專利名稱：發(fā)酵戊糖的發(fā)酵單胞菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及纖維素類物質向燃料和化學物質的生物轉化，特別涉及可將木糖、阿拉伯糖和甘露糖以及以上三種糖類發(fā)酵轉化為乙醇的運動發(fā)酵單胞菌菌株(Zymomonas mobilis)。
背景技術：
發(fā)酵技術對于可再生的生物纖維素類物質轉化為化學物質例如乙醇是非常有用的。典型的纖維素類物質包括35-45％的纖維素，30-40％的半纖維素和15％的木質素。水解成分含有葡萄糖聚合物，半纖維素的水解成分大部分是木糖。阿拉伯糖也是存在于生物材料例如switchgrass草和谷物纖維中的重要的可發(fā)酵底物。因此，在戊糖發(fā)酵中達到較高的特定產物的形成速率和轉化效率對于利用可再生物質工業(yè)化生產燃料和化學物質是至關重要的。
現(xiàn)有技術廣泛報道了運動發(fā)酵單胞菌在較低的pH、厭氧培養(yǎng)和含有抑制性化合物特別是與木質纖維素水解產物有關的抑制性化合物的培養(yǎng)基中，具有將葡萄糖底物快速、有效地轉化為乙醇的能力。然而利用運動發(fā)酵單胞菌最明顯的缺點是它不能發(fā)酵戊糖。為了克服這一缺點，現(xiàn)有技術使用可催化木糖和阿拉伯糖代謝的外源基因來構建重組運動發(fā)酵單胞菌菌株，它能發(fā)酵葡萄糖和木糖或阿拉伯糖的混合物或者上述三種糖的混合物。這些菌株和克隆載體都基于具有抗生素抗性標記的多拷貝質粒的使用。
美國專利No.5514583公開了一種轉化了外源基因的發(fā)酵木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株(CP4/pZB4和pZB5)，編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛酶和轉酮酶的質粒載體(pZB4和pZB5)，進一步包括被發(fā)酵單胞菌識別的至少一種啟動子(Pgap和Peno)，其可以調節(jié)至少一種所述基因的表達。該微生物能夠生長于以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，發(fā)酵木糖轉化為乙醇，最大理論產率88％。美國專利No.5712133和No.5726053公開了一種發(fā)酵阿拉伯糖的轉化運動發(fā)酵單胞菌(39676/pZB206)，含有編碼L-阿拉伯糖異構酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構酶、轉醛酶和轉酮酶的外源基因，上述酶可影響阿拉伯糖向乙醇轉化的發(fā)酵能力。此外，還描述了質粒載體(pZB206)以及利用轉化子發(fā)酵葡萄糖和阿拉伯糖底物的方法。美國專利No.5843760公開了一種發(fā)酵木糖和阿拉伯糖的轉化運動發(fā)酵單胞菌(206C/pZB301)，含有編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、L-阿拉伯糖異構酶、L-核酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構酶、轉醛酶和轉酮酶的外源基因，進一步包括被發(fā)酵單胞菌識別的至少一種啟動子，其可以調節(jié)至少一種所述基因的表達，所述微生物能夠生長于以阿拉伯糖或木糖為唯一碳源或者兩者結合作為碳源的培養(yǎng)基中，發(fā)酵阿拉伯糖和木糖轉化為乙醇。此外，還描述了轉化子結合質粒載體(pZB301，pZB401，pZB402，pZB403)使用的方法。雖然在控制條件的單一培養(yǎng)物中雜交質粒更容易保留在運動發(fā)酵單胞菌里，但當宿主生物生長于缺乏維持質粒的選擇壓力即存在抗生素時，雜交質粒開始變得不穩(wěn)定。例如，上面所述菌株的外源基因能夠穩(wěn)定的表達約四十代。當運動發(fā)酵單胞菌生長于混合培養(yǎng)物例如纖維素同時糖化發(fā)酵過程中，它將與其他微生物競爭，此時質粒的不穩(wěn)定性就會加劇。此外，對于工業(yè)應用例如乙醇的大規(guī)模生產而言，抗生素抗性標記是不受歡迎的。因此，最好能將克隆基因插入運動發(fā)酵單胞菌的基因組中，使其保持在一個較低的天然拷貝數水平，不會過表達，而且同基因組DNA一樣穩(wěn)定。
在大腸桿菌中，將外源基因插入基因組的經典方法是使用在溶原狀態(tài)下能夠穩(wěn)定存在的噬菌體載體?；虻牟迦胍部梢酝ㄟ^同源重組，如果基因能夠克隆到轉座子允許的位點，也可以通過轉座來實現(xiàn)。雖然已經證實在運動發(fā)酵單胞菌中存在轉座(Pappas，K.M.，et al.，(1997)Journal of Aoolied Microbiology，82379-388)，但僅限于隨機輔源營養(yǎng)的小Mm或者Tn5的多轉座或者用于基因分析的抗生素抗性表型。據報道，通過Tn5衍生物插入的基因僅能穩(wěn)定5-15代(Pappsa，K.M.，et seq.P.383，F(xiàn)IG.1.)。而且，在運動發(fā)酵單胞菌中通過同源重組來實現(xiàn)定點插入并未被證實，從發(fā)酵單胞菌中沒有分離到噬菌體。
轉座子Tn5和Tn10是本領域所熟知的，廣泛用于誘變和各種革蘭氏陰性菌的克隆DNA的插入，Herrero，M.，等人(1990)(J.Bacteriol.1726557-6567)描述了結合兩套質粒將外源基因克隆并穩(wěn)定插入革蘭氏陰性真細菌染色體中的過程，(i)Tn10和Tn5的轉座特性，(ii)對某些化合物的抗性，(iii)基于R6K的質粒pGP704自殺傳遞性質。最終構建物含有Tn10或者Tn5反向重復序列內的NotI或者SfiI位點。借助于兩個附加的特定克隆質粒pUC18Not和pUC18Sfi，這些位點用于克隆DNA片段。新衍生的構建物只保留在受體宿主菌株中并產生R6K特異p蛋白，其是R6K及其衍生的質粒的基本復制蛋白。含有雜交轉座子的受體質粒與染色體整合RP4轉化入特定溶原性大腸桿菌例如E.coil Sm10(lpir)中，所述染色體整合RP4提供了廣泛的宿主范圍接合轉移功能。通過與目標菌株接合，受體質粒轉移到選擇的宿主細菌中。位于轉座子外部的質粒編碼的關聯(lián)轉座酶介導雜交轉座子從傳遞自殺質粒到目標復制子的轉座。由于轉座酶的功能在目標細胞中不能保持，這些細胞對進一步的轉座免疫。在同一菌株的多次插入因此僅受明顯選擇標記的限制。
Herrero，M.，等人(1990)(Journal of.Bacteriol.172(11)6568-6572)描述了Tn5衍生的小轉座子例如Tn5Tc集合體的構建。有可能利用Tn5衍生的小轉座子例如Tn5Tc結合外源DNA片段進入各類革蘭氏陰性菌的基因組中。小轉座子由對卡那霉素有特異抗性的基因、作為選擇標記的四環(huán)素和側接了Tn5末端重復序列19個堿基對的NotI克隆位點組成。轉座子定位在基于R6K的自殺傳遞質粒上，該質粒提供了IS50R轉座酶tnp基因但位于轉移元件的外部，其向受體的接合轉移由受體中的RP4轉移功能介導。由于不存在轉座酶介導的次級轉座、缺失和倒置，這些元件產生的插入通常更加穩(wěn)定。也可參見Berg et al.，(1989)Transposable elements and the genetic engineering of bacteria，p.p.879-926，in D.E.Berg，Mobile DNA，American Society ofMicrobiology，Washington，DC.通過這種方法，衍生自Tn10的元件也能獲得穩(wěn)定的插入。Way，J.C.et al.，(1984)(Gene 32369-379)。
Herrero等seq.，p.6569描述了小Tn5Tc的結構，其用于誘變插入或者作為轉座子載體用于側接了NotI位點的DNA片段的克隆(克隆DNA片段首先進入pUC18衍生物pUC18Not和pUC18Not分離)。使用標準的重組DNA技術體外構建小Tn5Tc元件(Maniatis，T.，et al.，(1989)Molecular cloninga laboratorymanual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。質粒的EcoRI片段將它們作為插入子忍受時，就可確定其四環(huán)素抗性(Fellay，R.，et al.(1987)Interposon mutagensesis of soiland wate bacteriaa family of DNA fragments designed for in vitroinertion mutagenesis of Gram-negative bacteria.Gene 52147-154)。片段克隆到pUC18Sfi單一的EcoRI位點上，作為SfiI片段被切除，并插入到pUT里Tn5末端的19個堿基對之間，從而在任何情況下轉移單元都會作為轉移質粒XbaI-EcoRI部分存在。最終元件是小Tn5Tc。
基于Tn10的轉座子載體傳遞系統(tǒng)描述于Herrero，M.et seq.1726557-6567，IRP167的衍生物噬菌體1攜帶有5.1kb的含有小Tn10Km元件的EcoRI插入片段，IS10R的轉座酶基因定位于移動元件反向重復序列的外側和PTac啟動子的下游。為了獲得可獨立于宿主調節(jié)其轉座的轉座子轉移質粒，EcoRI插入片段與pBOR8連接，它衍生于pGP704，含有來源于質粒pMJR1560的laclq基因。這一質粒由于缺乏pir基因的R6K特異性p蛋白產物，因此不能在宿主菌株內復制。pGP704含有RP4質粒的接合轉移來源(oriT序列)，所以當被賦予移動功能時，就可以轉移到革蘭氏陰性菌中。含有小Tn10的起始卡那霉素抗性基因的起始特異性p蛋白產物的MiuI片段在反向重復序列內，并被含有SfiI-Pttz組件的片段取代，通過加入NotI位點和MluI結合體使之被適當修飾，產生pLODPtt。這一構建體在小Tn10的反向重復序列之間具有SfiI，NotI和XbaI克隆位點。pLODPtt的Ptt抗性標記(Ptt’)轉變?yōu)榭敲顾乜剐砸陨少|粒pLOFKm。
為了形成含有戊糖發(fā)酵生產乙醇所必需的遺傳成分的遺傳穩(wěn)定菌株，需要對運動發(fā)酵單胞菌進行遺傳操作，然而這一操作仍然存在困難，使發(fā)酵單胞菌能夠利用戊糖的遺傳成分編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛酶和轉酮酶。
