的篩選是通過(guò)電生理學(xué)測(cè)定和/或熒光顯微術(shù)和/或?qū)?xì)胞體積和/或形狀的改變的顯微鏡分析進(jìn)行的。將本發(fā)明的方法用于電生理學(xué)測(cè)定。在小的膜區(qū)域通過(guò)在電壓鉗條件下對(duì)所述膜片進(jìn)行電絕緣研究離子通道的原理，在以下文獻(xiàn)中進(jìn)行了概述Neher，Sakmann，和Steinbackin″細(xì)胞外膜片鉗，通過(guò)生物膜中的開(kāi)放通道分辯電流的方法″，PfluegerArch.375；219-278，(1978)。所述作者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將裝有乙酰膽堿(ACh)的吸液管壓在肌細(xì)胞膜的表面上，可以看到電流的不連續(xù)地跳動(dòng)。這是由于ACh-激活的離子通道的開(kāi)放和關(guān)閉造成的。他們的研究工作受到了以下事實(shí)的局限與所述通道的阻抗(10GQ)相比，吸液管玻璃和所述膜之間的密封阻抗(10-50MQ)是非常小的。通過(guò)這種密封所產(chǎn)生的電噪聲大到足以妨礙流過(guò)離子通道的電流。隨后發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)玻璃吸液管進(jìn)行火琢(firepolishing)，并且對(duì)吸液管的內(nèi)部施加吸力，用所述細(xì)胞的表面可以獲得非常高的阻抗(1-100GQ)。這種千兆封口將所述噪音降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到可以對(duì)大部分感興趣的生物學(xué)通道進(jìn)行研究的水平，并且大大拓寬了可以進(jìn)行這種研究的電壓范圍。這種改進(jìn)了的密封被稱(chēng)為″千兆封口″，并且將所述吸液管稱(chēng)為″膜片吸液管″(patchpipette)。有關(guān)千兆封口的更詳細(xì)的說(shuō)明參見(jiàn)以下文獻(xiàn)O.P.Hamill，A.Marty，E.Neher，B.Sakmann&F.J.Sigworth用于對(duì)來(lái)自細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞膜片的電流進(jìn)行高分辨率紀(jì)錄的改進(jìn)的膜片鉗術(shù)。PflugesArch.391，85-100，(1981)。離子通道是能催化無(wú)機(jī)離子通過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜蛋白。離子通道與很多細(xì)胞過(guò)程相關(guān)，包括產(chǎn)生和定時(shí)動(dòng)作電位，突觸傳遞，激素分泌，肌肉收縮。很多藥物是通過(guò)調(diào)節(jié)離子通道發(fā)揮它們的特殊作用的。其例子包括抗癲癇的化合物苯妥英，它能封閉大腦中的電壓依賴(lài)性Na+-通道，以及抗高血壓的藥物硝苯吡啶，它能封閉平滑肌細(xì)胞中的電壓依賴(lài)性Ca2+-通道。除了化學(xué)誘導(dǎo)的離子通道活性調(diào)節(jié)之外，所述膜片鉗技術(shù)使得科學(xué)家能夠?qū)﹄妷簺Q定型通道進(jìn)行操縱。該技術(shù)包括調(diào)整膜片吸液管中的電極的極性，以及改變鹽溶液的配方，以便調(diào)節(jié)浴液中的游離離子水平。優(yōu)選的是，對(duì)表型改變的篩選還可以通過(guò)研究異源DNA序列的作用，同時(shí)施加細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外測(cè)試試劑進(jìn)行。最優(yōu)選的是，所述測(cè)試試劑是選自下列一種或多種成分中的至少一種小有機(jī)分子(MW＜1000g/mol)，小肽(少于100個(gè)氨基酸)，神經(jīng)遞質(zhì)，激素和細(xì)胞因子。優(yōu)選的是，所述包括異源DNA序列的細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選的是選自人類(lèi)胚胎腎293(HEK293)，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)，COS，MDCK，NG108，NIH3T3或T84細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞外(例如，離子濃度，溫度或配體蛋白濃度)或細(xì)胞內(nèi)(例如，離子濃度，蛋白濃度或異源蛋白)成分改變時(shí)，就可能發(fā)生細(xì)胞條件的改變。因此，重組DNA序列的存在，可能影響細(xì)胞條件，以及可測(cè)定的表現(xiàn)型。重要的是，所述影響是對(duì)細(xì)胞內(nèi)成分產(chǎn)生的，其中，表達(dá)了所述重組DNA，因此改變了蛋白濃度，并且通過(guò)其中某些蛋白的功能而影響其他細(xì)胞過(guò)程。所述表達(dá)的異源蛋白的影響還可以延伸到影響細(xì)胞外條件。所述表達(dá)的重組蛋白影響細(xì)胞條件的一個(gè)例子是當(dāng)所述表達(dá)的重組蛋白是細(xì)胞膜離子通道時(shí)發(fā)生的。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外條件都受到了影響。離子通道允許和/或?qū)е码x子通過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)。這種運(yùn)動(dòng)是細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的或者相反，并因此改變了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的離子濃度。細(xì)胞條件的上述變化是表型變化，這些變化可以測(cè)定，并且用于指示感興趣的基因型的存在，即編碼導(dǎo)致宿主細(xì)胞表現(xiàn)型發(fā)生可測(cè)定變化的基因型的重組DNA。所述表型改變是相對(duì)源于被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞相同的細(xì)胞系的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行的，差別在于所述對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有用重組DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染。