專利名稱：可注射軟骨細胞植入物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及軟骨細胞細胞植入，軟骨移植，治療術(shù)，關(guān)節(jié)修補和預防關(guān)節(jié)炎病變領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及一種植入物新的形式，并且涉及軟骨細胞細胞植入和軟骨再生的新的方法。
背景技術(shù)：
在美國每年實施500,000例以上的關(guān)節(jié)成形手術(shù)和全部關(guān)節(jié)替代。在歐洲大約實施相同數(shù)目的相似手術(shù)。這些數(shù)目里包括每年大約90,000例全部膝蓋替代和50,000例左右修補膝蓋缺損的手術(shù)(見Praemer A.，F(xiàn)urner S.，Rice，D.P.，Musculoskeletalconditions in the United States，Park Ridge，Ill.AmericanAcademy of Orthopaedic Surgeons，1992，125)。軟骨再生治療方法是最有用的，可以在關(guān)節(jié)損傷的早期階段實施，這樣減少需要人工關(guān)節(jié)替代手術(shù)的患者數(shù)目。利用這樣的預防性治療方法，還降低了發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎的患者數(shù)目。
用來重修受損傷關(guān)節(jié)中軟骨結(jié)構(gòu)表面的技術(shù)主要試圖利用軟骨下鉆，磨和其他方法修補軟骨，從而切除病灶軟骨和軟骨下骨，暴露出有血管的骨松質(zhì)(Insall，J.，Clin.Orthop.1974，101，61；FicatR.P.等，Clin Orthop.1979，144，74；Johnson L.L.，于(McGintyJ，B.，編著)Operative Arthroscopy，NewYorkRaven Press，1991，341)。
Coon和Cahn(1966，Science 1531116)描述了培養(yǎng)來自雞胚體節(jié)的軟骨合成細胞的技術(shù)。后來Cahn和Lasher(1967，PNAS USA 581131)利用用于分析涉及DNA合成的系統(tǒng)作為軟骨分化的必備條件。響應EGF和FGF軟骨細胞出現(xiàn)生長(Gospodarowicz和Mescher，1977，J.Cell Physiology 93117)，但是最后喪失了它們的分化功能(Benya等，1978，Cell 151313)。有人描述過培養(yǎng)軟骨細胞的方法，并且主要應用根據(jù)(Brittberg M.等，New Engl.J.Med.1994，331，889)所述進行較小的調(diào)整的方法。使用應用這些方法培養(yǎng)的細胞作為植入到患者膝關(guān)節(jié)中的自體植入物。
屬于馬里蘭州Chondros，Inc.of Baltimore的國際申請?zhí)朠CT/US00/06541，描述了在微載體上生長的細胞。然后通過酶促消化從微載體分離細胞。這篇參考文獻還描述了能用作要用于植入的細胞的支架結(jié)構(gòu)的各種聚合物。國際申請?zhí)朠CT/US00/06541的全部內(nèi)容在這里引作參考。
另外，Kolettas等驗證了軟骨特異性分子例如膠原和蛋白聚糖在延長的細胞培養(yǎng)下的表達。它們發(fā)現(xiàn)，與瓊脂糖凝膠、藻酸鹽珠上的懸浮培養(yǎng)或旋動培養(yǎng)(保持圓形細胞形態(tài))相比，雖然在單層培養(yǎng)中形態(tài)學發(fā)生變化(Aulthouse，A.等，In Vitro Cell Dev.Biol，1989，25，659；Archer，C.等，J.Cell Sci.1990，m97，361；Haanselmann，H.等，J.Cell Sci.1994，107，17；Bonaventure，J.等，Exp.Cell Res.1994，212，97)，但是，表達的標記例如II和IX型膠原和大的聚集的蛋白聚糖，聚集蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖和連接蛋白沒有改變。(Kolettas，E.等，Science 1995，108，1991)。
關(guān)節(jié)軟骨細胞是僅在軟骨中發(fā)現(xiàn)的特化的由間充質(zhì)衍生的細胞。軟骨細胞是無血管組織，其物理性能取決于軟骨細胞產(chǎn)生的胞外基質(zhì)。在軟骨內(nèi)骨化過程中，軟骨細胞經(jīng)歷熟化導致細胞過度生長，特征在于發(fā)生X型膠原的表達(Upholt，W.B.和Olsen，R.R.，于Cartilage Molecular Aspects(Hall，B.& Newman，S，編著)CRCBoca Raton 1991，43；Reichenberger，E.等，Dev.Biol.1991，148，562；Kirsch，T.等，Differentiation，1992，52，89；Stephens，M.等，J.Cell Sci.1993，103，1111)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種可植入組合物，其含有載體材料，優(yōu)選為固體或半固體材料，包括微顆粒珠，線，干膠片，線團，或者珠，線，干膠片，和/或線團的組合(下文稱作″微顆粒載體材料″)。在一個實施方案中，微顆粒載體材料是各種大小和形狀的。在一個實施方案中，微顆粒載體材料支撐軟骨細胞或其他類型的細胞的附著和生長，在一些具有保持在微顆粒載體材料表面上的軟骨細胞的實施方案中，該微顆粒載體材料在注射給植入位點之前和/或之后是可流動的。