由于上述原因，需要構建穩(wěn)定的重組運動發(fā)酵單胞菌菌株，其能夠發(fā)酵戊糖例如木糖和阿拉伯糖或者二者從而生成乙醇。因此，需要編碼戊糖代謝的酶的基因的穩(wěn)定插入。同時還需要穩(wěn)定的工業(yè)運動發(fā)酵單胞菌菌株，這類菌株具有抗生素抗性，在非選擇性培養(yǎng)基中至少穩(wěn)定40代以上。有價值的工業(yè)菌株最好還具有較高的接近與最大理論值的產物生成速率?，F(xiàn)有技術中乙醇的微生物生產所存在的缺陷在本發(fā)明中得以克服。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一種制備含有編碼利用和發(fā)酵戊糖所需酶的外源結構基因的穩(wěn)定的發(fā)酵單胞菌整合體的方法。在一些實施例中，這些酶選自由xylAB、tal/tkt和araBAD組成的組。在另一些實施例的構建體中，至少包括一種調節(jié)基因以誘導結構基因進入運動發(fā)酵單胞菌的基因組中。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種改進的運動發(fā)酵單胞菌菌株，它能夠穩(wěn)定的表達編碼在非選擇培養(yǎng)基(即缺乏抗生素或抗生素抗性標記)中利用戊糖所必需的酶的結構基因。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種改進的染色體或天然質粒修飾的運動發(fā)酵單胞菌菌株，它能穩(wěn)定的表達結構基因，快速生成特定產物并具有較高的轉化效率。本發(fā)明的穩(wěn)定的發(fā)酵單胞菌整合體在80到160代以后仍然具有穩(wěn)定性。在另一實施中，本發(fā)明提供一種改進的用于纖維素水解產物反應混合物的生物催化劑。這些生物催化劑是重組的發(fā)酵單胞菌，其構成本發(fā)明的部分內容。
本發(fā)明還提供一種對外源基因穩(wěn)定插入細菌基因組非常有用的轉座子。在一個實施例中，轉座子包括至少一個具有編碼酶的結構基因的操縱子，所述酶選自由xylAB、araBAD和tal/tkt組成的組；至少一個用于在細菌中表達結構基因的啟動子；一對反向插入序列；操縱子包含在插入序列內，轉座酶基因位于插入序列的外側。在另一方面，本發(fā)明提供一種能夠使戊糖發(fā)酵酶編碼基因轉化到發(fā)酵單胞菌基因組的質粒穿梭載體。在一些實施例中，質粒穿梭載體包括至少一個具有編碼酶的結構基因的操縱子，所述酶選自由xylAB、araBAD和tal/tkt組成的組；至少一個用于在細菌中表達結構基因的啟動子；與被轉化的細菌基因組基因具有同源性的至少兩段DNA片段。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了整合至少兩個含有戊糖發(fā)酵酶編碼基因的操縱子的方法。在一個實施例中，這兩個操縱子是PgapxylAB和Penotaltkt或者Pgaptaltkt。在本發(fā)明的另一個實施例中，運動發(fā)酵單胞菌ATCC31821菌株的復合限制系統(tǒng)可以用來生成穩(wěn)定的戊糖發(fā)酵菌株。在另一個實施例中，轉座子和穿梭質粒用來構建改進的穩(wěn)定的能夠發(fā)酵含有戊糖的底物從而生成乙醇的運動發(fā)酵單胞菌。此外，還提供了一種使用在非選擇性培養(yǎng)基中穩(wěn)定表達的遺傳修飾的發(fā)酵單胞菌來將來源于纖維素的戊糖轉化為燃料和化學物質的方法。
本發(fā)明的一方面特別提供了一種使用遺傳修飾的發(fā)酵單胞菌由戊糖生產乙醇的方法。
在一個實施例中，該方法包括制備整合的發(fā)酵單胞菌菌株，其穩(wěn)定的插入了編碼至少四種戊糖發(fā)酵酶即木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛酶和轉酮酶的基因，所述整合包括至少兩步整合，第一步為同源重組，第一操縱子結合第一和第二戊糖發(fā)酵酶的編碼基因，第二步為轉座，第二操縱子結合第三和第四戊糖發(fā)酵酶的編碼基因，把整合的發(fā)酵單胞菌菌株加入到含有戊糖的原料中，通過發(fā)酵戊糖從而獲得含有乙醇的混合物。
在一些實施例中，戊糖包括木糖、阿拉伯糖或者兩者的混合物。因此，在一些實施例中，戊糖進一步被描述為來源于生物量。方法的一個特別方面在于使用了運動發(fā)酵單胞菌菌株(Z.Mobilis)ATCC31821。本發(fā)明的整合運動發(fā)酵單胞菌菌株被定義為整合的運動發(fā)酵單胞菌ATCC31821 Penotaltkt/PgapxylAB。在實施例中，特定的整合菌株被稱作int2/321，int2/1821，x9t(enott)Pi#4，x9t(enott)Pi#8，321(5)，481，2032，2122，8b和321-a。
在一些實施例中，本發(fā)明提供了在相對高濃度的醋酸鹽或者醋酸的存在下，能夠發(fā)酵戊糖(木糖，阿拉伯糖)生成乙醇的整合的發(fā)酵單胞菌及其衍生物。在實施例中，本發(fā)明提供了在醋酸鹽或者醋酸濃度為2g/L、4g/L、8g/L、10g/L、12g/L甚至高達16g/L時能夠生產乙醇的整合的菌株。
本發(fā)明的另一個實施例提供了能夠發(fā)酵戊糖原料生成乙醇的整合的發(fā)酵單胞菌。這些整合菌株的具體例子是int2/321，int2/1821，x9t(enott)Pi#4，x9t(enott)Pi#8，321(5)，481，2032，2122，8b和321-a。
在另一個實施例中，構建了攜帶有利用甘露糖的基因(manA)的載體并將載體轉化運動發(fā)酵單胞菌ATCC31821和39676，從而得到發(fā)酵甘露糖的發(fā)酵單胞菌菌株。同樣的轉化方法用于本發(fā)明的整合的菌株，以產生能夠發(fā)酵生物物質中的木糖和甘露糖或者木糖、阿拉伯糖和甘露糖的發(fā)酵單胞菌菌株。
在另一個實施例中，利用甘露糖的基因(manA)和利用甘露糖所需的任何其他基因被整合入運動發(fā)酵單胞菌ATCC31821和39676及其衍生物和所述的各種整合菌株的基因組中，產生能夠發(fā)酵生物物質中木糖和甘露糖或者木糖、阿拉伯糖和甘露糖的整合菌株。
本發(fā)明的其他優(yōu)點將在下面部分作進一步描述，通過描述和實施本發(fā)明，其優(yōu)點是顯而易見的。通過所附的權利要求中所描述的方法，將能夠理解并達到本發(fā)明的優(yōu)點。
附圖的簡要說明附圖與說明書結合在一起構成說明書的一部分，其描述了發(fā)明的至少一個實施例，與說明書一起闡述了發(fā)明的實質。


圖1是根據本發(fā)明的pGP704中的小Tn5的質粒圖譜，其含有木糖同化酶操縱子。
圖2是根據本發(fā)明的小Tn5系列構建物的質粒圖譜。
圖3描述了形成pUCtaltktSfi質粒圖譜的一系列構建。
圖4是tal/tkt-xylAxylB運動發(fā)酵單胞菌轉接合子與Tal探針Southern雜交分析的結果。C是控制質粒Tn5 tal/tkt-xylAxylB。λ/H是DNA大小標記。
圖5是tal/tkt-xylAxylB運動發(fā)酵單胞菌轉接合子與Tnp探針Southern雜交分析的結果。C是控制質粒小Tn5 tal/tkt-xylAxylB。λ/H是DNA大小標記。
圖6是根據本發(fā)明的穩(wěn)定的發(fā)酵木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株的幾種分離物的酶活性的示意圖。
圖7是圖6的四種分離物(nos.21，22，5和11)的發(fā)酵曲線示意圖，并與包含質粒菌株39673/pZB4和BC1/pZB4L進行比較。
圖8描述了根據本發(fā)明的穩(wěn)定的發(fā)酵木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株C25和D92的穩(wěn)定性。圖表以乙醇的產率和木糖利用參數為指標，表明了包含質粒菌株和基因組整合的木糖發(fā)酵菌株的穩(wěn)定性。本發(fā)明的菌株C25和D92在90代以后仍然保持穩(wěn)定。發(fā)酵培養(yǎng)基包括含有1葡萄糖和5％木糖的RM，溫度恒定為30℃。
圖9描述了生物量濃度(a)、乙醇濃度(b)，木糖利用率(c)，根據本發(fā)明的基因組整合的木糖發(fā)酵菌株C25和D92在含有4.5％葡萄糖和％木糖的RM培養(yǎng)基中間歇發(fā)酵的產率和％木糖利用結果的比較，發(fā)酵條件是pH5.0和pH5.5，溫度30℃。
圖10是整合質粒pZB1862-ldh-ara的圖譜。araBAD插入到ldhL的NotI位點從而切斷l(xiāng)dh。構建是以運動發(fā)酵單胞菌的復制質粒pZB1862為基礎的。
圖11是Tn10G的質粒圖譜。IS10R是轉座酶基因。IR是轉座子的反向重復序列。AraBAD被插入到兩段反向重復序列之間的NotI位點。
圖12顯示了通過同源重組得到的基因組整合的發(fā)酵木糖/阿拉伯糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株與DIG-ara和DIG-ldh探針Southern雜交分析的結果。AX1，13，23，101，104和107是araBAD整合體。C25是對照宿主。PZB1862-ldhL-ara是分離自DH5α的對照質粒。λ/H是分子量標記23，9.4，6.6，4.3，2.3和2.0kb。
圖13代表了通過轉座子整合得到的基因組整合的發(fā)酵木糖/阿拉伯糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株與DIG-tnp和DIG-ara探針Southern雜交分析的結果。G5，6，11，15，17，14和19是araBAD整合體。C25是對照宿主。Tn10G是對照質粒。λ/H是分子量標記23，9.4，6.6，4.3，2.3和2.0kb。圖13(a)是tnp探針和PstI消化，圖13(b)是ara探針和PstI消化。
圖14代表了基因組整合菌株的轉酮酶、轉醛酶、木糖異構酶和木酮糖激酶的酶活性的條線圖。206C/pZB301是對照質粒。206C是對照宿主。C25是木糖發(fā)酵整合體。G8是源自Tn10轉座的木糖/阿拉伯糖發(fā)酵整合體。AX1和AX101是源自同源重組的木糖/阿拉伯糖發(fā)酵整合體。
圖15代表了基因組整合菌株的L-阿拉伯糖異構酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構酶的酶活性的條線圖。206C/pZB301是對照質粒。206C是對照宿主。C25是木糖發(fā)酵整合體。G8是源自Tn10轉座的木糖/阿拉伯糖發(fā)酵整合體。AX1和AX101是源自同源重組的木糖/阿拉伯糖發(fā)酵整合體。
圖16代表了基因組整合的發(fā)酵木糖和阿拉伯糖的發(fā)酵單胞菌菌株在RMGXA(1∶2∶2％)上乙醇產率的條線圖，發(fā)酵條件是30℃，不控制pH。這些菌株在不同的代數時從培養(yǎng)物中接種到非選擇性培養(yǎng)基上。
圖17代表了基因組整合的發(fā)酵木糖和阿拉伯糖的發(fā)酵單胞菌菌株在30℃、控制pH下在含有1％葡萄糖，2％木糖和2％阿拉伯糖的RM上木糖和阿拉伯糖利用結果的條線圖。這些菌株在不同的代數時從培養(yǎng)物中接種到非選擇性培養(yǎng)基上。
圖18代表了基因組整合的發(fā)酵木糖和阿拉伯糖的發(fā)酵單胞菌菌株在30℃、pH5.5時在含有4％葡萄糖，4％木糖和2％阿拉伯糖的RM上發(fā)酵能力的折線圖。
圖19是用于同源重組到運動發(fā)酵單胞菌菌株31821的pZB510XTc(19A)和pZB512XTc(19B)的質粒圖譜。
圖20是用于整合轉座到運動發(fā)酵單胞菌菌株31821的pMODPenotaltktCm的質粒圖譜。