宿主細(xì)胞表型的改變可以利用本文所披露的芯片裝置測(cè)定，以便在與所述芯片的基質(zhì)接觸的同時(shí)，對(duì)所述宿主細(xì)胞進(jìn)行表型測(cè)定。用于本發(fā)明的細(xì)胞表達(dá)的DNA文庫(kù)的構(gòu)建，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR和克隆技術(shù)，同時(shí)結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)進(jìn)行。將DNA文庫(kù)的每一個(gè)成員導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以便每一個(gè)細(xì)胞僅包括一種重組DNA構(gòu)建體。兩種或兩種以上異源重組構(gòu)建體的存在，能削弱任何潛在可觀察到的表型信號(hào)，并且使得所觀察表型的原因性基因型的表征變得更困難。將一種重組構(gòu)建體穩(wěn)定整合到每一個(gè)細(xì)胞中的目的，可以通過(guò)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的低感染復(fù)數(shù)(MOI)實(shí)現(xiàn)，確保宿主細(xì)胞的低水平感染，并且結(jié)合進(jìn)行對(duì)包含在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上的抗性基因的篩選。優(yōu)選的是，用于篩選的抗性基因是選自下列一組新霉素，嘌呤霉素，殺稻瘟菌素D或zeomycin。要研究的DNA文庫(kù)的優(yōu)選例子是cDNA、隨機(jī)化的、多態(tài)性和基因組文庫(kù)。我們所說(shuō)的″cDNA文庫(kù)″表示通過(guò)細(xì)胞mRNA的逆轉(zhuǎn)錄獲得的DNA文庫(kù)。優(yōu)選使用標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)，以便消除由于高度表達(dá)的基因所產(chǎn)生的偏差，我們所說(shuō)的標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫(kù)表示這樣的cDNA文庫(kù)，其中，降低了高頻率cDNAs的頻率，產(chǎn)生了大致相等的cDNAs代表。我們所說(shuō)的″隨機(jī)化文庫(kù)″表示單一多核苷酸的DNA文庫(kù)，其中，該文庫(kù)的每一個(gè)成員與其他成員相差一個(gè)或多個(gè)核苷酸，并且所述變化是人工引入的。我們所說(shuō)的″多態(tài)性文庫(kù)″表示單一多核苷酸的DNA文庫(kù)，其中，該文庫(kù)的每一個(gè)成員與其他成員相差一個(gè)或多個(gè)核苷酸，其中，所述改變是所述多核苷酸的天然和固有的特征。我們所說(shuō)的″基因組文庫(kù)″是通過(guò)分級(jí)分離完整的細(xì)胞基因組DNA獲得的DNA文庫(kù)。DNA文庫(kù)可以通過(guò)若干種不同的分子技術(shù)構(gòu)建?；パa(bǔ)的DNA(cDNA)文庫(kù)——最常用的DNA文庫(kù)，可以用從真核細(xì)胞中分離的mRNA構(gòu)建。mRNA的結(jié)構(gòu)中引入了在轉(zhuǎn)錄后加工期間添加的3′polyA尾巴，使得能夠從加工過(guò)的mRNA合成cDNA。將分離的mRNA與過(guò)量的polyT寡核苷酸和逆轉(zhuǎn)錄酶一起溫育，其中，所述polyT寡核苷酸與所述互補(bǔ)的polyA尾巴退火。所述逆轉(zhuǎn)錄酶隨后可以用polyT寡核苷酸作引物，由它啟動(dòng)DNA合成，從而所述mRNA起著模板的作用，生成單鏈DNA，進(jìn)而用作雙鏈cDNA合成的模板。可以將所述cDNA用于標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中，或用于克隆到載體上，以便制備DNA文庫(kù)[FMAusubel等″CurrentprotocolsinMolecularBiology-VolumeOne″JohnWiley&sons，Inc.(1995)]。由于是利用mRNA合成的，cDNA與基因組DNA的差別在于，它不包括調(diào)控序列或內(nèi)含子。所產(chǎn)生的cDNA體現(xiàn)了在特定時(shí)間細(xì)胞的mRNA組成，并且不可能同樣體現(xiàn)來(lái)自親本細(xì)胞的基因組的每一個(gè)基因。因此，cDNA文庫(kù)有偏向性地體現(xiàn)細(xì)胞mRNA，主要包括多拷貝的管家基因，以及以幾個(gè)或沒(méi)有拷貝的形式存在的低表達(dá)基因。另外，存在未表達(dá)的基因，它們并不包括在所產(chǎn)生的cDNAs中。通過(guò)統(tǒng)一化方法可以制備能更均等地體現(xiàn)細(xì)胞mRNAs的cDNA文庫(kù)[MBSoares等″統(tǒng)一化cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和表征″，PNAS91pp.9228-32(1994)]。這一過(guò)程是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的使用互補(bǔ)的單鏈cDNA作退火配偶體，并且隨后篩選游離的單鏈cDNA。這種方法確保了高頻率cDNAs主要與互補(bǔ)鏈結(jié)合，并且顯著降低了頻率，同時(shí)，正常情況下低頻率的cDNAs只會(huì)中等程度地減少?？梢灾貜?fù)用這種方式進(jìn)行篩選，以便生產(chǎn)能適當(dāng)?shù)韧伢w現(xiàn)cDNAs的文庫(kù)。另一種DNA文庫(kù)是通過(guò)直接分級(jí)分離細(xì)胞基因組DNA，并且將所得到的片段插入合適的載體上而構(gòu)建的基因組DNA文庫(kù)。這樣的文庫(kù)包括具有完整的非編碼區(qū)的DNA。通常，基因組DNA的分級(jí)分離是通過(guò)機(jī)械或酶促方法實(shí)現(xiàn)的。另一種類(lèi)型的DNA文庫(kù)是隨機(jī)化文庫(kù)，其中，所述文庫(kù)包括編碼單一基因的克隆，每一個(gè)克隆包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的不同修飾，通常與研究中的蛋白質(zhì)的相同的具體肽結(jié)構(gòu)域相當(dāng)，但并不排除其他可能。所述隨機(jī)文庫(kù)可以是利用PCR方法構(gòu)建的[TOhmichi等″具有優(yōu)化的單鏈啟動(dòng)子的DNA納米環(huán)載體的有效細(xì)菌轉(zhuǎn)錄″，PNAS99pp.54-59(2002)；TJespersen等，“通過(guò)核酸外切酶″外端平整″進(jìn)行的由非PCR介導(dǎo)的PCR片段的有效的重疊延伸”，Biotechniques23pp.48-52(1997)]。