在本發(fā)明的實施方案中，軟骨細胞生長或粘著(下文概括稱作″粘著″)在微顆粒載體材料表面以及之中，因為微顆粒載體材料表面有一個或多個多孔開口。使用中，本發(fā)明的可植入組合物任選地進一步包括一種或多種粘合劑和/或賦形劑，例如凝膠，膠原，血纖蛋白膠，自體的，半自體的和非自體的膠以及膠原凝膠，皮膚膠，手術(shù)膠，和藻酸鹽。
然后對受者施用根據(jù)本發(fā)明的可植入組合物(一般通過注射)，作為下面的一種或多種1)粘合劑和/或賦形劑和可植入組合物的混合物，2)一層可植入組合物，任選地包括粘合劑或賦形劑，接著一層一種或多種粘合劑，3)一層一種或多種粘合劑，接著一層可植入組合物，任選地包括粘合劑或賦形劑，或者4)一層沒有粘合劑或賦形劑的可植入組合物。
本發(fā)明還包括含有微顆粒載體材料和軟骨細胞或者能形成軟骨或能分化成能形成保留在其上的軟骨的細胞的其他細胞的可植入組合物的制備方法。在本發(fā)明中能使用其他細胞，例如間充質(zhì)細胞，血細胞和脂肪細胞。在其他實施方案中，本發(fā)明包括與粘合劑或賦形劑組合的上述可植入組合物的制備方法。此外，本發(fā)明提供通過植入或移植包括任選地與粘合劑或賦形劑組合的微顆粒載體材料和其上和/或其中保持的軟骨細胞的組合物提供對關(guān)節(jié)表面軟骨有效治療的方法(例如，增強患者受損傷關(guān)節(jié)表面的使用)。
如這里使用的，″大約″意思是指定值的正負大約10％，例如″大約20微米″指大約18至22微米。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法能測定顆粒的大小。
附圖簡述

圖1是細胞附著在其表面并且在其表面上生長的本發(fā)明的線的一部分的側(cè)視圖。
圖2是細胞附著在其表面并且在其表面上生長的本發(fā)明的珠，微球體，或微珠的側(cè)視圖。
圖3是從試驗的載體材料收獲的細胞的平均數(shù)的圖形表示。
圖4是從試驗的載體材料收獲的細胞的平均成活力的圖形表示。
圖5是本發(fā)明充滿型微顆粒珠形成的異型膠原凝膠示意圖。
圖6是本發(fā)明的線形成的海綿樣材料示意圖。
圖7是三維體積中填入的干燥的不溶性纖維膠原海綿樣材料示意圖。
圖8是同型膠原凝膠及膠原凝膠形成方法示意圖。
圖9是用膠原膜包被的膠原海綿樣材料的示意圖。
圖10是用來制備本發(fā)明的線團的儀器的示意圖。
圖11是用來制備本發(fā)明的線團的方法的示意圖。
圖12是用來制備本發(fā)明的線團的方法以及本發(fā)明的線團的示意圖。
圖13是用來制備本發(fā)明的珠的儀器的示意圖。
圖14是用來制備本發(fā)明的珠的方法的示意圖。
圖15是用來制備本發(fā)明的珠的方法的示意圖。
圖16是用來制備本發(fā)明的干膠片的儀器的示意圖。
圖17是用來制備本發(fā)明的干膠片的方法的示意圖。
圖18是用來制備本發(fā)明的干膠片的方法的示意圖。
圖19是各自從本發(fā)明的膠原線形成的線團和干膠片的顯微鏡視圖。
圖20是本發(fā)明的膠原珠的顯微鏡視圖。
圖21是軟骨細胞的顯微鏡視圖。
圖22是軟骨細胞的顯微鏡視圖。
圖23是軟骨細胞的顯微鏡視圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括一種可植入組合物，其含有能支持軟骨細胞在微顆粒載體材料表面之上或之中附著和/或生長的微顆粒載體材料。本發(fā)明進一步包括含有軟骨細胞在其上或之中附著和/或生長的微顆粒載體材料的可植入組合物的制備方法。此外，本發(fā)明包括通過移植或植入包括微顆粒載體材料和在其上和/或其中附著和/或生長的軟骨細胞的組合物有效治療受損關(guān)節(jié)表面軟骨的方法。通過植入或移植組合物而有效治療關(guān)節(jié)表面軟骨的方法包括，任選地通過注射，特別是關(guān)節(jié)內(nèi)注射或者另一種最小侵入性放置，在要治療區(qū)域表面或內(nèi)部放置組合物，使得軟骨細胞在該區(qū)域的表面或內(nèi)部生長，從而修復軟骨組織。在一個實施方案中，發(fā)現(xiàn)該方法特別用于骨表面之間有小量間隙的關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)表面軟骨的治療，例如，但不限于，肩部和髖部球窩關(guān)節(jié)，和其他關(guān)節(jié)例如手和腳的指關(guān)節(jié)和臉部關(guān)節(jié)例如頜。
另外，在本發(fā)明的組合物和方法的一些實施方案中，本發(fā)明任選地包括一種或多種生物相容粘合劑以及一種或多種賦形劑的應用。如這里使用和下文更詳細描述的，賦形劑是一種能影響可植入組合物的流動性的生物相容材料。使用粘合劑將本發(fā)明的組合物保留在要治療的預期表面上或預期區(qū)域中。在一個實施方案中，選擇粘合劑，使得它起著止血屏障的功能并且任選地還以和賦形劑類似的方式在植入之前和之后影響可植入組合物的流動性。
下面更詳細地討論本發(fā)明的各種成分。只是為了描述的目的，使用這里描述的膠原作為用作線，珠，線團和/或干膠片的例示的可生物降解材料，但是還可以使用適合在本發(fā)明中使用的其他可生物降解材料。
可植入組合物本發(fā)明的可植入組合物包括微顆粒載體材料(也稱作“載體材料”或“多孔膠原生物材料”)和細胞，所述細胞與載體材料附著，或者，如果載體材料的表面是多孔的，則附著在其中。