圖21A和B代表了運動發(fā)酵單胞菌31821整合體的Southern雜交印跡。實驗中使用探針xylB(21A)和tkt(21B)。對照質粒包括pMODPenotaltktCmpZB510XTc和pZB512XTc，并注明了int2/321中的PgapxylAB來自pZB512XTc。int2/1821中的PgapxylAB來自pZB510XTc。λ/H作為分子量標記。
圖22代表了x9t(inott)Pi#4、x9t(inott)Pi#8、int2/321和int2/1821以及對照菌株酶活性的條線圖。
圖23代表了x9t(inott)Pi#4、x9t(inott)Pi#8、int2/321和int2/1821在RMX培養(yǎng)基中生長適應的折線圖。
圖24是用于整合轉座到運動發(fā)酵單胞菌菌株31821的pMODPgaptaltktCm的質粒圖譜。
圖25代表了#20和#21在RMX培養(yǎng)基中生長適應的折線圖。
圖26A和B代表了運動發(fā)酵單胞菌31821整合體的Southern雜交印跡。實驗中使用探針xylB(26A)和tkt(26B)。對照質粒包括pMODPenotaltktCm、pMODPgaptaltktCm和pZB512XTc，并注明了321(5)中的PgapxylAB來自pZB512XTc。λ/H作為分子量標記。
圖27A到C描述了發(fā)酵單胞菌整合體在RMGX中的木糖(27A)和葡萄糖(27B)的利用以及乙醇產量(27C)。
圖28A和B描述了發(fā)酵單胞菌整合體在RMX中的木糖(28A)的利用以及乙醇產量(28B)。
圖29A到C描述了發(fā)酵單胞菌整合體在RMGX(1％∶6％)中的控制pH發(fā)酵的葡萄糖(29A)和木糖(29B)的利用以及乙醇產量(29C)。
圖30A到C描述了發(fā)酵單胞菌整合體在RMGX(3.5％∶3.5％)中的控制pH發(fā)酵的葡萄糖(30A)和木糖(30B)的利用以及乙醇產量(30C)。
圖31描述了穩(wěn)定性測試實驗。
圖32A和B代表了根據本發(fā)明的穩(wěn)定的發(fā)酵木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株2032、8b、481和2/321-2的穩(wěn)定性的條線圖。圖中用木糖的利用率(32A)和乙醇產率(32B)來表示基因組整合的發(fā)酵木糖菌株的穩(wěn)定性。本發(fā)明的菌株2032、8b、481和2/321-2在80代以后仍然保持穩(wěn)定。發(fā)酵培養(yǎng)基包含2％葡萄糖和2％木糖的RM并且溫度恒定為30℃。
圖33A和B代表了根據本發(fā)明的穩(wěn)定的發(fā)酵木糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株8b、2032、481和包含質粒菌株(31821/pZB5)的穩(wěn)定性的條線圖。圖中用木糖的利用率(33A)和乙醇產率(33B)來表示基因組整合的發(fā)酵木糖菌株的穩(wěn)定性。本發(fā)明的菌株2032、8b和481在80代以后仍然保持穩(wěn)定。發(fā)酵培養(yǎng)基包含2％葡萄糖和2％木糖的RM并且溫度恒定為30℃。
圖34A到F描述了在pH為5.0、5.5和6.0且存在醋酸鹽的情況下，葡萄糖利用(34A)、木糖利用(34B)、阿拉伯糖利用(34C)、生長(34D)、乙醇產量(34E)和乙醇產率(34F)的曲線。
圖35A和B描述了從葡萄糖和木糖連續(xù)恒定的生成乙醇(35A)，和在醋酸鹽濃度提高時副產物的形成(35B)。
圖36A和B是在醋酸鹽濃度為0、2、4和6g/L時木糖利用(36A)和乙醇產率(36B)的條線圖。
圖37A和B是在醋酸鹽濃度為0、8、12和16g/L時木糖利用(37A)和乙醇產率(37B)的條線圖。
圖38是含有甘露糖利用基因的pZB701的質粒圖譜。
圖39A和B是#2、4、6、13和19在RMM培養(yǎng)基中的生長適應圖。
發(fā)明的最佳實施方式除非特別說明，這里所使用的技術術語或者科學術語與本領域技術人員所公知的具有相同的含義。盡管任何與這里描述的類似的或者等同的方法和材料都可以用于本發(fā)明的實施和檢驗，但這里描述了較佳的方法和材料。所有提及到的美國專利都作為參考并收入本篇。
為了獲得能夠利用戊糖的遺傳穩(wěn)定的運動發(fā)酵單胞菌ATCC31821，使用兩種整合方法，包括同源重組和轉座。構建兩個操縱子PgapxylAB和Penotaltkt(或者Pgaptaltkt)，每個都可以作為單一組件進行整合。優(yōu)選的，每個操縱子都含有用于篩選整合體的抗生素抗性基因。
對于同源重組，PgapxylAB操縱子整合入菌株31821的ldh使用了4kb的DNA片段，其具有1kb的ldh區(qū)域并側接了pgm和adhI基因。這一同源DNA片段被稱作ldhL4。以31821DNA為模板，使用Pfu聚合酶，將片段ldhL4擴增為兩個DNA片段(5’ldhLR和3’idhL4)，通過載體pZB1861的克隆進行重排。在PCR反應中引入NotI和SfiI位點，用于接下來的PgapxylAB和Tcr的克隆(見下面的實施例)。根據運動發(fā)酵單胞菌CP4的DNA序列設計引物(Yamano et al(1993)J.Bact.1753926-3933)。
對于轉座，發(fā)現(xiàn)菌株31821具有一種限制系統(tǒng)，其可以降解導入宿主細胞中的甲基化的DNA。使用MiniTn5Tc via E.coli.Sm10(λpir)作為供體宿主的轉座是不成功的。因此，Penotaltkt或者Pgaptaltkt操作子的整合是通過使用EZ∷TNTM插入試劑盒(Epicentre，Wisconsin)實現(xiàn)的，該試劑盒提供了高效的轉座酶(基于Tn5)和攜帶有遺傳改進的插入序列(Mosaic末端)的載體(pMOD)。使用該試劑盒，用轉座子(轉座酶束縛的Penotaltkt或者Pgaptaltkt)對宿主細胞進行轉化，在這里，通過甲基化缺陷型宿主或者整合了Penotaltkt的天然運動發(fā)酵單胞菌31821質粒來制備DNA。
雖然下面的描述和實施例是關于兩個操縱子整合到運動發(fā)酵單胞菌的基因組中的，但本發(fā)明的方法可以經過適當修飾從而用于四種戊糖利用基因中的每一種基因在其啟動子控制下的整合。此外，任意數目的啟動子都可用于本發(fā)明中進行目標基因的表達，只要該啟動子能夠使利用木糖的基因在運動發(fā)酵單胞菌中直接表達。
下面將對本發(fā)明的優(yōu)選實施例作詳細的描述，同時以附圖作必要的說明，在下面描述的實施例中，“包含質粒菌株”與相關領域已審美國專利中所描述的菌株和載體相同或者相關。“運動發(fā)酵單胞菌基因組或基因”是指所有已經在給定運動發(fā)酵單胞菌中表達或者具有潛在表達可能性的基因。
實施例菌株，質粒和培養(yǎng)基大腸桿菌E.coli菌株C118λ(pir)，CC118(pir)(mini-tn5Tc)，SM/0λ(pir)和含有小轉座子Tn5和Tn10的質粒pUC19，pLOF/Km，pUC18sfi，pUT/Tc和pUC18由K.Timmis博士(GBF-GesellschaftFur Biotechnoloische Forschung mbH，Mascheroder weg 1D-38124Braunschweig，聯(lián)邦德國)惠贈。E.coliDH5α(生命技術)作為構建質粒的宿主。E.coliSM10λpir在接合試驗中作為供體菌株使用。運動發(fā)酵單胞菌菌株ATCC39676及其變異株206C(美國專利No.5843760)在本發(fā)明中作為受體使用。構建基于Tn10的質粒并包含在E.coliCC118中。整合質粒在轉化運動發(fā)酵單胞菌ATCC31821宿主或其變異株5C之前，先轉化甲基化缺陷型E.coli宿主例如JM110和DM1，整合質粒是通過消除質粒31821/Pzb5得到的。在LB培養(yǎng)基中于37℃條件下振蕩(200rpm)培養(yǎng)E.coli。除非特別說明，運動發(fā)酵單胞菌菌株保存于RM(10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO4)中并添加20g/L葡萄糖、D-木糖或者L-阿拉伯糖。所有包含質粒的菌株都生長于適當抗生素存在的條件下，例如四環(huán)素(Tc)，對于運動發(fā)酵單胞菌和E.coli來說，在液體培養(yǎng)基中的濃度為10ug/ml，在瓊脂培養(yǎng)基中，對于運動發(fā)酵單胞菌是20ug/ml，對于E.coli是10ug/ml。氨芐青霉素(Ap)，對于E.coli是100ug/ml。氯霉素(Cm)，對于運動發(fā)酵單胞菌是120ug/ml，對于E.coli是100ug/ml。為了再生和篩選運動發(fā)酵單胞菌轉化體或者轉接合子，使用接合平板(MMG或者MMX；10g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，2.5g/L(NH4)2SO4，0.2g/L K2HPO4和50g/L糖)并添加四環(huán)素或萘啶酮酸(20ug/ml)。所有的瓊脂平板都用15g/L瓊脂來制備。
在一些實施例中，含有所有四種基因(xylA，xylB，tal和tkt)的整合體生長于木糖培養(yǎng)基中。整合體從RMGTcCm轉移到RMX(1∶50)，并于30℃條件下進行培養(yǎng)。為了適應RMX，在木糖培養(yǎng)基中生長的培養(yǎng)物在達到指數生長期時即轉移到新鮮的RMX中。生長情況通常是由Spectronic 601(Milton Roy)的OD600測量來監(jiān)控的。
通過將含有PpdcmanA的DNA片段克隆至穿梭載體pZB188來構建質粒pZB701。用PCR對Ppdc和ManA結構基因分別進行擴增，然后通過第三次PCR(重疊延伸PCR)結合在一起，從而使PDC基因的包括RBS啟動子的5’轉錄和翻譯調節(jié)區(qū)域和起始密碼子與manA結構基因精確的融合。
重組DNA技術質粒DNA分離、限制性內切酶消化、連接和轉化、瓊脂糖凝膠電泳和其他的重組DNA技術的操作參見公開出版物Sambrook等人，(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，Cold Spring Harbor laboratory press，Cold Spring Harbor，NY，或者各類試劑產品的說明書，這是本領域所熟知的。細胞重懸浮在250ml的50mM Tris-50mM EDTA緩沖液中過夜，從三毫升的懸浮細胞中提取運動發(fā)酵單胞菌的基因組DNA。在37℃下100ml的5％SDS溶液中用溶酶體處理細胞30分鐘，然后加入RNA酶(終濃度等于20ng/ml)再培養(yǎng)30分鐘。酚-三氯甲烷提取操作兩次，以除去蛋白。乙醇沉淀回收基因組DNA?？蛇x擇的，也可使用Pruegen試劑盒(GentraSystem，MN)提取運動發(fā)酵單胞菌基因組總DNA，利用Qiaprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen，CA)提取質粒DNA。