通過(guò)摻入了隨機(jī)化核苷酸序列的PCR引物將隨機(jī)化修飾導(dǎo)入所述靶核苷酸，因此將所述修飾定點(diǎn)到特定的氨基酸位點(diǎn)。再一種類(lèi)型的DNA文庫(kù)是多態(tài)性文庫(kù)。在特定生物群體內(nèi)的很多基因是多態(tài)性的，即編碼特定蛋白的相同基因存在天然變體。例如，主要組織相容性復(fù)合體(MHC)蛋白包括在肽結(jié)合裂縫中的氨基酸多態(tài)性，因此所述結(jié)合裂縫是不同的，導(dǎo)致不同個(gè)體在它們的MHC蛋白結(jié)合特定靶的能力方面的改變[PJBjorkman和PParham″I型主要組織相容性復(fù)合體分子的結(jié)構(gòu)，功能和多樣性″Ann.Rev.Biochem.59pp.253-288(1990)]。因此，多態(tài)性文庫(kù)包括所述文庫(kù)的每一個(gè)成員，這些成員編碼單一基因的不同多態(tài)性拷貝。所述文庫(kù)特別有利于藥物篩選，以便研究與基因的特定多態(tài)性形式相關(guān)的不同的反應(yīng)形式和潛在的副作用。將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域所熟知[Sambrook&Russell，″Molecularcloning；Alaboratorymanual″3rdedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)]，包括電穿孔，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，磷酸鈣共沉淀和顯微注射。電穿孔是通過(guò)對(duì)含有DNA和待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的溶液施加短時(shí)間的電脈沖實(shí)現(xiàn)的[ReviewKShigekawa&WJDower″真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的電穿孔將大分子導(dǎo)入細(xì)胞的通用方法″，Biotechniques6pp.742-751(1988)]。所述電脈沖會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的短時(shí)間透化，在此期間，DNA能進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞液。隨后該DNA的一部分出現(xiàn)在細(xì)胞核中，在這里發(fā)生了所導(dǎo)入基因的瞬時(shí)表達(dá)，通常在轉(zhuǎn)染之后24-72小時(shí)之間達(dá)到高峰。脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(脂感染)是利用具有類(lèi)似天然脂類(lèi)細(xì)胞膜的人工脂膜的小泡(脂質(zhì)體)攜帶重組DNA。所述脂質(zhì)體能夠自發(fā)地與細(xì)胞膜融合，從而將它們的內(nèi)含物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。[綜述——RJMannino和SGould-Fogerite，″脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移″，Biotechniques，6pp.682-690(1988)]。FLBraham和AJvanderEb(″用于分析人類(lèi)腺病毒5DNA的感染力的新技術(shù)″Virol.，52pp.456-467(1973))證實(shí)了磷酸鈣共沉淀能大大增強(qiáng)基因向宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。將DNA與磷酸鹽緩沖液混合，向該緩沖液中添加氯化鈣。該方法產(chǎn)生了磷酸鈣和DNA的細(xì)小沉淀物，將該沉淀物應(yīng)用在宿主細(xì)胞上，從而所述細(xì)胞歷經(jīng)若干小時(shí)時(shí)間將所述沉淀DNA攝取到細(xì)胞質(zhì)中。通過(guò)顯微注射方法可以將重組DNA可靠地導(dǎo)入宿主細(xì)胞。該方法需要細(xì)的針頭以便穿入細(xì)胞，并且將DNA直接注射到細(xì)胞質(zhì)中[MCapecchi，″通過(guò)直接顯微注射進(jìn)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化″Cell，22pp.479-488(1980)]。顯微注射可以用計(jì)算機(jī)控制的裝置進(jìn)行，它能提高該技術(shù)的精確性和速度。導(dǎo)入靶細(xì)胞的DNA序列是異源DNA。我們所說(shuō)的異源DNA，表示業(yè)已導(dǎo)入所述細(xì)胞、超出所述細(xì)胞的正常DNA組成以外的DNA序列，并且，其中，所述DNA文庫(kù)的每一個(gè)異源DNA成員與其他成員相差一個(gè)或多個(gè)核苷酸。異源DNA序列的可靠表達(dá)是通過(guò)將克隆的DNA穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞DNA中實(shí)現(xiàn)的。例如，這一目的是利用基于逆轉(zhuǎn)錄病毒將它們的基因組穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞DNA中的天然能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可靠地實(shí)現(xiàn)的[Mann等″逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝突變體的構(gòu)建及其在生產(chǎn)無(wú)輔助缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒上的用途″，Cell33pp.153-159(1983)]{圖1}。在這樣的系統(tǒng)中，將克隆的DNA導(dǎo)入病毒基因組。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)通常包括兩種功能因子，順式因子和反式因子。反式因子編碼病毒包裝蛋白，而順式因子編碼其他必需的病毒核苷酸序列。將克隆的DNA導(dǎo)入所述宿主基因組，以便它被順式因子包圍成不能產(chǎn)生其自身包裝蛋白的重組前病毒DNA，因此，將所述前病毒DNA轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞中。