通過將膠原的氧化溶液注射到交聯(lián)浴中能制備微顆粒載體材料(如下面參照附圖10-18描述的)。在一個這樣的實施方案中，通過利用胃蛋白酶提取技術(shù)制備氧化膠原，形成膠原纖維，在-20℃下保持。周期性地，使纖維進行酸氧化作用，氧化糖和羥賴氨酸官能團，這生成醛基。然后在NaCl溶液中沉淀膠原，之后用另外的NaCl洗滌。沉淀和洗滌之后，用丙酮再次洗滌沉淀，形成氧化膠原粉末，其之后能在酸中溶解，得到適合注射到交聯(lián)浴中的氧化膠原溶液，其中1)胺基和2)氧化糖和羥賴氨酸基團之間能發(fā)生反應，從而形成聚亞胺交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，針16，有90度末端和0.5毫米直徑，能用來將0.5-1.5％膠原溶液注射到交聯(lián)浴中，如下面參照附圖10-12更詳細描述的。
為了形成多孔膠原生物材料，一般地，膠原α-鏈與原纖維通過交聯(lián)技術(shù)共價連接。最初，用高碘酸氧化膠原，通過羥賴氨酸和糖殘基的氧化作用在α-鏈內(nèi)產(chǎn)生醛基。在一個實施方案中，以Tardy等，美國專利No.4,931,546描述的方法，使膠原交聯(lián)，該篇專利文獻全文引作參考。如下文描述的，通過將膠原凝膠通過毛細管注射，能形成珠，線，線團，和干膠片。在中性pH下，通過醛基(R-CHO)和氨基(R′-NH2)發(fā)生反應，接著產(chǎn)生聚亞胺R-CH＝N-R′交聯(lián)而發(fā)生交聯(lián)，如美國專利No.4,931,546所述。在一個這樣的實施方案中，使用戊二醛，線可能交聯(lián)或者可能不交聯(lián)。在另一個實施方案中，用另外量的膠原包被膠原結(jié)構(gòu)的一部分，在結(jié)構(gòu)表面的一部分之上形成膜。膜作為防止細胞遷移的屏障發(fā)揮功能。
膠原珠22，線12，線團12，和干膠片37的形成涉及將膠原注射到交聯(lián)浴中的不同的方法，下面參照附圖10-18更詳細地描述每一種方法。在一個實施方案中，注射到浴中之后，中和膠原載體材料的酸度并且進行甘油溫育。在一個實施方案中，然后在空氣流下將載體材料干燥并且通過輻射滅菌，例如γ滅菌，得到適合細胞培養(yǎng)的載體材料。
如這里使用的，載體材料形式是線12，線團12或珠22，或干膠片37，和/或其混合物。
A.線在一個實施方案中，微顆粒載體材料包括一種或多種線。圖1給出一種線的一部分。在圖1所示的實施方案中，線12有與線12的表面粘著的細胞11。在另一個實施方案中，線12可以由任何可生物降解的材料制成，例如膠原，更具體地I型，II型或III型膠原，或者它們的組合或者下面描述的一種或多種微顆粒載體材料。載體材料還能彼此交聯(lián)。一般地，線12的大小適合哺乳動物細胞在其上或其中附著和/或生長(取決于線12的孔隙率和細胞11的大小)。線12直徑一般是大約20至400微米。在線12的一些實施方案中，孔具有足夠的允許細胞例如軟骨細胞遷移到線12內(nèi)部的直徑。然后能使用線12形成海棉樣材料，如圖6和7所示并且下文將更詳細地描述，或者線12能形成，壓制或軋制成線團12(參考是線團12A，如圖12所示)，在一些實施方案中，線12具有大約30cm2的總表面積。線12還能形成干膠片，如圖19所示，下文也將更詳細地描述。
在一個實施方案中，通過將可生物降解材料例如膠原凝膠通過毛細管注射到凝固浴中能制備線12。發(fā)生交聯(lián)之后線變得不溶。如圖10，11和12所示，一般地，通過具有90度末端和0.5mm直徑的針，能將氧化膠原13，優(yōu)選1％氧化膠原的溶液，注射到交聯(lián)緩沖液14浴中。在一個實施方案中，在連續(xù)或半連續(xù)束或線12中注射膠原。膠原接觸交聯(lián)緩沖液時，膠原開始固化。從自身交聯(lián)或者自身能交聯(lián)在一起的分開交聯(lián)的膠原線或線片段的單一膠原線能形成線團12(圖12中如12A所示)。
圖19表示的顯微鏡視圖說明交聯(lián)的膠原線形式的線團12的例子。
或者，在其中線用作載體材料的一個實施方案中，線12能被模壓，軋制或壓制成其他團樣形狀或者形成海棉樣材料，如下文所述。
B.珠在另一個實施方案中，微顆粒載體材料包括一種或多種珠22，如圖2所示。在圖2所示的實施方案中，珠22有與珠22的表面附著的和/或在其中生長的細胞11(取決于珠22的孔隙率和細胞11的大小)。珠22可以由任何可生物降解的材料制成，包括I型，II型或III型膠原，或者它們的組合或者下面描述的一種或多種微顆粒載體材料。一般地，珠22的直徑是適合哺乳動物細胞在其上附著和/或生長的大小，通常直徑是20至400微米。圖20表示的顯微鏡視圖給出交聯(lián)膠原形成的珠22的例子。在另一個實施方案中，如果珠22具有足夠的孔隙率，則細胞11能附著珠22和/或在珠22中生長。在珠22的多孔實施方案中，孔具有足以允許細胞例如軟骨細胞遷移到珠22內(nèi)部中的直徑。
在一個實施方案中，根據(jù)IMEDEX的歐洲專利公開351296 A1描寫的方法能制備珠22，該專利文獻全文引作參考。根據(jù)IMEDEX EP專利文獻的公開，從膠原溶液中形成和回收來自豬或牛來源真皮的I型膠原小滴。如圖13，14，和15所示，用針16能將一般大約0.8％膠原的氧化膠原的溶液25注射到交聯(lián)緩沖液14中形成珠22。在一個實施方案中，使用壓縮空氣31驅(qū)動膠原溶液進入針16。將膠原注射到交聯(lián)緩沖液中時，振動器29輕輕振動注射裝置，使得膠原以逐滴方式從針滴落，形成珠滴22。因為珠滴22獨立接觸交聯(lián)緩沖液，珠滴22表面交聯(lián)，固化并且在交聯(lián)緩沖液中收集為固體珠22，如圖14和15所示。通過攪拌，且在一個實施方案中，通過磁攪拌棒27，能保持珠分開。然后膠原滴作為固化膠原珠22從溶液中分開。在這個實施方案中，珠大小是直徑大約20微米至大約2毫米范圍。圖20給出本發(fā)明的膠原珠的例示的顯微鏡視圖。