接合，轉座和轉化采用過濾接合技術(Conway等，1987)將質粒從供體菌株E.coliSM10λpir或者S17-1轉移到運動發(fā)酵單胞菌中。
在一些實施例中，使用商品試劑盒EZ∷TNTM插入試劑盒來生成用于轉座的轉座子。根據生產說明書的內容并稍作變化用轉座酶處理質粒pMODPenotaltktCm。對于體外轉座，在運動發(fā)酵單胞菌31821天然質粒(目標DNA)存在的情況下，用轉座酶在37℃下處理整合質粒2小時。在轉化到運動發(fā)酵單胞菌31821之前，反應在0.1％SDS和反滲析5％甘油以及5mMTris(pH7.6)中加熱至70℃并維持10分鐘。對于體內轉座，用轉座酶在室溫下處理整合質粒1小時隨即進行電穿孔(Bio-Rad基因脈沖發(fā)生器，0.1cm間隙容器，1.6kY，200ohms，25μFD)。在OD600＝0.4-0.6時收集細胞從而制備電感受態(tài)運動發(fā)酵單胞菌或者大腸桿菌細胞。用冰預冷的無菌水清洗細胞一次隨即用10％甘油處理，并濃縮至約1000倍。將細胞等分并保存于-80℃下。
也可根據Zhang等人，(1995)Science 267240-243所描述的電穿孔的方法將質粒DNAs轉化到運動發(fā)酵單胞菌39676或大腸桿菌細胞中。
Southern印跡分析采用Stratagene Posi印跡壓力吸紙將DNA轉移到尼龍膜上。通過聚合酶鏈反應(PCR)對DNA探針Tc，xylB，Tnp和Tal進行地高辛-UTP標記。用于DNA標記的引物如下所示Tc5’-TTGCTAACGCAGTCAGGC-3’(SEQ ID NO1)5’-GAATCCGTTAGCGAGGTG-3’(SEQ ID NO2)xylB 5’-TATGGGTTCAGCGGCATGAG-3’(SEQ ID NO3)5’-ATGGGCATGAGATCCATAGCC-3’(SEQ ID NO4)Tnp 5’-TCCTAACATGGTAACGTTC-3’(SEQ ID NO5)5’-CCAACCTTACCAGAGGGC-3’(SEQ ID NO6)Tal5’-CGTCTAAAAGArTTTAAGAAAGGTTTCGATATGACGGACAAATTGACC-3’(SEQ ID NO7)5’-CATTTTGACTCCAGATCTAGATTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC-3’(SEQ ID NO8)預雜交和雜交都是按照Boehringer Mannheim雜交試劑盒的說明書描述的內容來進行。
聚合酶鏈反應(PCR)擴增為了構建用于基因整合的整合質粒，使用Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)PCR擴增以下片段，其引物對也如下所示
1.5’IdhL4(1.9kb)模板運動發(fā)酵單胞菌31821 DNA引物P16(F)5’CCATCGATTCTAGAATCTCGCGTAATAAAACTATCAGGCGCAATCG3’(SEQ ID NO9)P17(R)5’CGCGGATCCAGATCTGGCCTAGGCGGCCTCATAATATGGGCAAAGACACTCCCG3’(SEQ ID NO10)2.3’IdhL4(2.4kb)模板運動發(fā)酵單胞菌31821 DNA引物P18(F)5’GAAGATCTGCGGCCGCGTTTTGGTGCCAATGTTATCGCC3’(SEQ ID NO11)P19(R)5’GAAGATCTAAGCTTGGATAGCGGCTTATAGCAACGAGTG3’(SEQ ID NO12)3.Tcr(1.5kb)模板pBR322引物Tc(F)5’AAAGGCCGCCTAGGCC3’(SEQ ID NO13)Tc(R)5’AAAGGCCTAGGCGGCC3’(SEQ ID NO14)
4.Cmr(1kb)模板pZB186引物Cm(F，Eag)5’CCGAATAAATACGGCCGCCTGTGACGGAAGATCACTTC3’(SEQ ID NO15)Cm(R，Eag)5’TAACGACCCTGCCGGCCGCCTGAACCGACGACCGGGTCG3’(SEQ ID NO16)構建pZB512XTc和pZB510xTc用于同源重組將PgapXylAB(來自pZB4)和Tcr(PCR產物)插入到5’IdhL4(1.9kb)和3’IdhL4(2.4kb)片段之間的NotI和SfiI位點之間，從而構建得到整合質粒pZB510xTc(見圖19(A))。質粒pZB512XTc(見圖19(B))的構建途徑與此相似，只是PgapXylAB的定位與pZB510xTc中相反。
構建pMODPenotaltktCm用于轉座PCR產生的Cmr片段克隆到載體pMOD(Epicentre，WI)的SmaI位點，獲得pMODCm。來自pUCtaltk(zhang等人，(1995)Science 267240-243)的BglII片段克隆至pMODCm的BamHI位點形成pMODPenotaltktCm(見圖20)?？寺〉絧MOD的片段兩端側接了19bp的Mosaic末端(IS)，其可以被轉座酶識別從而進行轉座。
從同源重組消除質粒以獲得xylAB將生長于RMGTcCm(30℃)的運動發(fā)酵單胞菌5C/pZB512XTc的過夜培養(yǎng)物每天轉移到5ml的37℃的RMG試管中進行繼代培養(yǎng)(1∶100)，共轉移10次。每次轉移中，測量培養(yǎng)物中質粒的損失并與RMG和RMGCm平板的克隆數目進行比較。當包含質粒細胞的數量低于總數的10％，將培養(yǎng)物接種(1∶100)到RMGTc使?jié)撛诘腜gapxylABTc整合體富集生長。RMGTc富集培養(yǎng)物轉入RMGTc平板上并在RMGTc和RMGCm平板上影印培養(yǎng)。具有TcrCms表型的克隆應作進一步分析從而確定整合體。
酶分析在一些實施例中，根據Zhang等人，(1995)Science 267240-243的方法稍作改變，用運動發(fā)酵單胞菌整合體的無細胞提取物和控制菌株對木糖異構酶(XI)、木酮糖激酶(XK)、轉醛酶(TKT)和轉酮酶(TAL)進行分析。收集處于遲滯后期的培養(yǎng)物(30℃，OD600約1.2)用超聲處理緩沖液(10mM Tris-Cl，pH7.6，10mM MgCl2)清洗一次隨即進行超聲處理以制備運動發(fā)酵單胞菌的無細胞提取物。離心(14,000rpm，45分鐘，4℃)除去細胞碎片。
實施例1以下實施例描述了含有編碼木糖同化酶基因的小Tn5Tc的構建以及該構建物接合轉移到運動發(fā)酵單胞菌206C和ATCC39676。將Pgap-xylAxylB操縱子插入到質粒pGP704中小Tn5Tc的特異性NotI位點上，從而構建含有編碼木糖同化酶基因的小Tn5Tc。參見圖1。Pgap-xylAxylB操縱子取自質粒pZB4或pZB5，美國專利Nos.5712133和5726053。最終質粒命名為小Tn5Tc xylA/xylB(X4)和小Tn5Tc xylAxylB(X5)，通過電穿孔將其轉化到供體菌株E.coli SM10λpir中并與運動發(fā)酵單胞菌ATCC39676或者206C菌株進行接合。運動發(fā)酵單胞菌206C公開于美國專利No.5843760，此處納入作為參考。在含有Tc和萘啶酮酸的培養(yǎng)基中，挑選含有小Tn5Tc xylAxylB(X4)和小Tn5TcxylAxylB(X5)的SM10λpir供體獲得九個發(fā)酵單胞菌Tcr轉接合子。參見圖2(b)。
然后對九個運動發(fā)酵單胞菌Tcr轉接合子的基因組和質粒DNA進行Southern印跡分析。來自轉接合子的基因組和質粒DNA用SphI消化，在雜交轉座子和木糖操縱子內進行切割，并使印跡與Tc探針、XylB探針或者轉座酶Tnp探針雜交。通過放射自顯影可以確定(1)木糖操縱子Pgap-xylAxylB與Tcr基因一起插入發(fā)酵單胞菌的基因組中；(2)每個轉接合子只有一個插入；(3)每個插入都在基因組的顯著位置；(4)Tcr基因與XylB不存在于質粒部分；(5)tnp轉座酶基因不存在于轉接合子中。
對發(fā)酵單胞菌TcrPgap-xylAxylB轉接合子進行酶分析以確定發(fā)酵單胞菌Tc Pgap-xylAxylB轉接合子中木糖異構酶(XI)和木酮糖激酶(XK)得以表達。分析表明，所有轉接合子的木糖異構酶水平大約為相應質粒酶水平的一半。類似的，包含質粒的菌株的木酮糖激酶活性的一半也與整合體的酶活性相當。在發(fā)酵單胞菌基因組中通過基因單拷貝表達的XI和XK的活性與包含質粒菌株的每個細胞10個拷貝相比，明顯要高得多。
實施例2(C25)實施例描述了如何構建表達四種戊糖發(fā)酵基因的發(fā)酵單胞菌整合體。通過該方法可以構建一種在缺乏抗生素選擇的情況下基因穩(wěn)定性提高的發(fā)酵單胞菌整合體。為了制備戊糖發(fā)酵菌株，需要用小Tn5將幾種酶基因轉入運動發(fā)酵單胞菌基因組中，這些酶基因是木糖同化基因xylA和xylB，編碼木糖異構酶和木酮糖激酶；戊糖磷酸途徑基因talB和tktA，編碼轉醛酶和轉酮酶。含有Pgap-xylAxylB和Peno-talB/tktA的兩個操縱子在小Tn5中進行配置，得到的質粒結合到運動發(fā)酵單胞菌中。在位于小Tn5組件外側的轉座酶的作用下，單拷貝的Pgap-xylAxylB和Peno-talB/tktA插入到運動發(fā)酵單胞菌基因組中，這通過Southern雜交可以顯示出來。對木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛酶和轉酮酶的酶分析顯示，所有基因都得到表達，整合菌株表現(xiàn)出包含質粒菌株30-70％的酶活性。這些酶水平足以使機體生長并將特定的戊糖如木糖發(fā)酵生成乙醇。
為了簡化克隆步驟，含有操縱子Peno-talB/tktA的Bg/II片段插入到新構建的輔助質粒pUSCfiMCS的BamHI位點(如圖3所示)。將含有來自pUC19的多克隆位點的EcoR I-Hind III片段插入到pUCSfi中，從而構建得到輔助質粒pUSCfiMCS。
參見圖2，Peno-talB/tktA作為SfiI片段從pUCtaltktSfi上切除，并克隆到小tn5-Tc-xylAxylB上。如圖所示，在tn5-Tc-xylAxylB上，Tcr基因側接了SfiI位點。用Sfi I對小tn5-Tc-xylAxylB進行部分或者完全消化并與Peno-talB/tktASfi片段連接，如圖2(c)所示。部分消化生成含有Tcr基因的質粒，命名為小tn5-Tctal/tkt-xylAxylB(圖2(c))，而完全消化產生的質粒不含Tcr基因，命名為小Tn5-Tc tal/tkt-xylAxylB，見圖2(d)。
以上兩種質粒都轉化到供體菌株E.coli，S17-1中并與運動發(fā)酵單胞菌206C接合。在含有葡萄糖、Tc和萘啶酮酸的接合培養(yǎng)基中篩選小Tn5-Tc tal/tkt-xylAxylB的轉接合子，對于小tn5-Tctal/tkt-xylAxylB，直接在含有木糖和萘啶酮酸的接合培養(yǎng)基中篩選轉接合子。獲得大量的生長于葡萄糖的小tn5tal/tkt-xylAxylB-Tc的Tcr轉接合子。獲得若干生長于木糖的小tn5tal/tkt-xylAxylB轉接合子。