包裝細(xì)胞包括反式因子，并且能產(chǎn)生病毒外殼，將克隆的前病毒DNA包裝到該外殼中，以便產(chǎn)生感染性顆粒。所述感染性顆粒被從宿主細(xì)胞中釋放，并且可以收獲，以便轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞培養(yǎng)物，其中，它能穩(wěn)定地整合病毒基因組，包括包含在它里面的克隆DNA。因此，所述克隆的DNA可以在所述靶細(xì)胞中表達(dá)，而所述逆轉(zhuǎn)錄病毒不能進(jìn)一步復(fù)制，因?yàn)樗鲋亟M病毒基因組缺乏必要的病毒基因[綜述-JMCoffin″逆轉(zhuǎn)錄病毒科，病毒及其復(fù)制，pp.1767-1845″InDMKnipe等(ed.)″Fieldsvirology″Lippencott-Ravenpublishers(1996)]。附圖的說(shuō)明下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明圖1-表示利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建DNA文庫(kù)和DNA文庫(kù)的細(xì)胞表達(dá)的示意圖。所述載體包括感興趣的異源DNA(基因)，抗性標(biāo)記(neo-新霉素抗性)和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。所述異源DNA的旁側(cè)是順式因子，包括長(zhǎng)的末端重復(fù)(LTR)。該構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了包括所述異源DNA和所述抗性標(biāo)記的mRNA。特定序列的隨機(jī)化是通過(guò)PCR、隨后進(jìn)行重疊延伸實(shí)現(xiàn)的。2號(hào)引物包括隨機(jī)化的核苷酸，以便將核苷酸變化導(dǎo)入特定位點(diǎn)。將通過(guò)PCR獲得的片段混合在重疊延伸中，以便獲得完整長(zhǎng)度的載體，用于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。將所述載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞中，在這里，通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)產(chǎn)生了上清液，該上清液在提取之后將包含可應(yīng)用于所述靶細(xì)胞的病毒。圖2-表示位于芯片上的檢測(cè)位點(diǎn)處的單一靶細(xì)胞的示意圖。所述細(xì)胞能表達(dá)單一基因組構(gòu)建體。在所述細(xì)胞的下面是測(cè)試位點(diǎn)和孔之間的小的開(kāi)口，對(duì)位于該位點(diǎn)的細(xì)胞膜進(jìn)行穿孔或?qū)⑵淙サ簦员氵M(jìn)行電生理學(xué)分析。示出了其他表型分析(點(diǎn)劃線)。還通過(guò)所述開(kāi)口提取mRNA進(jìn)行了基因型檢測(cè)，在所述開(kāi)口上的細(xì)胞膜是不完整的。圖3-是優(yōu)選的芯片結(jié)構(gòu)示意圖，其構(gòu)造如下1.芯片外殼。2.微型結(jié)構(gòu)單元。3.微型結(jié)構(gòu)單元上的玻璃/硅膜。4.包括含有細(xì)胞外緩沖液和化合物的通道/區(qū)室的小池。5.含有細(xì)胞內(nèi)緩沖液和來(lái)自具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞的mRNA的通道。6.用于導(dǎo)入細(xì)胞和化合物的入口/取液孔。7.細(xì)胞捕獲位點(diǎn)，包括位于膜3上的孔。所述孔是適當(dāng)成型的，以便能夠進(jìn)行千兆封口和形成完整細(xì)胞。8.懸浮液中的細(xì)胞。9.微型泵。圖4-表示篩選細(xì)胞表現(xiàn)型的方法的示意圖。具有用于表達(dá)cDNA的穩(wěn)定整合載體的細(xì)胞——由它產(chǎn)生膜結(jié)合蛋白(例如，離子通道)。圖5-表示肽隨機(jī)化DNA文庫(kù)的表型研究的示意圖。篩選與已知膜蛋白相互作用的肽調(diào)節(jié)化合物(編碼序列-XXX)?？梢詼y(cè)定影響該膜蛋白的肽的調(diào)節(jié)作用。圖6-表示較大的蛋白-細(xì)胞調(diào)節(jié)劑的肽隨機(jī)化的表型研究示意圖。業(yè)已將低效率調(diào)節(jié)子隨機(jī)化，以便提高它與已知膜蛋白的結(jié)合效率。X是來(lái)自所述DNA文庫(kù)的隨機(jī)化構(gòu)建體。圖7-表示較大的蛋白-受體——例如ScFv——的肽隨機(jī)化表型研究示意圖。ScFV結(jié)合位點(diǎn)隨機(jī)化(改變的區(qū)域通過(guò)X表示)可能影響結(jié)合親和力，而對(duì)這種親和力可以進(jìn)行表型測(cè)定。實(shí)施例實(shí)施例1-優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明預(yù)測(cè)性實(shí)施例在細(xì)胞系中表達(dá)的基因組文庫(kù)的構(gòu)建該實(shí)驗(yàn)的目的可以是增強(qiáng)特定配體與特定離子通道的結(jié)合。這是通過(guò)對(duì)已知配體與之結(jié)合的離子通道內(nèi)的特定氨基酸進(jìn)行隨機(jī)化實(shí)現(xiàn)的，包括將這些隨機(jī)化的基因產(chǎn)物導(dǎo)入細(xì)胞，并且在顯微陣列系統(tǒng)中對(duì)它進(jìn)行測(cè)定。顯微陣列測(cè)定的例子如例3，4，5所述。將所述離子通道基因插入雙順?lè)醋幽孓D(zhuǎn)錄病毒載體，該載體包括轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞所必需的所有逆轉(zhuǎn)錄病毒順式因子，以及來(lái)自EMCV的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，隨后是新霉素選擇基因(MorganRA，CoutureL，Elroy-SteinO，RaghebJ，MossB，AndersonWF。包括推測(cè)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多順?lè)醋踊蜣D(zhuǎn)移系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)以及在人類(lèi)基因治療上的應(yīng)用。NAR1992，201293-9)。當(dāng)所述離子通道基因被插入IRES因子上游時(shí)，所述離子通道基因和neo-基因?qū)⒊霈F(xiàn)在來(lái)自該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)錄單位的同一mRNA轉(zhuǎn)錄物上。