C.干膠片如圖16，17和18進一步所示，通過用針16將將一定體積的氧化膠原溶液13注射到交聯(lián)緩沖液14中也能形成片37，所述交聯(lián)緩沖液14任選地含有膠原線12在其上交聯(lián)并沉降的聚合物網(wǎng)狀物35。在根據(jù)該方法的一個實施方案中，能手工制備線12的連續(xù)或半連續(xù)單絲，并且在脫水之前壓縮到任何合適大小的三維體積中，從而形成干膠片37的另一個實施方案。圖19代表的顯微鏡視圖給出交聯(lián)膠原線形成的干膠片37的例子。
一旦形成，干膠片37(或者這里描述的其他微顆粒載體材料)能整合入另外的膠原膜(交聯(lián)或沒有交聯(lián)的膠原膜)。在一個實施方案中，通過將干膠片37放置到在固體載體例如培養(yǎng)皿中含有的膠原膜上，可將干膠片37整合入膠原膜。如圖9所示，在一個實施方案中，線12(線12干燥并且隨機壓縮在一個體積中之后，如圖7所示)整合入膜95，并且形成防止細胞遷移的細胞屏障。
在一些實施方案中，干膠片37有著適合細胞培養(yǎng)的最大大約50cm2的表面積。
D.微顆粒載體材料的其他形式在一個實施方案中，以圖8描述的方式能制備同質(zhì)膠原凝膠85，即通過在容器例如描述的容器86中溫育期望的載體材料(例如膠原)的溶液83。然而，在另一個實施方案中，從珠22或線12能制備海棉樣凝膠結(jié)構(gòu)。具體地說，珠22和/或線12能裝在一起形成凝膠結(jié)構(gòu)，包括珠22和/或線12和凝膠54，例如如圖5，6，7和8所示。
顆粒之間的間隙體積定義為凝膠結(jié)構(gòu)的孔隙率，其范圍一般是組裝的珠22和/或線12的總體積的30％至50％。在一個實施方案中，凝膠54是膠原。
在圖5中，微顆粒載體材料包括本發(fā)明的珠22，(盡管微顆粒載體材料還能包括線12和/或干膠片37)，其裝在容器52中。在一個實施方案中，珠22然后分散在膠原凝膠54中。
在圖6描述的實施方案中，微顆粒載體包括線12的單絲，其在線12交聯(lián)之前或之后裝在容器62中，以及，干燥之后，形成干燥的不溶性單絲。在一個實施方案中，本發(fā)明的線12在交聯(lián)之前或期間能裝入容器中，使得線12變得隨機裝入并且在容器72中相互連接，如圖7所示。
在另一個實施方案中，從一種或多種其他可再吸收材料能制備微顆粒載體材料(線12或珠22)。從下面的材料能制備這樣的微顆粒載體材料藻酸鹽，淀粉，透明質(zhì)酸(hyaluronan)，葡聚糖(參見VanWezel，A.L.1967，Nature 2166465)；纖維素(參見Reuveny，S.，等，1982，Dev.Biol.Stand.50115-123)；膠原(參見R.C.Dean等，1985，Large Scale Mammalian Cell Culture Technology.編者B.K.Lydersen，Hansen Publishers，New York，N.Y.，pp.145-167)；或明膠(參見Cultisphere，Technical Bulletin，Percell Biolytica AB)，只要符合合適的大小標準。其他相關(guān)的標準包括載體材料的孔隙率，載體材料的降解時間，以及載體材料是否交聯(lián)。在一個實施方案中，本發(fā)明的微顆粒載體材料包括與一種或多種其他可再吸收材料混合的膠原。此外，根據(jù)本發(fā)明，微顆粒載體材料可以是沒有交聯(lián)的或者使用本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的一種或多種交聯(lián)劑交聯(lián)的。合適的交聯(lián)劑包括戊二醛和類似產(chǎn)物。優(yōu)選地，微顆粒載體材料包括支持軟骨細胞附著微顆粒載體材料和/或在其上或其中生長的可生物降解材料，其隨著時間在接受移植入物的患者體內(nèi)被吸收。
本發(fā)明還包括將軟骨細胞加給如上所述的微顆粒載體材料的可植入組合物的制備方法。在這樣的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明制備珠，線或者珠和線的混合物。粘著性細胞有著與微顆粒載體材料的表面附著的天然傾向。然而，在另一個實施方案中，該方法進一步包括將粘合劑，例如下文描述的一種或多種粘合劑，和軟骨細胞和微顆粒載體材料混合。在其中使用粘合劑的實施方案中，(1)細胞與有在細胞之前施用給載體材料的一層粘合劑的載體材料粘連，(2)向不用粘合劑就與載體材料粘連的細胞施用一層或多層粘合劑，或者(3)粘合劑和細胞的混合物與載體材料粘著。本發(fā)明還可以使用自體的，和/或同種異體的軟骨細胞和/或異種軟骨細胞。
在一個實施方案中，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的方法能將微顆粒載體材料滅菌，一般通過β或γ輻射以及環(huán)氧乙烷擴散。
如這里使用的，本發(fā)明的可植入組合物包括附著細胞的微顆粒載體材料?？芍踩虢M合物任選地還包括合適的賦形劑和粘合劑，如這里描述的。
賦形劑在一些實施方案中發(fā)現(xiàn)，通過力，例如重力和范德瓦耳斯力，能使有與其附著的細胞的微顆粒載體材料分開的顆粒變得結(jié)合，從而在含有微顆粒載體材料和細胞(即可植入組合物)的容器底部形成沉積物。這種沉積物具有一定范圍的粘度，并且可以是可流動的或不可流動的，這取決于很多種因素。如這里使用的，可流動意思是移動或不破壞連續(xù)性的流暢運動，如以流體的特征方式。然而，在一些實施方案中，本發(fā)明能緩慢流動，例如當使用粘稠凝膠作為賦形劑時，如下文所述，并且范圍因此是自由流動至變硬。影響本發(fā)明流動性的因素包括1)微顆粒載體材料和細胞在密封容器中保留的時間，2)微顆粒載體材料各個顆粒的大小和形狀和3)在微顆粒載體材料和任何周圍材料上生長的細胞的量。