在80ml含有2％木糖的RM中，于30℃不控制pH的條件下，靜態(tài)檢測初始間歇培養(yǎng)物，以確定其發(fā)酵動力學。將RM+2％木糖平板上的克隆轉移到RM2％木糖培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，溫度為30℃，直到培養(yǎng)物達到穩(wěn)定的生長期(光密度600在500nm處為0.1)。它們作為接種物使用。使用P1047裝配的Hewlett-Packard1090L高效液相色譜對木糖和乙醇進行分析。在65℃條件下操作折射率檢測儀和Biorad HPX-87H有機酸分析柱，以0.01N的硫酸作為流動相，流速為0.6ml/min。通過發(fā)酵的糖的重量或者培養(yǎng)基中的總糖量來計算乙醇產量。最大理論產量為0.51g乙醇/g木糖。
對來自運動發(fā)酵單胞菌轉接合子的基因組和質粒DNA樣品進行Southern雜交分析，從而確定小tn5 tal/tkt-xylAxylB組件是否發(fā)生了轉座。從小tn5 tal/tkt-xylAxylB的四個轉接合子制備基因組和質粒DNA，用SphI消化。SphI在組件內切割兩次，產生具有Tal探針同源性的一個片段。印跡與Tal探針或者Tnp探針進行雜交。圖4的放射自顯影顯示了一條大于4kb(Peno-talB/tktA的大小)的帶，它與運動發(fā)酵單胞菌的DNA相鄰，所有制備的DNA與Tal探針雜交時都能檢測到。三個樣品(可能同源的nos.22，23和24)在質粒部分也顯示出一條帶，這表明天然質粒中發(fā)生了整合。樣品no.21的運動發(fā)酵單胞菌基因組內也發(fā)生了整合，并且只插入了一個拷貝。這些轉接合子的基因組合質粒DNA樣品與Tnp探針的雜交(圖5)表明樣品DNA與Tnp探針之間沒有同源性。這些結果表明，木糖同化和戊糖磷酸途徑基因與Tcr基因一起轉座到運動發(fā)酵單胞菌的基因組內，每個轉接合子只進行了一個插入，插入位于基因組中不同的位置。
發(fā)酵單胞菌轉接合子的木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛酶和轉酮酶的活性的測定方法如前所述(Zhang等人，1995)。前面已經提及，單一Pgap-xylAxylB拷貝在基因組的表達量大約為包含質粒菌株的XI和XK酶量的一半。不過，為了確定轉醛酶(TAL)和轉酮酶(TKT)是否已經在運動發(fā)酵單胞菌tal/tkt-xylAxylB-Tc和tal/tkt-xylAxylB轉接合子內進行表達，進行了酶分析，如圖6所示，對于所有的轉接合子(nos.4，5，17，18，21，23和24)而言，其TAL的酶水平大約為其對應質粒的50-70％。整合體中TKT的活性大約為包含質粒菌株的30-70％。通過發(fā)酵單胞菌基因組內單拷貝基因的表達，質粒整合體的TAL和TKT的活性雖然只是稍有增加，但與包含質粒菌株每個細胞10個拷貝相比，活性明顯提高。
所有四個tal/tkt-xylAxylB發(fā)酵單胞菌整合體(nos.21，22，5和11)都能在木糖上生長。以2％的木糖為底物，溫度為30℃，研究這些整合體的初始發(fā)酵，發(fā)酵曲線如圖7所示。從圖中可以看出，運動發(fā)酵單胞菌整合體no.21的生長速率和糖利用速率比包含質粒菌株39676/pZB4慢。不過，大多數的運動發(fā)酵單胞菌整合體(nos.22，5，和11)與包含質粒菌株相當。所有的整合體都能通過木糖生產乙醇，最大理論產率為92％。
在非選擇性培養(yǎng)中，對這些基因組整合菌株和三個包含質粒菌株的穩(wěn)定性進行測量。所有的菌株都培養(yǎng)于RMG培養(yǎng)基中，每天連續(xù)大約每10代轉移一次。40代以后，接種到含有1％葡萄糖和5％木糖的RM培養(yǎng)基的搖瓶中，以測量其將木糖轉化為乙醇的能力。乙醇的產率和木糖的利用速率是衡量穩(wěn)定性的重要標志。有兩個基因組整合菌株(C25和D92)的穩(wěn)定性顯示超過90代，而包含質粒菌株(206/pZB4，206/pZB4L和BclpZB4L)只能穩(wěn)定約40代。參見圖8。
在含有不同葡萄糖和木糖總濃度(1％葡萄糖和5％木糖；3％葡萄糖和3％木糖；4.5％葡萄糖和4.5％木糖)的RM培養(yǎng)中，同時控制pH，分析菌株C25和D95的發(fā)酵行為。如圖9所示，在pH為5和5.5且含有4.5％葡萄糖和4.5％木糖的RM培養(yǎng)基中，菌株C25顯示出比菌株D92更高的木糖利用能力和乙醇產率。在下面的實施例中，阿拉伯糖同化基因被整合到C25基因組中。實施例3(AX)以下實施例描述了通過同源重組將阿拉伯糖同化酶引入到C25的基因組中，這是通過ldh和使用小轉座子Tn10的轉座來實現(xiàn)的。下面將要描述質粒pZB1862-ldhL-ara，通過電穿孔被轉化到運動發(fā)酵單胞菌或者大腸桿菌中。在添加了葡萄糖和四環(huán)素的接合平板上篩選轉化體。Tcr克隆能夠生長在添加了木糖或者阿拉伯糖的RM培養(yǎng)基(RMX和RMA)，因此確定其為Ara+Xyl+。下面還會提及質粒Tn10G，采用過濾接合技術(Conway等人，1987)使其從大腸桿菌SM10λpir供體中轉移到運動發(fā)酵單胞菌C25。產生的轉接合子在含有阿拉伯糖的接合平板上進行篩選。
A.構建pZB1862-ldhL-ara并通過同源重組整合入C25過去曾經嘗試，利用1kb的ldh片段作為同源區(qū)域，將araBAD整合入發(fā)酵單胞菌的基因組內，但沒有成功。為了提高重組頻率，需要有更大的同源區(qū)域。通過PfuPCR，包含ldh和側接區(qū)域的2.5kb的DNA片段得到擴增。根據Yamano I.，(1993)Journal ofBacteriology，Vol.175，3926-3933公開的運動發(fā)酵單胞菌CP4的DNA序列設計引物。通過PCR沒有得到所預想的2.5kb的片段，而是3.4kb的片段。用BamHI消化3.4kb片段，得到2.5和0.9kb兩個片段。兩個片段都通過PCR檢測，使用設計的引物退火至只有l(wèi)dh。2.5kb的片段產生了大小適當的PCR產物，而0.9kb片段卻沒有，這說明前者含有l(wèi)dh序列。因此，克隆2.5kb的BamHI片段(命名為ldhL)并將其作為基因整合到C25的同源區(qū)域。
使用Pfu(Stratagene，La Jolla，CA)DNA聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)PCR擴增ldhL片段。采用如下引物序列l(wèi)dhL5’-TCGCGGATCCTCTATCCCTTTATTTTTCTATCCCCATCACCTCGG-3’(SEQ ID NO17)5’-TCGCGGATCCGCGGCTGACATACATCTTGCGAATATAGGG-3’(SEQ ID NO18)為了克隆的目的，需要將NotI位點引入ldhL，使寡核苷酸5’-CATGCGCGGCCGCC-3’(SEQ ID NO19)插入NcoI位點，其位于ldh基因的中部。新的NotI位點距離ldhL兩端分別為1.4和1.1kb。含有NotI位點的ldhL的BamHI片段(2.5kb)連接到pZB1862的BcII位點。最后，分離自pZB206(美國專利Nos.5712133和5726053)的4.4kb的Pgap-araBAD克隆到ldhL的NotI位點，從而形成整合質粒pZB1862-ldhL-ara。如圖10所示。
含有三個阿拉伯糖同化基因的Pgap-araBAD操縱子，通過同源重組整合到C25基因組的ldh位點。為了使araBAD基因整合到C25的基因組中，在大腸桿菌DH5α內構建pZB1862-ldhL-ara。通過電穿孔將質粒pZB1862-ldhL-ara轉移到C25內。篩選和檢測Tc抗性轉化體以生長于阿拉伯糖上。在轉化體的增殖過程中，可以使ldhL’-araBAD-ldhL’組件代替IdhL通過同源重組使Pgap-ara-BAD整合到C25基因組中。
為了富集和分離轉化體，對轉化體的質粒進行消除。質粒pZB1862-ldhL-ara將在運動發(fā)酵單胞菌中進行復制。不過，運動發(fā)酵單胞菌在次最優(yōu)生長條件下(例如37℃)容易丟失外源基因。利用這一性質，將C25轉化體在37℃、缺乏Tc的情況下亞培養(yǎng)，經過幾次轉移，就可以消除pZB1862-ldhL-ara。每一次轉移，都檢測培養(yǎng)物中質粒的消除情況。在第三次轉移時，100％的細胞變?yōu)門c5，說明質粒已經消除。將第三次、第四次、第五次和第六次轉移的培養(yǎng)物接種到含有阿拉伯糖(RMA)的30℃的RM中，使?jié)撛诘腜gap-araBAD整合體富集生長。富集的細胞轉移到RMG平板然后復制挑選到RMA、RMX和RMGTc平板上。對一些具有Xyl+Ara+Tc5表型的整合體(AX)作進一步分析，具體說明如下。這些整合體能夠將木糖和阿拉伯糖作為唯一的碳源來使用。
B.構建Tn10G并接合到C25使用小Tn5來構建帶有Peno-tal/tkt和Pgap-xylAB操縱子的C25。盡管C25中不存在轉座酶基因，但利用小Tn10來進行后面的Pgap-araBAD的整合，以避免相同轉座子之間任何的不相容性。以基于Tn10的傳遞質粒pLOFKm來構建質粒Tn10G(圖11)。Kmr基因被分離自pZB206的Pgap-araBAD的NotI片段取代。構建Tn10G并保留在大腸桿菌C118內。然后將質粒轉移到接合供體大腸桿菌SM10λpir從而與運動發(fā)酵單胞菌接合。由于Tn10G在運動發(fā)酵單胞菌中是自殺性質粒，所以只有整合了araBAD的轉接合子才能在添加了阿拉伯糖的接合平板上生長。由于平板中有萘啶酮酸的存在，大腸桿菌SM10λpir供體受到抑制。在7天內平板上可以看到轉接合子。在RAM和RMX上復制篩選克隆以確定其表型。篩選的克隆有86％是Xyl+Ara+。來自篩選平板的20個克隆交叉轉移到不同的平板(例如從木糖平板轉移到阿拉伯糖平板，反之亦然)。這些克隆有60％仍然保持Xyl+Ara+的表型。初始Southern雜交對20個克隆進行分析。使用tnp探針，大約50％的菌株其基因組內含有轉座酶基因。用Southern雜交對8個整合體作進一步分析。通過Southern雜交，確定Pgap-araBAD整合到C25的Idh內，因為pZB1862-ldhL-ara使用了DIG標記的ara和Idh探針。如圖12(a)和(b)所示。使用TaqDNA聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)PCR擴增地高辛(DIG)標記的ldh，ara和tnp探針。DIG-UTP購自Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN。tnp探針用來篩選IS10R，其為Tn10的轉座酶基因。ldh，ara和tnp的PCR產物分別為1，1.4和0.8kb。使用以下引物序列DIG-ldh5’-TCGCGGATCCGTCTATGCGCGCGTCGCAATATTCAGTTCC-3’(SEQ ID NO20)5’-TCGCGGATCCGTCGCTTGTCTATTAAACAAGCGCATCCGGC-3’(SEQ ID NO21)DIG-ara5’-CTAACATGTTGACTCCTTCTCTAGACTTAGCG-3’(SEQ ID NO22)5’-GTTGAAACCGCTGGGCACCACGC-3’(SEQ IDNO23)DIG-tnp5’-CGCACTACACGGTCGTTCTGTTAC-3’(SEQ IDNO24)5’-GGTTGCAGCCACGAGTAAGTCTTC-3’(SEQ IDNO25)