所述離子通道基因隨后通過(guò)帽子-掃描機(jī)制進(jìn)行翻譯，同時(shí)，所述neo翻譯將從IRES因子開(kāi)始。所述離子通道中四個(gè)氨基酸的隨機(jī)化是通過(guò)基于兩步驟PCR的方法完成的(參見(jiàn)圖1)(通過(guò)核酸外切酶″末端平整″進(jìn)行的非PCR介導(dǎo)的有效PCR重疊延伸。JespersenT，DuchM，PedersenFSBiotechniques1997Ju1；23(1)48，50，52)。在第一個(gè)步驟中，進(jìn)行對(duì)所述轉(zhuǎn)錄單位(逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)的每一個(gè)末端進(jìn)行擴(kuò)增的兩個(gè)平行PCR。2號(hào)引物編碼12個(gè)隨機(jī)化的核苷酸(產(chǎn)生4個(gè)氨基酸)，緊靠與DNA鏈退火的序列的3′末端。在將這些隨機(jī)化的核苷酸引入到所述離子通道的編碼序列上時(shí)，將構(gòu)建出多達(dá)204種不同的基因型。2號(hào)和3號(hào)引物在這些引物的5′末端是彼此互補(bǔ)的，因此通過(guò)這些引物導(dǎo)入的序列可用于重疊延伸方法。PCR應(yīng)當(dāng)用以下成分進(jìn)行0.5pM引物(寡核苷酸)，100ng模板/100μl反應(yīng)體積，2.5單位校正聚合酶(如Pfu(Stratagene)或PlatinumTaqDNApolymeraseHighFidelity(LifeTechnologies))，以及相應(yīng)的緩沖液和200μMdNTP。PCR條件為在95℃下進(jìn)行2分鐘；隨后95℃30秒，50℃15秒，72℃3分鐘共15個(gè)循環(huán)，最后在72℃下進(jìn)行5分鐘。通過(guò)諸如BOSC23的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，將通過(guò)所述重疊延伸方法獲得的基因組文庫(kù)導(dǎo)入靶細(xì)胞(PearWS，NolanGP，ScottML，BaltimoreD.通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)高效價(jià)的無(wú)輔助逆轉(zhuǎn)錄病毒。ProcNatlAcadSciUSA.1993Sep15；90(18)8392-6)(CoffinJM(1996)Retroviridae)。在將所述PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)染(例如，使用lipofectamine(LifeTechnologies)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行)到所述包裝細(xì)胞系中時(shí)，所述DNA可以被轉(zhuǎn)錄成RNA，該轉(zhuǎn)錄的RNA將被包裝到由所述包裝細(xì)胞所產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。在轉(zhuǎn)染72小時(shí)之后，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)濾(0.5μm過(guò)濾器)，并直接添加到靶細(xì)胞中(轉(zhuǎn)導(dǎo))。在轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)之后，應(yīng)當(dāng)將選擇(新霉素)培養(yǎng)基添加到所述細(xì)胞中。在14天之后，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞會(huì)死亡，而轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞將形成集落。應(yīng)當(dāng)混合這些集落(胰蛋白酶化)，以便獲得含有所述基因組文庫(kù)的群體。此時(shí)，可以將該群體直接用于篩選實(shí)驗(yàn)或在-80度下保存。實(shí)施例2-用于表型分析的芯片在WO02/9402中披露了用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)的合適的芯片。為了在本發(fā)明中使用，對(duì)該芯片進(jìn)行了改進(jìn)，以便能夠從細(xì)胞中提取mRNA，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。所述芯片包括平面基質(zhì)，它包括第一表面部分和相對(duì)的第二表面部分。第一表面部分具有多個(gè)位點(diǎn)，其中的每一個(gè)位點(diǎn)適合承載包括離子通道的結(jié)構(gòu)。每一個(gè)位點(diǎn)包括與它相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極，所述基質(zhì)攜帶有一個(gè)或多個(gè)參考電極，所述測(cè)量電極和相應(yīng)的參考電極是在彼此形成電解接觸時(shí)、并且在它們之間施加電位差時(shí)，能夠通過(guò)由一個(gè)電極輸送離子、由另一個(gè)電極接受離子而在它們之間產(chǎn)生電流的電極。所述每一個(gè)位點(diǎn)適合在承載在該位點(diǎn)上的含有離子通道的結(jié)構(gòu)和該位點(diǎn)的表面部分之間提供高電阻密封。在提供這種密封時(shí)，可以隔離含有所述離子通道的結(jié)構(gòu)一側(cè)上確定的、并且與測(cè)量電極電解接觸的結(jié)構(gòu)域與包括所述離子通道的結(jié)構(gòu)的另一側(cè)確定的、與相應(yīng)的參考電極形成電解接觸的結(jié)構(gòu)域。該密封可以對(duì)通過(guò)所述電極之間的含離子通道結(jié)構(gòu)的離子通道流動(dòng)的電流進(jìn)行測(cè)定和/或監(jiān)測(cè)。本發(fā)明的電極是與所述基質(zhì)整合的，并且已通過(guò)晶片加工技術(shù)生產(chǎn)的?？梢酝ㄟ^(guò)主動(dòng)或被動(dòng)方法將存在于溶液中的包括離子通道的結(jié)構(gòu)(例如動(dòng)物細(xì)胞)導(dǎo)向基質(zhì)上的位點(diǎn)。當(dāng)所述包括離子通道的結(jié)構(gòu)與所述位點(diǎn)，例如電極周?chē)幕|(zhì)接觸時(shí)，接觸表面在該位點(diǎn)(例如電極周?chē)?上形成了高電阻密封(千兆封口)，以便可以利用相應(yīng)的電極測(cè)定所述離子通道的電生理學(xué)特征。