因此，經(jīng)常期望調(diào)節(jié)上文描述的組合物的流動性以有利于施用，例如通過注射對患者施用本發(fā)明的組合物。為了調(diào)節(jié)組合物的流動性，能直接混合賦形劑和可植入組合物。影響賦形劑的流動性從而影響可植入組合物的流動性的因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于密度和粘度。影響可流動性的其他因素包括本發(fā)明中使用的粘合劑和其他賦形劑或添加劑的化學物理性質(zhì)。在一些實施方案中，因為在缺陷中用膠將微顆粒載體材料固定，所以粘度還取決于測定的時間點，因此范圍跨越液體至固定化的。
合適的賦形劑包括任何生物相容(例如，有可以植入的軟骨細胞和任何組織)液體，懸浮液，凝膠或凝膠樣材料或微顆粒固體或半固體材料，特征在于對要治療的表面植入之前或之后，軟骨細胞保留在表面之上或之中的能力，保留一定時間使得軟骨細胞能在其中或其上附著和/或生長和/或增殖，并且提供與軟骨細胞的自然環(huán)境類似的系統(tǒng)以優(yōu)化細胞生長以及細胞分化(如果對使用的細胞的特定類型應用)。優(yōu)選地，微顆粒載體材料包括可生物降解材料，其支持軟骨細胞附著和生長，隨著時間在接受植入物的患者體內(nèi)被吸收。
粘合劑在一個實施方案中，可植入組合物進一步包括任何生物相容粘合劑。這樣的粘合劑包括膠原或血纖蛋白膠，生理膠，自體膠，半自體膠和非自體膠或凝膠。本發(fā)明的可植入組合物任選地進一步包括一種或多種粘合劑和/或賦形劑，例如凝膠，皮膚膠，手術(shù)膠和藻酸鹽。可使用的粘合劑的具體例子包括Tisseel VHTM血纖蛋白密封膠，從Baxter Healthcare Corporation 1627 Lake Cook Road，LC-IVDeerfield，IL 60015，美國獲得。商業(yè)上可購得合適的有機膠材料，例如Tisseel或Tissucol；(以血纖蛋白為基礎(chǔ)的粘合劑；ImmunoAG，奧地利)，粘著蛋白(Cat.#A-2707，Sigma Chemical，美國)，和Dow Corning Medical Adhesive B(Cat.#895-3，Dow Corning，美國)。
如上所述，生物相容粘合劑能直接與其上粘著性細胞的微顆粒載體材料混合，從而影響本發(fā)明的流動性，如下文更詳細地描述的?；蛘撸谝委煹谋砻媸┘右粚诱澈蟿?，接著是一層其上粘著性細胞的微顆粒載體材料。或者，在對要治療的表面施用一層其上粘著性細胞的微顆粒載體材料之后施用一層粘合劑。在其他實施方案中，混合之后分開地或者聯(lián)合地對要治療的表面施用生物相容粘合劑，細胞和微顆粒載體材料。
在其中粘合劑直接與本發(fā)明的可植入組合物結(jié)合的實施方案中，粘合劑還提供將本發(fā)明的流動性調(diào)節(jié)到適合軟骨細胞受體的特殊需要的好處。粘合劑以類似于上述賦形劑的方式影響本發(fā)明的流動性，這取決于粘合劑的特征，例如粘度和密度。
治療方法本發(fā)明提供了通過對要治療的表面植入組合物而有效治療關(guān)節(jié)表面軟骨的方法，首先將可植入組合物置于要治療的表面上并且允許軟骨細胞與表面附著并且在表面上增殖。細胞然后產(chǎn)生軟骨基質(zhì)，并且使軟骨基質(zhì)增殖和增加。在另一個實施方案中，該方法包括對要治療的表面覆蓋覆蓋貼的附加步驟，例如美國專利No.5,857,269中所述，該專利文獻全文在此引作參考。
在將可植入組合物置于要治療的表面上之前覆蓋貼可以部分地與要治療的表面附著，或者在將可植入組合物置于表面之后將覆蓋貼置于表面上。覆蓋貼蓋在修補位點上使得移植的軟骨細胞保持在那個部位，但是仍然能夠獲取營養(yǎng)。在一個實施方案中，覆蓋貼是帶有至少一層多孔表面的半滲透膠原基層。如果使用，覆蓋貼優(yōu)選是沒有細胞的，生理可吸收的，非抗原性膜樣材料。在本發(fā)明的一個實施方案中，覆蓋貼的多孔表面直接向著要治療的表面。此外，在一個實施方案中，覆蓋貼是薄片樣形式，具有相對平滑的一側(cè)和相對粗糙的多孔一側(cè)。在這個實施方案中，粗糙多孔側(cè)面一般朝向軟骨缺損并且促進軟骨細胞向內(nèi)生長，而平滑側(cè)一般背對軟骨缺損并且阻礙其中的組織向內(nèi)生長。在另一個實施方案中，覆蓋貼有相似孔隙率的兩個平滑面。
適合用作覆蓋貼的兩種材料包括Chondro-Gide或Bio-Gide，商業(yè)上可購得的I型/II型膠原膜(Ed.Geistlich Sohne，Wolhusen瑞士)。根據(jù)本發(fā)明能使用的附加材料是Chondro-Cell；一種商業(yè)上可購得的I型膠原基質(zhì)膜(Ed.Geistlich Sohne，瑞士)。
止血劑實施方案在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括止血劑產(chǎn)品與可植入組合物移植聯(lián)合應用，和，任選地，和覆蓋貼聯(lián)合應用。止血劑產(chǎn)品抑制血管組織的形成，例如在將軟骨細胞自體移植到軟骨缺損中的過程中，毛細血管循環(huán)突出到生成的軟骨中。這樣的產(chǎn)物有時用來修復其中缺損延伸到軟骨下層之中或之下的骨胳中軟骨缺損，有時稱作全厚度缺損。骨胳下血管組織的形成傾向于突出到要形成的新的軟骨中，導致不是期望的間充質(zhì)特化軟骨細胞的細胞外觀。血管形成引入的污染細胞可能有侵入到植入軟骨細胞形成的軟骨中并且過量生長的危險。
雖然本發(fā)明能和止血品或屏障聯(lián)合使用，但是發(fā)現(xiàn)，在其中粘合劑或賦形劑與本發(fā)明的可植入組合物例如上文描述的那些一起使用的某些實施方案中，粘合劑或賦形劑能發(fā)揮有效止血屏障的功能。然而，在另一個實施方案中，能使用任選的膜，例如上文描述的那些，來防止血液接觸可植入組合物。
能根據(jù)本發(fā)明使用的商售膜產(chǎn)品的一個類型是Surgicel(Ethicon Ltd.，英國)，其在7-14天之后可被吸收。這與這種特殊止血裝置例如Surgicel的正常使用相反，如來自EthiconLtd.的產(chǎn)品插頁中描述的。其他膜產(chǎn)品包括Chondro-Gide和Bio-Gide；如上所述。