從印跡中可以看出，pZB1862-ldhL-ara只有一個PstI位點，并且定位于Pgap-araBAD。因此，使用ara探針，從PstI消化的質?？梢灶A計到一條12.9kb的雜交條帶。隨著Pgap-araBAD整合到基因組中，可以預計到兩條帶，分別由Pgap-araBAD的PstI位點和定位于Pgap-araBAD外側的基因組附屬PstI位點產生。圖13(a)的結果清楚的顯示了制備的總DNA與ara探針雜交所形成的兩條帶，表明了Pgap-araBAD的整合。發(fā)酵單胞菌整合體的質粒DNA沒有雜交條帶說明整合發(fā)生于基因組內而不是天然質粒中。為了顯示由于Pgap-araBAD整合而使Idh斷開，轉移相同的DNA并與ldh探針雜交。和預計的一樣，整合體的兩個雜交圖譜印跡都相同，除了C25以外，如圖12(b)所示。C25是Pgap-araBAD整合的宿主菌株，其總DNA中有完整的ldh，其只顯示了一條帶。這一結果確定了araBAD是整合到C25的ldh中。
圖13(a)和(b)顯示了用DIG標記的Tnp和ara探針對八個Pgap-araBAD轉座子的Southern雜交，這八個轉座子是通過Tn10轉座產生的。用PstI限制性酶消化DNA。PstI將Tn10G切割成兩個片斷，與ara探針雜交。通過印跡分析，只有G8、G11、G15和GH17是ara陽性和tnp陰性的。不同的圖譜表明Pgap-araBAD整合到基因組的不同位置。雖然不希望轉座酶基因留在整合體基因組內，上述八個菌株之外的四個菌株(G5、G6、G14和G19)仍然含有轉座酶基因。此外，G14和G19含有的轉座酶基因在質粒上。使用ara探針，預計通過整合體可看到兩條帶，然而只觀察到一條帶。為了進一步明確，以ara作為引物，對整合體進行PCR操作，結果證明，所有八個整合體的基因組內都含有Pgap-araBAD。
根據Zhang等人，1995和Deanda等人，1996描述的方法并稍作變化，使用運動發(fā)酵單胞菌整合體和控制菌株的無細胞提取物對木糖異構酶(XI)、木酮糖激酶(XK)、L-阿拉伯糖異構酶(L-AI)、L-核酮糖激酶(L-RK)、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構酶(L-Repi)、轉酮酶(TKT)和轉醛酶(TAL)進行分析。收集處于對數生長后期(30℃，OD600大約1.2)的培養(yǎng)物，超聲緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2)洗滌一次，然后進行超聲處理，從而制備無細胞提取物。通過離心(14,000rpm，45min 4℃)除去細胞碎片。在L-AI分析中，定時樣品的體積按比例減少一半(50μl)，加入70％H2SO4和0.12％咔唑(50μl)。在70％H2SO4加入之前和加入之后，所有的試管都保溫在25℃的水浴中，然后讀取吸光度。分別在反應0、5、10和20分鐘時取出樣品。無論是通過同源重組還是轉座子整合得到的整合體都能在D-木糖和L-阿拉伯糖上生長。通過測量酶活性來確定整合基因的表達水平。選擇C25/AX1，C25/AX101和C25/G8用來進行酶分析，因為它們是最穩(wěn)定的整合體，這是通過下面的穩(wěn)定性分析確定的。酶分析的結果總結于圖14和15。在所有的分析中(無論是否有木酮糖激酶)，與控制菌株(C25和/或206C)相比，整合體都表現(xiàn)出活性。在大多數分析中(不包括L-核酮糖激酶和木糖異構酶)，整合體比包含質粒菌株(206C/pZB301)的活性低。這可能與基因的拷貝數有關。
為了作穩(wěn)定性分析，培養(yǎng)物被接種到含有RMG的試管中，30℃下過夜培養(yǎng)，并轉移到RMG試管中，每天一次。對接種物進行控制，使得每10代轉移一次。每過40代，將細胞接種于含有各類糖的混合物的搖瓶中，30℃，不控制pH，檢測細胞對糖類的發(fā)酵能力。間歇發(fā)酵分析在Bio-StatQR恒化器中進行，30℃并控制pH，以500ml作為工作體積。用2N NaOH自動控制pH。每一批次的初始糖濃度和pH有所差別，取決于培養(yǎng)條件。所有使用的糖均為試劑純。發(fā)酵過程中定時取樣，通過HPLC分析糖、乙醇和副產物，方法如前所述(Zhang 1995)。測量600nm時的光密度(OD600)，以監(jiān)測細胞的生長情況。乙醇產量以可利用的總糖量為基礎。
用同源重組和轉座的方法獲得一些基因組整合的發(fā)酵木糖和阿拉伯糖的運動發(fā)酵單胞菌菌株，分析其在非選擇性培養(yǎng)基(RMG)中的穩(wěn)定性。這些菌株培養(yǎng)在RMG培養(yǎng)基中并依次進行轉移，每天一次，大約經過了10代。每40代以后，將細胞接種到含有1％葡萄糖和2％木糖以及2％阿拉伯糖的搖瓶中，檢測其發(fā)酵木糖和阿拉伯糖生成乙醇的能力。乙醇產量、木糖和阿拉伯糖的利用速率作為菌株穩(wěn)定性的標志。有兩個分離株在160代時仍然保持穩(wěn)定性。參見圖16和17。對三個整合菌株和一個包含質粒菌株的發(fā)酵過程作進一步檢測，培養(yǎng)基含有4％葡萄糖、4％木糖和2％阿拉伯糖的混合物，pH5.5，溫度為30℃。如圖18所示，所有三株菌在72小時內都利用了葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，而包含質粒菌株仍然殘留了6g/L的阿拉伯糖。不過，整合菌株產生的木糖醇要比包含質粒菌株多，分別為4g/l和1g/L。兩個同源重組AX1和AX101菌株不產生乳酸，因為在基因整合過程中乳酸脫氫酶基因失活。整合菌株的產量(理論值大約83％)與包含質粒菌株非常接近。而且，整合菌株生長后具有更大的細胞密度，這反映了由于七種基因的單拷貝數，菌株的代謝負擔減小。
實施例4以下實施例描述了通過同源重組將PgapxylAB整合到運動發(fā)酵單胞菌31821-5C的ldh中。前面已經表明，運動發(fā)酵單胞菌31821對高含量的糖類進料、高溫和醋酸具有增加的耐受力。因此，對于四種利用木糖的基因(tal，tkt，xylA和xylB)而言，運動發(fā)酵單胞菌31821是非常優(yōu)良的用來整合的目標菌株。然而，通常的大腸桿菌宿主的DNA很難轉化菌株31821。該菌株表現(xiàn)出種獨特的基因特性，即限制甲基化宿主的DNA。已有的方法即使用小Tn5Tc以大腸桿菌Sm10(λpir)作為供體菌株的轉接在31821-5C中不起作用。因此嘗試了不同的整合方法。小Tn5和小Tn10系統(tǒng)并不適用，因為缺少甲基化缺陷型大腸桿菌，而這又是31821菌株中轉座質粒轉接所必需的。做了兩個嘗試，將小Tn5(在插入序列之間含有Tcr基因)接合入31821-5C內，沒有獲得轉接合子?？紤]到像Tcr這樣的小片段(1.5kb)通過小Tn5轉座都不能接合并整合到31821-5C的基因組中，那么更大的片段例如PgapxylABTc或者PenotaltktCm的整合或許也不可行。因此采用了一種基于轉化而不是接合到宿主中的轉座方法(使用了EZ∷TN插入試劑盒，見下)，并提供了更大的用于同源重組的同源區(qū)域，因為菌株31821的重組效率低。
通過多次努力，使用EZ∷TN試劑盒將所有四種基因(排列在兩個操縱子——PgapxylAB和Penotaltkt內)整合到31821的基因組中，但都不成功。這是由于兩個潛在的問題。第一，插入序列的長度對于整合到基因組而言太大；第二，在木糖培養(yǎng)上直接篩選不能使基因能夠及時表達從而使整合體得以生長。為了克服這些問題，必須設計不同的方法使基因整合到31821中。與所有四種基因整合不同，同一時間只整合兩種基因(采用一個操縱子PgapxylAB或Penotaltkt)。兩個操縱子依次整合到同一個宿主中。每個操縱子連接一個抗生素標記(Tcr或者Cmr)用于整合體的初始篩選。通過這一方法，利用抗生素抗性就可以篩選整合體。兩次整合方法用于木糖利用基因整合到31821-5C中(同源重組和轉座)。使用2kb的包括ldh的同源區(qū)域(即ldhL)將Tcr基因整合到31821-5C的ldh內。在將PenotaltktTc片段整合到2kb的ldh基因座的兩次嘗試中，花費了相當長的時間才獲得整合體，因為有冗長的切割和富集過程(至少需要14天)。然而，含有PgapxylAB的質粒轉化到整合體時，整合體不能在木糖上生長。使用ldh特異性引物并以整合體基因組DNA為模板，獲得PCR片段，對其DNA序列進行分析。結果顯示，在Penotaltkt操縱子中并沒有引入突變。有兩個問題要考察。第一，taltkt基因的定位與pgm基因相反，pgm基因在基因組中緊接ldh并在其上游。Pgm基因具有很強的啟動子，它可能會抵消taltkt的表達。第二，在發(fā)酵單胞菌中，Peno是相對較弱的啟動子。Penotaltkt在整合體中的單拷貝對于基因的表達是不夠的。所以嘗試通過轉座來整合Penotaltkt(因為ldh位點帶來了上游強啟動子的問題)以及利用同源重組來實現(xiàn)PgapxylAB的整合。更重要的是，整合所需的同源區(qū)域被擴大至超過2kb ldhL區(qū)域從而提高了重組的效率。新的同源區(qū)域延伸至包括了ldh的側接區(qū)域(pgm和adhI基因)?？偟耐磪^(qū)大小約為4kb(稱為ldhL4)。
為了將PgapxylAB操縱子整合到31821的基因組內，以復制質粒pZB1861為基礎，構建了pZB510XTc和pZB512XTc(參見圖19A和19B)，和兩個更相似的質粒pZB511XTc和pZB513XTc，其中基因的構建方式不同。通過兩次PCR反應，產生同源片段ldhL4，包括5’和3’片段。PCR產生的片段5’ldhL4(1.9kb)和3’ldhL4(2.4kb)隨后插入到穿梭載體pZB1861的BamHI-XbaI位點和BamHI位點。在PCR過程中，NotI和SfiI限制性位點被引入5’ldhL4和3’ldhL4之間。插入PgapxylAB(來自pZB4)和Tcr(PCR產物)到NotI和SfiI位點從而構建整合質粒pZB510xTc。質粒pZB512XTc的構建方法相似，只是PgapXylAB的定位與pZB510XTc中的相反。
使用電穿孔將質粒導入菌株31821-5C。質粒pZB510XTc、pZB512XTc、pZB511XTc和pZB513XTc被用來轉化31821-5C。經過數次嘗試，pZB510XTc和pZB512XTc的轉化獲得成功。pZB511XTc和pZB513XTc卻沒有實現(xiàn)轉化。