所述電生理學(xué)特征可以是通過(guò)由所述千兆封口包圍起來(lái)的所述包括離子通道的結(jié)構(gòu)的膜部分傳導(dǎo)的電流。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)″千兆封口″一般表示至少1G歐姆的密封，并且這是通常追求的最起碼的密封程度，不過(guò)，對(duì)于某些類(lèi)型的測(cè)定來(lái)說(shuō)，當(dāng)電流較大時(shí)，較低的值也可能足以作為閾值。優(yōu)選使用膜片鉗的完整細(xì)胞構(gòu)造方法。該構(gòu)造可以通過(guò)以下方法獲得在與每一個(gè)許可的位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的測(cè)量電極和參考電極之間施加一系列的秒電位差脈沖(secondelectricpotentialdifferencepulses)，監(jiān)測(cè)在測(cè)量電極和參考電極之間流動(dòng)的秒電流(secondcurrent)，并且當(dāng)所述秒電流超過(guò)預(yù)定的閾值時(shí)，中斷所述系列的秒電位差脈沖，以便使最接近測(cè)量電極的所述包括離子通道的結(jié)構(gòu)部分破裂。另外，所述完整細(xì)胞構(gòu)造可以通過(guò)讓所述包括離子通道的結(jié)構(gòu)最接近測(cè)量電極的部分與成孔基質(zhì)相互作用獲得。應(yīng)當(dāng)指出的是，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“完整細(xì)胞構(gòu)造”不僅表示其中完整細(xì)胞已與測(cè)量位點(diǎn)的基質(zhì)接觸、并且業(yè)已打孔或通過(guò)成孔物質(zhì)造成開(kāi)口而與細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生電接觸的構(gòu)造，而且還包括這樣的構(gòu)造，其中，業(yè)已安裝了切割的細(xì)胞膜片，以便所述膜的外表面是“向上”，朝向要施加的測(cè)試樣品。由于與一個(gè)位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的所述測(cè)量電極是所述基質(zhì)上的多個(gè)電極之一，并且所述包括離子通道的結(jié)構(gòu)是存在于溶液中的很多結(jié)構(gòu)之一，優(yōu)選在特定的基質(zhì)上存在多個(gè)測(cè)量位點(diǎn)。所述多個(gè)測(cè)量位點(diǎn)可以用于對(duì)多個(gè)測(cè)試細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行分析。實(shí)施例3-電生理學(xué)測(cè)定電生理學(xué)測(cè)定可以用由所述基質(zhì)制成的芯片構(gòu)建體進(jìn)行，并且按照上文所述以及圖3所示方法使用，從而通過(guò)對(duì)測(cè)試細(xì)胞施加電壓改變來(lái)進(jìn)行膜片鉗測(cè)試。典型的測(cè)定包括在測(cè)定裝置上添加特定的測(cè)試樣品，為此，每一個(gè)測(cè)定裝置是與其他測(cè)定裝置彼此分離的，以避免測(cè)試樣品的混合，以及在所述裝置之間的電流傳導(dǎo)。此外，對(duì)沒(méi)有用異源DNA序列轉(zhuǎn)化過(guò)的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，以便提供所述細(xì)胞系的對(duì)照表型參數(shù)。可以在任何時(shí)間對(duì)多個(gè)測(cè)試細(xì)胞進(jìn)行研究，并且進(jìn)行所述電生理學(xué)測(cè)定和分析，以便證實(shí)哪一個(gè)測(cè)試細(xì)胞表現(xiàn)出與所述對(duì)照細(xì)胞不同的表型(如果有的話)。將通過(guò)對(duì)測(cè)試細(xì)胞施加電壓改變產(chǎn)生的電生理學(xué)測(cè)定值用于分析選自下列細(xì)胞表型特征中的一個(gè)或多種電流幅度(在去極化脈沖期間測(cè)定的最大電流)，激活動(dòng)力學(xué)(在去極化脈沖期間電流增加的時(shí)間常數(shù))，失活動(dòng)力學(xué)(在去極化脈沖之后電流減弱的時(shí)間常數(shù))，激活閾值(在細(xì)胞膜上打開(kāi)離子可滲透的孔的電壓電位)以及尾電流(在去極化脈沖之后測(cè)定的電流)(HilleB.Ionchannelsofexcitablemembranes.3thedition.2001.SinauerAssociates，Inc，Sunderland，MA，USA)。實(shí)施例4-基于熒光的篩選已知某些熒光探針能結(jié)合細(xì)胞分子，用于指示多種細(xì)胞參數(shù)中的一個(gè)或多種，包括，但不局限于pH(例如，H+特異性探針)，膜電位和離子的濃度通量(例如，Ca2+(fura2)和Mg2+(mag-fluo4)特異性探針(MolecularProbes，Inc，TheNetherlands))(MethodsCellBiol1989；30157-92BrightGR，F(xiàn)isherGW，RogowskaJ，TaylorDL.Fluorescenceratioimagingmicroscopy)(InoueS.Progressinvideomicroscopy.CellMotilCytoskeleton1988；10(1-2)13-7。在對(duì)位于所述基質(zhì)上的測(cè)試細(xì)胞施加電壓改變時(shí)——此時(shí)業(yè)已額外添加了熒光探針，所述熒光探針將與它的特異性靶分子(如果在測(cè)試細(xì)胞中存在這樣的分子的話)結(jié)合，導(dǎo)致熒光信號(hào)的誘導(dǎo)。可以通過(guò)熒光顯微術(shù)對(duì)所述熒光信號(hào)進(jìn)行定量(MethodsCellBiol1989；30157-92BrightGR，F(xiàn)isherGW，RogowskaJ，TaylorDL.Fluorescenceratioimagingmicroscopy)(InoueS.Progressinvideomicroscopy.CellMotilCytoskeleton1988；10(1-2)13-7)，并由此翻譯成被測(cè)量的細(xì)胞內(nèi)條件的直接測(cè)定值，以便將測(cè)試細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較，從而確定表現(xiàn)出不同表現(xiàn)型的測(cè)試細(xì)胞。