為了抑制再血管化作用到軟骨中，能使用止血材料并且起著凝膠樣人工凝結(jié)物作用。如果關(guān)節(jié)軟骨的全厚度缺損中存在血紅細胞，該缺損通過這樣的止血屏障覆蓋，則這些血細胞化學變化成正鐵血紅素，因此不能誘導血管生長。因此，用作有或沒有血纖白粘合劑的再血管化抑制屏障的止血品，例如Surgicel，對于本發(fā)明教導的方法的一個實施方案中有效的。
通過關(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡檢查，小的關(guān)節(jié)切開術(shù)，或者開放性外科手術(shù)能實施根據(jù)本發(fā)明的植入操作。
可以理解的是，如美國專利申請No 09/320,246所述，通過在植入之前的手術(shù)操作能直接治療，稍微擴大或造型治療缺損或損傷，以適應可植入組合物，該篇專利文獻全文在這里引作參考。
培養(yǎng)方法值得注意的是，粘著性細胞11和21具有優(yōu)化的表面面積，其上用于粘著和增殖。如果珠22，干膠片37或線12的表面面積相對于細胞(例如細胞21或11)太大或太小，則細胞將不生長。這樣，微顆粒載體材料珠22或線12相對于細胞21和11的用于細胞21和11與珠22或線12附著并生長的最佳表面面積是必需的。應用直徑20微米至400微米的珠22或線12可以實現(xiàn)一般的最佳表面積。
舉例來說，下面分別詳細描述培養(yǎng)方法，軟骨細胞的附著和/或生長以及培養(yǎng)過程和/或軟骨細胞的附著和/或生長中使用的移植培養(yǎng)基，首先從用來治療收集的軟骨活組織檢查和用來根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)軟骨細胞的實驗室方法的描述開始。
實施例1-軟骨細胞收集和培養(yǎng)通過將2.5毫升慶大霉素(gentomycin)硫酸鹽(濃度70微摩爾/升)，4.0毫升兩性霉素(濃度2.2微摩爾/升；商品名Fungizone，一種從Squibb獲得的抗真菌劑)，15毫升1-抗壞血酸(300微摩爾/升)，100毫升胎牛血清(最終濃度20％)，和其余的DMEM/F12培養(yǎng)基混合在一起，產(chǎn)生大約400毫升的生長培養(yǎng)基，來制備用來在培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)移和/或處理軟骨活組織檢查和用來培養(yǎng)軟骨細胞的生長培養(yǎng)基(下文稱作″生長培養(yǎng)基″)。(相同的生長培養(yǎng)基還被用來將軟骨活組織從醫(yī)院轉(zhuǎn)移到實驗室，在那里提取和繁殖軟骨細胞)。
對于自體植入物，首先通過關(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡技術(shù)收集軟骨活組織，例如，從患者關(guān)節(jié)的非重量承受區(qū)收集，并且在含有20％胎牛血清的生長培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移到實驗室。然后使用酶，例如胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)，一種蛋白水解酶和結(jié)合試劑，處理軟骨活組織，從軟骨分離和提取軟骨細胞。然后在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)提取的軟骨細胞，從最初大約50,000個細胞的量至最終大約二千萬個或者更多軟骨細胞的量。
以大約3,000rpm將從患者獲得的血液離心，將血清和其他血液成分分開。保存分離的血清并且在培養(yǎng)過程和移植過程的后一階段中使用。
預先從患者收集的用于自體移植的軟骨活組織在如上所述的生長培養(yǎng)基中運送到實驗室培養(yǎng)。將生長培養(yǎng)基輕輕倒出以分離出軟骨活組織，并且在到達實驗室之后棄除。然后將軟骨活組織在普通DMEM/F12中洗滌至少三次，去除軟骨活組織上胎牛血清膜。
然后在其中加入了28毫升胰蛋白酶EDTA(濃度0.055)的包括上述生長培養(yǎng)基的組合物中洗滌軟骨活組織。在這個組合物中，將軟骨活組織在37℃和5％CO2下溫育5-10分鐘。溫育之后，軟骨活組織在生長培養(yǎng)基中洗滌2-3次，洗掉活組織的任何胰蛋白酶。然后對軟骨稱重。一般地，培養(yǎng)軟骨細胞要求的軟骨的最小量是大約80-100毫克。優(yōu)選較大的量，例如200至300毫克。稱重之后，將軟骨放在大約50毫升普通DMEM/F12培養(yǎng)基中2毫升膠原酶(濃度5000酶單位；消化酶)的混合物中，并且切碎讓酶部分消化軟骨。切碎之后，使用漏斗將切碎的軟骨轉(zhuǎn)移到瓶子中并且向瓶子中加入大約50毫升膠原酶和普通DMEM/F12混合物。然后將切碎的軟骨在37℃和5％CO2下溫育17-21小時。
在一個實施方案中，然后使用40μm篩孔將溫育的切碎的軟骨濾過，離心(以1054rpm，或200倍重力)10分鐘，并且用生長培養(yǎng)基洗滌兩次。然后對軟骨細胞計數(shù)確定它們的成活力，接著將軟骨細胞在生長培養(yǎng)基中在37℃和5％CO2下溫育至少兩周，其間生長培養(yǎng)基更換3-4次。
然后通過胰蛋白酶作用和離心來從生長培養(yǎng)基取出軟骨細胞，并且轉(zhuǎn)移給含有1.25毫升慶大霉素硫酸鹽(濃度70微摩爾/升)，2.0毫升兩性霉素(濃度2.2微摩爾/升；商品名Fungizone，一種從Squibb獲得的抗真菌劑)，7.5毫升1-抗壞血酸(300微摩爾/升)，25毫升自體血清(最終濃度10％)，其余的是DMEM/F12培養(yǎng)基的移植培養(yǎng)基，產(chǎn)生大約300毫升的移植培養(yǎng)基。