整合組件包含Tcr標記，其用于整合體的篩選。不過Cmr卻位于質粒中該組件之外。篩選TcrCmr轉化體并在Tc存在的條件下培養(yǎng)，每天轉移2到4次。在轉化體繁殖過程中，PgapxylABTc通過同源重組整合到宿主的ldh內。消除質粒，使整合體富集并進行分離。將轉化體在抗生素缺乏的條件下37℃亞培養(yǎng)7到14天，每天轉移一次，從而實現(xiàn)質粒的消除。持續(xù)檢測每一次轉移的培養(yǎng)物中質粒的消除情況。經過三次轉移后，大于99％的細胞都變?yōu)镃ms，說明質粒已經消除。使第三次、第四次、第五次和第六次轉移的培養(yǎng)物30℃下接種到RMGTc，使?jié)撛诘腜gapxylAB整合體富集生長。富集的培養(yǎng)物接種到RMGTc平板上，復制挑選到RMGCm和PMGTc平板上。整合體(TcrCms)與野生型(TcsCms)和包含質粒(TcrCmr)細胞有明顯的不同，因為其具有抗生素抗性的表型。分離可能的PgapxylAB整合體并作進一步分析。將來自整合體的質粒DNA后轉移到大腸桿菌DH5a從而除去包含質粒菌株。分別使用Tc、xylAB和Cmr引物對對克隆進行PCR分析，以測定整合體的基因型。四個分離株x4i、x6i、x9i和x10i證實為整合體，因為在后轉化中沒有得到轉化體，并且PCR結果顯示出xylAB和Tc條帶而沒有Cmr條帶。用發(fā)酵單胞菌復制質粒pZB192轉化PgapxylAB整合體(x4i、x6i、x9i和x10i)，該質粒攜帶了Penotaltkt而不是PgapxylAB。轉化體能夠在RMX上生長，說明當tal和tkt基因以多拷貝數提供到質粒上時，單拷貝數的整合的PgapxylAB為木糖的利用提供了足夠的木糖異構酶和木酮糖激酶活性。這一結果也保證了我們可以進一步將Penotaltkt整合到PgapxylAB整合體中，從而構建完全的木糖發(fā)酵整合菌株31821(見實施例6)。
實施例5以下實施例描述了通過轉座將Penotaltkt整合到運動發(fā)酵單胞菌31821-5C的基因組中。小Tn5和小Tn10都不適合31821，因為缺少用于接合的甲基化缺陷型供體宿主。因此采用一種新的轉座方法(EZ∷TN插入試劑盒)。當電穿孔進入細胞以后，轉座酶連接到PenotaltktCm側接的Mosaic末端并對片段進行切割，同時仍然與末端連接。在細胞內，轉座酶引發(fā)DNA片段轉座到宿主的基因組內。整合質粒pMODPenotaltktCm(見圖20)是發(fā)酵單胞菌內的非復制型質粒，通過甲基化缺陷型大腸桿菌宿主制備得到。細胞被電穿孔后接種到MMGCm平板上。Cmr轉化體就應是整合體。通過這種轉座方法得到的三個Cmr整合體在這里分別稱為int1、int2和int3。使用tal或者Cm的引物進行PCR篩選可以進一步確認整合體。或者使質粒從整合體后轉化到大腸桿菌以確定PenotaltktCmr沒有在質粒pMOD上，這樣也可以確認整合體。用質粒pZB188-xyl轉化整合體，該質粒攜帶PgapxylAB(而不是Penotaltkt)。電穿孔細胞直接接種到MMX平板上。在這一互補實驗中，沒有得到轉化體。Penotaltkt的單一拷貝數不能夠提供足夠的用于在木糖平板上初始生長的轉醛酶和轉酮酶活性。發(fā)酵單胞菌的強啟動子如Ppdc(丙酮酸脫羧酶基因)和Pgap(甘油醛磷酸脫氫酶基因)可以彌補低拷貝數對taltkt表達的影響。
實施例6以下實施例描述了Penotaltkt/PgapxylAB整合體的構建。嘗試將四種木糖利用基因整合，然而無論是采用轉座還是同源重組都沒獲得成功。因為當木糖同化基因提供到質粒上時，單一拷貝數的Penotaltkt整合到31821-5C的基因組不能使菌株在木糖上生長。申請人通過在體外將pMODPenotaltktCm轉座到菌株31821的天然質粒上，從而提高整合Penotaltkt的拷貝數。轉座后的天然質粒通過電穿孔進入PgapxylAB整合體x9i。用TcrCmr篩選，最終得到的整合體稱為x9t(enott)Pi。從整合體分離出的質粒用于運動發(fā)酵單胞菌31821-5C和大腸桿菌DH5a的后轉化。結果得到了運動發(fā)酵單胞菌的后轉化體，而大腸桿菌則沒有。這表明基因整合到x9i的天然質粒中。另一個方法是，從大腸桿菌DM1制備含有PgapxylABTcr的整合質粒pZB510XTc和pZB512XTc并轉化到int2中。經過多次電穿孔，最終獲得TcrCmr轉化體。對轉化體進行如前所述的質粒消化和富集處理。對上述兩種方法制備得到的整合體進行檢測，讓其生長在含有木糖的培養(yǎng)基中(RMX)?？梢杂^察到有整合體在RMX上生長，但數量極少。經過在PMX中的一系列適應以后(參見下面實施例)，每個整合組有兩個整合體(x9t(enott)Pi#4和#8；int2/321和int2/1821)在RMX中表現(xiàn)出相對更好的生長情況，對其作進一步分析。對得到的潛在的Penotaltkt/PgapxylAB整合體進行Southern雜交分析以確定目標DNA的存在。從這些整合體制備總DNA和質粒DNA，用SphI消化得到xylB探針，以進行雜交。預計質粒pZB512XTc(作為對照)有兩條帶，5.4和2.5kb，其中2.5kb的帶與整合體x9t(enott)Pi#4，#8和int2/321的總DNA是共有的。預計質粒pZB510XTc有兩條帶，4.2和3.7kb，其中3.7kb的帶與整合體int2/1821的總DNA是共有的。所有的整合體都以x9i為基礎，其中PgapxylAB整合到基因組的LDH基因座上。
所有的整合體都有一條與其整合質粒共同的條帶，而第二條帶則與預計質粒產生的條帶不同。所有的整合體含有總DNApreps中的帶而不是質粒DNApreps中的，這說明PgapxylAB整合到ATCC31821染色體中而不是天然質粒中。在與tkt探針雜交中，從這些整合體制備的總DNA和質粒DNA用BssHII消化(圖21B)。預計質粒pMODPenotaltktCm(作為對照)有4條帶包括4.2，1.5，0.9和0.1k，其中1.5和0.9kb帶是與所有整合體的總DNA所共有的。0.1kb的帶由于太小，所以保留在凝膠上。如圖21B所示，x9t(enott)Pi#4和#8所包含的1.5和0.9kb的帶存在于總DNA和質粒DNApreps中，從而證實Penotaltkt整合到天然質粒中。#4和#8的印跡顯示缺失第三條帶，可能是由于太小從而留在凝膠上。根據圖譜(見圖20)可以看到，這條帶只有0.4kb大小。除了兩條共有帶以外，int2/321和int2/1821還具有一條6.4kb的帶，其與質粒的不同，說明Penotaltkt整合到這兩個整合體的染色體中。
實施例7以下實施例描述了整合發(fā)酵單胞菌的酶活性。分別將第5次(對于x9(enott)Pi#4和#8)和第4次(對于int2/321和int2/1821)轉移的培養(yǎng)物從RMX接種到RMG，生長16小時后，再接種到新鮮的RMG上。在OD600＝1.0時收集生長在RMG上的細胞進行分析。結果如圖22所示。
以31821-5C為基礎的菌株int2，是染色體整合Penotaltkt的菌株；31821-5C/pZB112，是在穿梭質粒(衍生自pZB1861)上含有Penotaltkt的包含質粒菌株；以及宿主菌株31821-5C，都作為對照物包括在TAL和TKT分析中。對所有的整合體和對照菌株進行木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛酶和轉酮酶的酶分析。和預計的一樣，菌株31821-5C/pZB112顯示出很高的轉醛酶和轉酮酶活性。從整合體中觀察到不同的酶水平。而且，即使采用相似的整合方法得到的整合體中所觀察到的酶水平也是不同的。在所有的分析中，菌株x9t(enott)Pi#4表現(xiàn)出最高的活性，int2/321次之。這些菌株在RMX中生長得更好(參見圖23)。值得注意的是，天然質粒整合菌株(x9t(enott)Pi#4和#8)并非必然就具有較高的TAL、TKT活性。
實施例8以下實施例描述了運動發(fā)酵單胞菌38121-5CPenotaltkt/PgapxylAB整合體在RMX上經過一系列適應以后，能夠將D-木糖發(fā)酵生成乙醇。整合體接種到RMX(含有2％木糖)試管里，并用石蠟膜密封以防止蒸發(fā)。采用OD600測量方法對生長情況進行監(jiān)測。將處于對數生長期的培養(yǎng)物轉移到新鮮的RMX中。如圖23所示，對第1次和第4次轉移的生長曲線作了比較。
經過一段適應時期后，生長速率和最終OD600讀數都提高了。最后的OD從0.08(第1次轉移)提高到0.6(第4次轉移)。經過50次轉移后，生長速率和最大OD讀數都趨于穩(wěn)定?？梢钥隙ǖ氖?，在適應過程中培養(yǎng)物發(fā)生了突變。RMX為具有更有效的木糖利用能力的突變株提供了自然選擇。在四種分析的整合體中，x9t(enott)Pi#4和int2/321表現(xiàn)出最高的生長速率和ODs。在140小時時間點，從第4次/第3次轉移的培養(yǎng)物中取樣進行HPLC分析。如表1所示，木糖的初始濃度為20g/L，經過利用之后變?yōu)?-14g/L，并生成了顯著水平的乙醇，這說明運動發(fā)酵單胞菌31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB整合體能夠發(fā)酵D-木糖生成乙醇。
表1RMX中運動發(fā)酵單胞菌31821 Penotaltkt/PgapxylAB整合體于140小時的HPLC分析

實施例9本實施例描述了pMODPgaptaltktCm的構建用于轉座到運動發(fā)酵單胞菌中。構建pMODPenotaltktCm的方法與之相似，除了引入兩個loxP位點。通過BglII/XbaI消化從pUCtaltkt中分離出2.2kb的tkt片段并克隆至pMOD載體，用BamHI/XbaI消化，產生pMODtkt。使GAP(甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)的發(fā)酵單胞菌啟動子區(qū)域融合到tal的結構基因從而產生PCR片段Pgaptal。用XbaI消化這一片段并克隆到質粒pMODtkt中。最后，含有側接Cmr(CmloxP)的兩段loxP序列(Palmeros等人，2000，Gene247255-264)的PCR片段被插入到質粒的SfiI位點以形成整合質粒pMODPgaptaltktCm(圖24)。側接Cmr的loxP序列可以作為噬菌體Cre重組酶的結合靶，必要時，它可以將Cmr從整合體基因組中去除。類似的，這一方法可用于Tc抗性基因的去環(huán)。具有去除抗生素抗性基因的能力是很有利的。為了實現(xiàn)這一目的，申請人引入了loxP/cre系統(tǒng)。用于上述構建的PCR的寡核苷酸序列如下1.Pgap(0.3kb)模板pZB4引物PgapXbSfi(F)5’CAGTCTAGAGGCCGCCTAGGCCGTTCGATCAACAACCCGAATCC3’(SEQ ID NO26)3’Pgap5’tal(R)5’CAATTTGTCCGTCATGTTTATTCTCCTAAC3’(SEQ ID NO27)2.tal(1kb)模板pZB4引物3’Pgap5’tal(F)5’GTTAGGAGAATAAACATGACGGACAAATTG3’(SEQ ID NO28)talXb(R)5’CCAGATCGTCTAGATTACAGCAGATCGCC3’(SEQ ID NO29)3.Pgaptal(1.3kb)模板Pgap和tal