實(shí)施例5-大小或形狀測(cè)定值對(duì)表達(dá)所述DNA文庫(kù)的細(xì)胞大小或形狀改變的測(cè)定能夠用于鑒定與對(duì)照細(xì)胞相比業(yè)已影響了宿主細(xì)胞的總體物理構(gòu)型的多核苷酸和/或基因和/或肽和/或多肽和/或蛋白。所述測(cè)定是通過(guò)自動(dòng)化顯微檢測(cè)進(jìn)行的(FoskettJK.[Ca2+]imodulationofCl-contentcontrolscellvolumeinsinglesalivaryacinarcellsduringfluidsecretion.AmJPhysiol1990Dec；259(6Pt1)C998-1004)(SMuallem，BXZhang，PALoessberg，和RAStar，在單個(gè)骨肉瘤細(xì)胞UMR-106-01中同時(shí)記錄細(xì)胞體積變化和細(xì)胞內(nèi)pH或Ca2+濃度。J.Biol.Chem.199226717658-17664)。實(shí)施例6-mRNA的分離和“命中”的表征提供“陽(yáng)性”結(jié)果或“命中”(hit)的細(xì)胞是這樣的細(xì)胞與來(lái)自相同細(xì)胞系的未轉(zhuǎn)化過(guò)的對(duì)照細(xì)胞相比，它們具有改變了的表現(xiàn)型。一旦鑒定了陽(yáng)性細(xì)胞，則表征其基因型就是篩選異源DNA序列的下一個(gè)步驟。通過(guò)從陽(yáng)性細(xì)胞中分離mRNA，分析造成所述陽(yáng)性表型信號(hào)的基因型的表征。所述mRNA的提取可以通過(guò)選自吸液、細(xì)胞裂解和機(jī)械取出的一種或多種方法進(jìn)行。吸液是通過(guò)將吸液管、注射器、針頭或類(lèi)似的工具之一插入細(xì)胞并取出細(xì)胞質(zhì)部分來(lái)進(jìn)行的。優(yōu)選的吸液方法是通過(guò)從所述芯片的測(cè)試基質(zhì)的細(xì)胞固定位點(diǎn)上的通道抽取細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行的{圖2&3}。另外優(yōu)選的是，通過(guò)所述通道取出mRNA的過(guò)程是通過(guò)微型泵(9)施加的吸力實(shí)現(xiàn)的，或在通過(guò)所述通道之后，將吸液管、注射器、針頭或類(lèi)似的工具之一插入所述細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。裂解是通過(guò)將裂解緩沖液(例如，0.2MNaOH，1％SDS)添加到裝有細(xì)胞的腔室中實(shí)現(xiàn)的，以便分解細(xì)胞膜，并且釋放細(xì)胞成分。mRNA提取的機(jī)械方法是通過(guò)以下步驟進(jìn)行的使用專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)成從陣列的孔中取出細(xì)胞的工具將細(xì)胞從腔室中刮出。將所述細(xì)胞從所述腔室上刮掉的過(guò)程使所述細(xì)胞破裂，并且釋放出細(xì)胞成分，然后從這些成分中提取mRNA。受到所施加的刺激影響的多核苷酸、肽、多肽和/或蛋白的進(jìn)一步表征是通過(guò)從所述測(cè)試細(xì)胞中分離的mRNA進(jìn)行RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶PCR)表征進(jìn)行的。為了只擴(kuò)增感興趣的核苷酸，RT-PCR引物的設(shè)計(jì)需要對(duì)感興趣的核苷酸序列有事先了解，或?qū)Ω信d趣的核苷酸旁側(cè)序列有事先的了解。在本發(fā)明中，位于所述感興趣的核苷酸旁側(cè)的區(qū)域是已知的，因?yàn)樗鼈儼ㄎ挥谒霎愒碊NA序列旁側(cè)的病毒載體區(qū)域。在從所述陽(yáng)性細(xì)胞中分離了mRNA之后，將被設(shè)計(jì)成與感興趣的核苷酸的旁側(cè)病毒區(qū)互補(bǔ)的RT-PCR引物用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便合成單鏈cDNA。將該cDNA進(jìn)一步用作常規(guī)PCR反應(yīng)的模板，用于該反應(yīng)的引物包括已知的限制位點(diǎn)，以便來(lái)自PCR的雙鏈產(chǎn)物能夠方便地亞克隆到其他載體上。這種包括感興趣的核苷酸的新型載體可用于測(cè)序反應(yīng)和用于表達(dá)合適的產(chǎn)物，以便更好地表征感興趣的核苷酸，并且，如果合適的話，可以表征它的表達(dá)產(chǎn)物。例如，所述表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步表征可以通過(guò)常規(guī)膜片鉗技術(shù)或熒光測(cè)試實(shí)現(xiàn)。通過(guò)芯片技術(shù)分析細(xì)胞表達(dá)的cDNA文庫(kù)，能夠用于篩選多種已知和未知蛋白?？梢葬槍?duì)所研究的蛋白質(zhì)功能，對(duì)在具體篩選中所采用的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，例如，如果所述篩選針對(duì)的是新的電壓門(mén)控離子通道的話，所述篩選方法優(yōu)選涉及電生理學(xué)參數(shù)。實(shí)施例7-測(cè)試試劑的應(yīng)用優(yōu)選的實(shí)施方案還可以包括讓測(cè)試細(xì)胞接觸測(cè)試試劑的步驟，所述測(cè)試試劑可能會(huì)或不會(huì)影響與異源DNA序列有關(guān)的表型。將所述測(cè)試細(xì)胞的表型與業(yè)已額外接觸了所述測(cè)試試劑的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較。優(yōu)選的是，所述測(cè)試試劑是下列一組中的至少一種有機(jī)小分子，小肽，神經(jīng)遞質(zhì)，激素和細(xì)胞因子。實(shí)施例8-本發(fā)明的其他用途本發(fā)明的主要用途是篩選DNA文庫(kù)，但本發(fā)明的用途是多種多樣的。本發(fā)明的潛在用途包括，但不局限于新型治療化合物和新型藥物目標(biāo)的鑒定和/或表征和/或合成。其他用途包括以下成分的鑒定和/或表征參與或影響細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子；與靶分子結(jié)合相關(guān)和/或必需的結(jié)合蛋白的氨基酸。本發(fā)明的另一種用途是篩選隨機(jī)化的和/或多態(tài)性文庫(kù)，用于鑒定和/或表征具有增強(qiáng)的和/或減弱了的功能的變體。實(shí)施例9-作為起點(diǎn)的隨機(jī)化文庫(kù)隨機(jī)化肽的表達(dá)，在新藥物的潛在發(fā)現(xiàn)和小肽的功能和相互作用方式研究中都有重要意義{圖5}?？