實施例2-可植入組合物將選擇的載體材料，例如生物相容的，可吸收珠，網(wǎng)或線混合到無菌培養(yǎng)皿中的移植培養(yǎng)基中，用移植培養(yǎng)基來″濕潤″載體材料，且在一個實施方案中，將載體材料接觸移植培養(yǎng)基1-10小時或更長時間。然后向載體材料移植培養(yǎng)基混合物加入軟骨細胞。移植培養(yǎng)基可以是含有HAM F12和15mM Hepes緩沖液和10至20％自體血清的20％最低基本培養(yǎng)基，全都保持在37℃下的CO2培養(yǎng)箱中。
然后讓軟骨細胞接觸載體材料并且在其上或其中生長一段時間，范圍是1小時至1周，并且在一個實施方案中，軟骨細胞保持在大約37℃的溫度下。優(yōu)選地，軟骨細胞與載體材料培養(yǎng)過夜。在一個實施方案中，輕輕攪拌軟骨細胞和培養(yǎng)基使得軟骨細胞粘著在載體材料的所有的面上并且在其上生長。
在另一個實施方案中，向軟骨細胞和載體材料培養(yǎng)基加入另外的載體材料，其間進行攪拌使軟骨細胞在新加入的載體材料上又附著并生長。在一些實施方案中，可以向培養(yǎng)物中加入10至40毫克之間的載體材料。在其他實施方案中，載體材料的添加可以重復1-20次。一旦培養(yǎng)期完成，這個階段能持續(xù)大約1天至大約6星期，則可以將含有在載體材料之上或之中附著的軟骨細胞的培養(yǎng)基，放到(例如通過注射)缺損部位。
在另一個實施方案中，在培養(yǎng)階段中，能將載體材料酶促溶解(使用，例如膠原酶)，從而釋放細胞。然后從培養(yǎng)基去除酶并且向細胞培養(yǎng)物中加入另外的載體材料。
在后面的步驟中加入的載體材料可以與在前載體材料的類型是一樣的或者可以是不同類型的。在一個實施方案中，將細胞從較小的載體材料(20微米)轉(zhuǎn)移給較大的載體材料(400微米)。在另一個實施方案中，將細胞從較大的載體材料轉(zhuǎn)移給較小的載體材料。在另一個實施方案中，將細胞從珠轉(zhuǎn)移給線給干膠片或者具有合適大小和表面積的其任何組合以有利于細胞生長。轉(zhuǎn)移步驟可以重復1-20次。
實施例3-可移植組合物在另一個實施方案中，懸浮于培養(yǎng)基的軟骨細胞可以直接加給載體材料，不用″預先濕潤″載體材料。在這種情況下，然后讓軟骨細胞在載體材料上附著并在其上或之中生長一段時間，范圍是大約1小時至大約6星期。優(yōu)選地，軟骨細胞與載體材料培養(yǎng)過夜。在一個實施方案中，輕輕攪拌軟骨細胞和培養(yǎng)基使得軟骨細胞粘著在載體材料的所有的面上并且在其上生長。
在另一個實施方案中，在培養(yǎng)期間加入另外的載體材料(和原始載體材料相同或不同的載體材料)以擴大細胞培養(yǎng)。在另一個實施方案中，首先通過使用酶例如胰蛋白酶破壞載體材料。然后，將表面積大于破壞的原始載體材料的另外的載體材料加給細胞培養(yǎng)基。在培養(yǎng)期間破壞載體材料的過程可以重復兩次或多次。
一旦培養(yǎng)期完成，則可以將含有附著在載體材料之上并在其中或之中生長的軟骨細胞的培養(yǎng)基，放到缺損部位。
實施例4-供選擇的載體材料試驗對不同的載體材料測試它們對細胞附著和生長提供支持的能力，以及細胞成活力。測試下面的載體材料從IMEDEX購得的戊二醛交聯(lián)的膠原線(還沒有商業(yè)出售)(在圖3和4中鑒定為″線+″)；沒有戊二醛交聯(lián)的膠原線(在圖3和4中鑒定為″線-″)，如上述公開的IMEDEX專利公開351,296 A1所述；沒有戊二醛交聯(lián)的膠原珠(在圖3和4中鑒定為″珠″)。Chondro-Gide膜(作為正對照)，CR-1，IMEDEX膜，和沒有膜(作為負對照)也作為比較載體材料進行了測試。
壓制膠原線形成圓的不規(guī)則形狀(例如球形線團)，概略地具有大約0.5厘米直徑。即使將線壓制成球形，但是這里仍稱為″線″。在無菌條件下對珠和兩種類型的線的樣品稱重并且放到12-孔板中。下面表1中給出這些樣品的重量，帶有各自實驗運行編號。
表1
材料然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，并且檢查洗滌溶液的pH，確定載體材料是否引起pH值的變化。向含有載體材料的各個孔和向空的孔加入培養(yǎng)基(DMEM+20％胎牛血清(FCS))(如圖3和4所示)。根據(jù)常規(guī)細胞培養(yǎng)技術(shù)制備軟骨細胞懸浮液，并且加給對照孔和含有載體材料的孔。軟骨細胞與載體材料在37℃下在CO2培養(yǎng)箱中溫育三天。三天之后，從孔中去除培養(yǎng)基并且用PBS洗滌載體材料。
接著向各個孔中加入酶溶液(0.25％的胰蛋白酶，5,000U/ml的膠原酶)，并且在37℃下溫育，以溶解載體材料。顯微鏡檢查各個樣品的溶解，一旦溶解，就將孔中的懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管中。然后用DMEM漂洗孔并且轉(zhuǎn)移到離心管中。懸浮液以200xg離心10分鐘，然后去除上清液。將殘留的沉淀物重新懸浮于0.50毫升的DMEM中并且計數(shù)細胞。
如表1所示，總共對珠進行12輪，對沒有戊二醛的線進行11輪，對有戊二醛的線進行9輪。然后對細胞數(shù)和成活力測定結(jié)果取平均值，并且在下文和圖3和4中給出。
結(jié)果表明，從沒有戊二醛交聯(lián)的線(″線-″)收獲的細胞的量最高，如圖3所示。珠上細胞量與負對照和正對照(Chondro-Gide膜)相等，戊二醛交聯(lián)的線(″線+″)和CR-1膜上細胞量小得多。另外，結(jié)果表明珠上，沒有戊二醛的交聯(lián)的線上和Chondro-Gide膜上生長的軟骨細胞的成活力和負對照軟骨細胞相等，如圖4所示。有戊二醛的交聯(lián)的線上和膜上生長的軟骨細胞的成活力還是比其他載體材料上生長的軟骨細胞的低，但是在所有的情況下，發(fā)現(xiàn)一些軟骨細胞滯留并生長。
更具體地，如圖3所示，從不同載體材料收獲的細胞量的不同是明顯的。從沒有戊二醛交聯(lián)的線(″線-″)上獲得細胞最大量。從珠和正對照和負對照實驗獲得大約相等的量。從其中有戊二醛的交聯(lián)的線(″線+″)或CR-1膜是載體的孔收獲的細胞數(shù)目較小。
圖4提供收獲細胞的成活力。沒有戊二醛交聯(lián)的線(″線-″)結(jié)果平均來說細胞具有94％的最大成活力。正對照和負對照實驗和珠顯示相似的結(jié)果，分別是92％，89％和92％細胞成活力。在兩種情況下，戊二醛的交聯(lián)的線(″線+″)或CR-1膜上收獲的細胞成活力減小到大約70％ 。
另外，為了測定線的大小的機械減小對細胞成活力的影響，機械減小戊二醛交聯(lián)的線的大小。在該項實驗中，從沒有機械減小的線收獲的細胞的平均成活力是65％，從機械減小的線收獲的細胞的平均成活力是78％。
這項比較研究證明了一般膠原珠和線形式的微顆粒載體材料，以及具體而言沒有戊二醛交聯(lián)的這樣的珠和線，支持軟骨細胞附著和生長的能力。膠原珠-軟骨細胞組合物和膠原線-軟骨細胞組合物，在各種情況下，含有適合軟骨細胞植入的可流動組合物。
實施例5-加入載體材料在使用膠原微珠的另一個實施例中，以上述方式制備每個珠具有大約0.3mm2表面積的40毫克微珠的三個樣品。向每個樣品加入十萬個軟骨細胞。樣品以上述方式在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天。向第一個樣品加入另外10毫克微珠。向第二個樣品加入20毫克微珠。向第三個樣品加入40毫克微珠。樣品在37℃下進一步培養(yǎng)四天。四天之后，向第一個樣品加入另外10毫克微珠。向第二個樣品加入20毫克微珠。向第三個樣品加入40毫克微珠。然后將樣品培養(yǎng)一天。
然后對細胞計數(shù)，第一個樣品得到157,500個細胞，成活力95％(圖21所示)，第二個樣品347,500個細胞，成活力98％(圖22所示)，第三個樣品325,000個細胞，成活力98％(圖23所示)。這個實施例表明載體材料上培養(yǎng)的細胞的成活力，和加入另外的載體材料之后細胞的增殖。
盡管參照具體實施方案公開了本發(fā)明，但顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員不脫離本發(fā)明的真實精神和范圍可以提出本發(fā)明的其他實施方案和變化方案。附加的權(quán)利要求書意在解釋為包括所有這樣的實施方案和等同改變。
權(quán)利要求
1.一種可流動的并且包含鄰近載體材料保留的軟骨細胞的可植入組合物。
2.權(quán)利要求1的可植入組合物，進一步包含粘合劑。
3.權(quán)利要求1的可植入組合物，其中所述載體材料是微顆粒固體或半固體材料。
4.權(quán)利要求1的可植入組合物，其中所述載體材料是可生物降解的。
5.權(quán)利要求4的可植入組合物，其中所述可生物降解材料是膠原。
6.權(quán)利要求5的可植入組合物，其中所述可生物降解材料是交聯(lián)膠原。
7.權(quán)利要求1的可植入組合物，其中所述軟骨細胞保留在所述載體材料之上。
8.權(quán)利要求1的可植入組合物，其中所述軟骨細胞保留在所述載體材料之中。
9.一種可植入組合物的制備方法，包括對載體材料添加軟骨細胞，所述載體材料的結(jié)構(gòu)使得軟骨細胞與之粘著；及形成所述軟骨細胞和所述載體材料的可流動混合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述形成步驟包括將粘合劑與所述軟骨細胞和所述載體材料混合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述方法進一步包括將所述軟骨細胞和所述載體材料暴露給有利于所述細胞與所述載體材料粘著的環(huán)境條件。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述載體材料是微顆粒固體或半固體材料。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述載體材料是可生物降解的。
14.權(quán)利要求13的可植入組合物，其中所述可生物降解材料是膠原。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所述軟骨細胞保留在所述載體材料之上。
16.權(quán)利要求9的方法，其中所述軟骨細胞保留在所述載體材料之中。
17.一種通過將權(quán)利要求1的可植入組合物注射到要治療的表面上而有效治療關(guān)節(jié)表面軟骨的方法，該方法包括下面的步驟(a)將所述可植入組合物放置在要治療的表面上；和(b)使所述軟骨細胞在所述表面上生長并形成軟骨。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有載體材料例如各種形式的膠原或藻酸鹽珠或線的可流動可植入組合物，其能支持軟骨細胞與其附著并生長，涉及含有載體材料和其上保留的軟骨細胞的可流動可植入組合物的制備方法。此外，本發(fā)明涉及通過移植包括載體材料和其上保留的軟骨細胞的可流動可植入組合物而有效治療關(guān)節(jié)表面軟骨的方法。
文檔編號C12N5/06GK1665458SQ03815508
公開日2005年9月7日 申請日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月1日
發(fā)明者B·M·加內(nèi)蒂, V·古奈特 申請人:維里根股份公司