梢酝ㄟ^(guò)某些小肽改變蛋白功能和細(xì)胞途徑，這一目的是通過(guò)它們與蛋白質(zhì)內(nèi)的特定肽結(jié)構(gòu)域結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。因此，所述小肽具有治療疾病的潛在能力。對(duì)在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的所述肽的進(jìn)一步研究可能顯示體內(nèi)功能缺乏。不過(guò)，用分離的mRNA和表達(dá)的產(chǎn)物，還可以建立所述肽的結(jié)構(gòu)模型，通過(guò)它可以得到能模擬所述肽的功能的合成有機(jī)化合物。另外，業(yè)已在體內(nèi)的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有未知功能的多種小肽。隨機(jī)化肽的表達(dá)是闡明所述小肽功能的一種方法。實(shí)施例10-作為起點(diǎn)的大蛋白質(zhì)隨機(jī)化文庫(kù)其他隨機(jī)化文庫(kù)可以包括較大蛋白質(zhì)內(nèi)的局部肽結(jié)構(gòu)域隨機(jī)化{圖6&7}。結(jié)合蛋白包括具有不同功能的結(jié)構(gòu)域，即結(jié)合結(jié)構(gòu)域和通常的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域。已知多種這樣的結(jié)構(gòu)蛋白能以較低的親和力結(jié)合它們的靶分子，因此，將所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行隨機(jī)化，以便提高(例如，抗體)或降低(例如，降低副作用)配體和靶蛋白之間的親和力，可以產(chǎn)生要研究的理想文庫(kù)。實(shí)施例11-作為起點(diǎn)的多態(tài)性文庫(kù)存在于人群中的很多基因是多態(tài)性的。多態(tài)性文庫(kù)在篩選潛在藥物的副作用和不同的反應(yīng)方式方面是具有價(jià)值的。當(dāng)所述多態(tài)性文庫(kù)較大和/或并非所有多態(tài)性序列都是已知的時(shí)，通過(guò)芯片技術(shù)進(jìn)行篩選可能是有利的，因?yàn)檫@種技術(shù)有利于研究的方便性。權(quán)利要求1.一種用于篩選DNA文庫(kù)的方法，其中包括(i)提供進(jìn)行電生理學(xué)測(cè)定的基質(zhì)，在該基質(zhì)上可以排列至少一個(gè)細(xì)胞；(ii)提供表達(dá)至少一種異源DNA序列的至少一個(gè)細(xì)胞；(iii)將至少一個(gè)細(xì)胞排布在所述基質(zhì)上，以便檢測(cè)和/或測(cè)定所述細(xì)胞的電生理學(xué)的變化；和(iv)鑒定具有至少一種表現(xiàn)型改變的至少一個(gè)感興趣的細(xì)胞。2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括分離感興趣的細(xì)胞和/或其遺傳學(xué)材料的額外步驟。3.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述方法包括從在步驟(iii)中鑒定的感興趣的細(xì)胞中分離mRNA的額外步驟。4.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述方法還包括對(duì)所述遺傳學(xué)材料進(jìn)行測(cè)序的步驟。5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述方法還包括將所述序列信息保存或紀(jì)錄在諸如計(jì)算機(jī)磁盤(pán)的信息載體上的步驟。6.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，在步驟(ii)中提供多個(gè)細(xì)胞。7.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，在步驟(ii)中提供多個(gè)細(xì)胞，每一個(gè)細(xì)胞包括不同的異源DNA序列。8.如權(quán)利要求6或7的方法，其中，所述多個(gè)細(xì)胞共同包含了異源DNA的DNA文庫(kù)。9.如權(quán)利要求8的方法，其中，所述DNA文庫(kù)是cDNA文庫(kù)。10.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞的電生理學(xué)變化是通過(guò)膜片鉗技術(shù)檢測(cè)和/或測(cè)定的。11.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞在步驟(iii)之前用測(cè)試試劑處理過(guò)。12.如權(quán)利要求11的方法，其中，所述測(cè)試試劑選自下列一組中的至少一種小有機(jī)分子，小肽，神經(jīng)遞質(zhì)，激素和細(xì)胞因子。13.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。14.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述動(dòng)物細(xì)胞選自人類(lèi)胚胎腎293(HEK293)，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)，COS，MDCK，NG108，NIH3T3或T84細(xì)胞。15.如權(quán)利要求6-14中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述細(xì)胞被排布在所述基質(zhì)內(nèi)或基質(zhì)上的有間隔的位點(diǎn)處。全文摘要本發(fā)明涉及篩選方法，具體地講，涉及篩選DNA文庫(kù)，以便鑒定當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能夠?qū)е滤鏊拗骷?xì)胞的表型發(fā)生至少一種改變的DNA分子的方法，所述表型改變可使用膜片鉗芯片構(gòu)建體檢測(cè)。另外，本發(fā)明涉及與產(chǎn)生所述細(xì)胞表型改變的DNA分子相當(dāng)?shù)膍RNA的分離。文檔編號(hào)C12M1/34GK1665928SQ03815552公開(kāi)日2005年9月7日申請(qǐng)日期2003年6月6日優(yōu)先權(quán)日2002年6月7日發(fā)明者T·賈斯博森,M·貝克,J·庫(kù)特欽斯基,S·P·奧爾森,R·泰伯瑞斯基申請(qǐng)人:索菲昂生物科學(xué)有限公司