引物PgapXbSfi(F)5’CAGTCTAGAGGCCGCCTAGGCCGTTCGATCAACAACCCGAATCC3’(SEQ ID NO30)talXb(R)5’CCAGATCGTCTAGATTACAGCAGATCGCC3’(SEQ ID NO31)4.CmloxP(1.1kb)模板pZBl86Cmlox(F，sfi)5’CAGGGCCGCCTAGGCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTGTGACGGAAGATCACTTCGC3’(SEQ ID NO32)Cmlox(R，sfi)5’CAGGGCCTAGGCGGCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTGAACCGACGACCGGGTCG3’(SEQID NO33)實施例10以下實施例描述了以運動發(fā)酵單胞菌31821-5C為基礎的Pgaptaltkt/PgapxylAB整合體的構建。從大腸桿菌DM1或者JM110制備質粒pMODPgaptaltktCm，用EZ∷TN轉座酶處理以制備轉座子。通過電穿孔使轉座子混合物進入PgapxylAB整合體，x9i。在RMGTcCm上篩選獲得Pgaptaltkt/PgapxylAB整合體(Tc抗性基因已經整合到x9i的基因組中)。對來自整合體的質粒DNA進行初始分析，例如在大腸桿菌中進行后轉化，以鑒別是真正的整合體還是包含質粒菌株。對幾種整合體質粒DNA進行大腸桿菌后轉化并去除假的整合體。潛在的TcrCmr整合體接種到以木糖為唯一碳源的RM上并在30℃下培養(yǎng)。在OD600進行測量以監(jiān)測生長情況。所有的菌株初始OD0.3時都能在RMX上緩慢生長。不過，在RMX中經過6次轉移后，生長速率和最終ODs都提高了。生長最好的兩個菌株(#20，#21)的生長曲線如圖25所示。
實施例11以下實施例描述了Penotaltkt/PgapxylAB和Pgaptaltkt/PgapxylAB發(fā)酵單胞菌整合體的分離過程。為了在混合體中分離出更好的生長菌株，對細胞在RMX平板上進行劃線分離。菌株x9t(enott)Pi#4和x9t(enott)Pi#8在4次轉移后劃線；int2/xy1321和int2/xyl1821在3次轉移后劃線；#20和#21在6次轉移后劃線。上述一輪分離稱為第1次分離。在RMX平板上觀察到不同大小的克隆。挑選大的克隆并在RMX平板上劃線(第2次分離)。挑選一些明顯大的克隆并接種到RMX液體培養(yǎng)基中以進行生長分析。有四株菌在RMX上表現(xiàn)出良好的生長態(tài)勢，將其挑選出來并作進一步研究，包括Southern雜交、發(fā)酵和酶分析。這四株菌分別名為321(5)(來源于int2/xyl321)、481(來源于x9tP(enott)Pi#4)、2032(來源于#20)和2122(來源于#21)。采用與實施例6相同的方法進行Southern雜交。如圖26A(以xylB作為探針)和圖26B(以tkt作為探針)所示，在質粒preps中缺少雜交條帶，從而證實了整合的實現(xiàn)，除了圖26B中的菌株481(來源于x9tP(enott)Pi#4)例外，它是特意將Penotaltkt整合到運動發(fā)酵單胞菌31821的天然質粒中構建得到。481和對照pMODPenotaltktCm在帶型上的區(qū)別表明條帶不是天然質粒的。相反，它們來自天然質粒中整合的PentaltktCm。在圖26A中，和期望的一致，在pZB512xTc和所有四種整合體中觀察到一個共同的2.5kb的條帶。然而pZB512xTc和整合體的第二條帶卻存在區(qū)別，這說明xylAB整合到染色體中(推測是ldh基因)。2032中出現(xiàn)更高分子量的條帶，這可能是因為基因組接近ldhL4區(qū)域的SphI位點自發(fā)的發(fā)生改變。在圖26B中，pMODPenotaltktCm或者pMODPgaptaltkt和所有的整合體具有共同的1.5，0.9和0.1kb的條帶。不同的條帶證實了pMODPenotaltktCm或者pMODPgaptaltkt整合到31821-5C的基因組內。
使四種整合體，321(5)、481、2032和2122以及對照菌株，31821/pZB5(包含質粒菌株)、C25(基于39676的木糖發(fā)酵整合體)和31821-5C(宿主)進行初步發(fā)酵。發(fā)酵條件是培養(yǎng)瓶中是80mlRMX(2％木糖)或者RMGX(1％葡萄糖和2％木糖)，不控制pH，30℃靜態(tài)發(fā)酵。對發(fā)酵肉湯的上清液進行HPLC分析，從而檢測發(fā)酵情況。所有整合體都能在RMGX上生長，并發(fā)酵木糖和葡萄糖以最大產率生成乙醇(圖27A，B和C)。所有整合體都能在RMX上生長，并發(fā)酵木糖以最大產率生成乙醇(圖28A和B)。在兩種培養(yǎng)基中，整合體和包含質粒對照菌株(31821/pZB5)和C25整合體(基于39676的木糖整合體)的乙醇生成圖相似(圖27C和28B)。和預計的一樣，在RMGX培養(yǎng)基中，宿主菌株只能發(fā)酵葡萄糖生成乙醇(圖27B)。
對四種整合體以及對照菌株，31821/pZB5(包含質粒菌株)、C25(基于39676的木糖發(fā)酵整合體)和31821-5C(宿主)進行酶分析，數據結果示于下表2。所有的整合體都表現(xiàn)出比31821/pZB5和C25更低的活性。
表2整合體的酶活性比活(μmol/min-mg蛋白)XI XK TAL TKT321(5)0.060.172.100.91481 0.040.232.270.742032 0.150.232.270.742122 0.040.191.560.51int2 0.020.021.190.31X9i 0.040.06ND 0.0331821/pZB50.060.552.521.78C25 0.200.813.781.9931821-5C 0.080.070.010.01ND未檢測出實施例12以下實施例描述發(fā)酵單胞菌整合體的誘變過程從而提高其在木糖培養(yǎng)基中的生長能力。整合體int2/xy1321和x9t(Penott)Pi#8的單一克隆接種到RMG并在30℃下過夜培養(yǎng)。將生長的培養(yǎng)物接種到添加了5％葡萄糖的接合培養(yǎng)基(OD＝0.15～0.2)中并在30℃下培養(yǎng)至OD＝0.5～0.6。收集細胞，用25μg/ml的化學誘變劑1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(MNNG或者NTG)對細胞進行處理。收集NTG處理過的細胞，在RMG中洗滌兩次，重懸浮于RMGX(0.5％葡萄糖和1.5％木糖)中生長。生長的培養(yǎng)物在同樣的培養(yǎng)基中亞培養(yǎng)兩次，然后在RMX平板上劃線。較大的克隆在RMX平板上再次劃線。挑選最大的克隆并接種到RMX液體培養(yǎng)基中。生長的培養(yǎng)物于RMX平板再次劃線分離。最后，挑選最大的克隆并使其生長于RMX中。最大的兩個生長菌株分別稱作8b和2/321-2。對其中一個菌株8b作進一步評價。通常情況下，在葡萄糖和木糖的混合物中，以及下面實施例所描述的醋酸鹽存在的情況下，突變體具有更高的利用木糖的能力。
實施例13以下實施例描述了以運動發(fā)酵單胞菌ATCC31821-5C宿主為基礎構建的幾個整合體的發(fā)酵情況。菌株C25和包含質粒菌株31821/pZB作為發(fā)酵評價的對照菌株。
在工作體積為500ml的BioStat-Q發(fā)酵罐和控制pH及溫度的條件下進行發(fā)酵評估。通過滴定KOH(2N)使pH控制在5.5，溫度控制在30℃。發(fā)酵培養(yǎng)基RM包含葡萄糖和木糖的混合物(RMGX(1％∶6％)和RMGX(3.5％∶3.5％))。生長培養(yǎng)基的所有組分都通過無菌過濾母液分別制備，RM(10X)，葡萄糖(50％)，木糖(50％)。對發(fā)酵罐進行高壓滅菌，并在無菌的條件下將生長培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中。在含有200mL培養(yǎng)基RMGX(2％∶2％)的250mL搖瓶中制備接種物。過夜生長后，將培養(yǎng)物離心并在與發(fā)酵培養(yǎng)基相似的10L培養(yǎng)基中濃縮。計算600nm下OD為0.1時開始發(fā)酵所需要的培養(yǎng)物的體積并接種到發(fā)酵罐中。根據需要以一定的時間間隔從發(fā)酵罐中取樣。通過HPLC分析樣品中糖、乙醇以及副產物的量。
在控制pH的發(fā)酵中，所有的菌株都能夠發(fā)酵葡萄糖和木糖生成乙醇，其中菌株8b和2032表現(xiàn)出最好的發(fā)酵能力(圖29和30)。整合菌株8b和2032顯示出與包含質粒菌株31821/pZB5和以宿主39676為基礎的整合體C25相似的能力。
實施例14以下實施例描述了發(fā)酵單胞菌整合體的穩(wěn)定性。將培養(yǎng)物在非選擇性培養(yǎng)基(RMG)中轉移數次，使用含有10mL培養(yǎng)基的15mL的Falcon無菌試管作為進行測試(見圖31)。這些菌株培養(yǎng)于RMG培養(yǎng)基中，經過10代以后每天依次進行轉移。每過40代，將細胞接種到含有2％葡萄糖和2％木糖的搖瓶中，以檢測其發(fā)酵葡萄糖和木糖生成乙醇的能力。乙醇產率和木糖利用速率作為穩(wěn)定性的標志。在溫度為30℃和37℃下，無須選擇，所有的整合體至少在140-160代時都能保持穩(wěn)定(圖32和33)。而包含質粒菌株31821/pZB5在溫度為30℃和37℃下，在40代內就喪失了利用木糖的能力(37℃時的數據示于圖33)。
實施例15以下實施例描述了醋酸濃度對生長和AX101木糖發(fā)酵的影響以及pH的影響作用。醋酸通常存在于預處理的生物飼料的水解產物中，對發(fā)酵微生物有抑制作用。在pH5、pH5.5和pH6.0時進行發(fā)酵，添加或不添加(pH5.5)2g/L的醋酸鹽從而對菌株AX101的發(fā)酵能力進行評價。使用的培養(yǎng)基是RMGXA(4％∶4％∶2％)，并添加所需濃度的醋酸鹽。結果(圖34)表明，2g/L的醋酸鹽對菌株的生長、木糖的利用和乙醇的產生都有抑制作用。與較高pH(pH6.0)相比，pH較低時(pH5.0)，抑制作用更加明顯。
實施例16以下實施例描述了AX發(fā)酵的添加和提取過程。設計一種測試方法，看菌株AX101對醋酸鹽的逐步適應能否提高該菌株在高濃度醋酸鹽的培養(yǎng)基中的發(fā)酵能力。首先，在pH5.5、溫度為30℃時于RMGXA(4％∶4％∶2％)進行間歇發(fā)酵，在沒有醋酸鹽和醋酸鹽為2g/L時進行比較。由于低水平2g/L的醋酸鹽影響糖的利用，因此進行另一項測試，將含有RMGXA(4％∶4％∶2％)并分別添加了0.5g/L和1g/L的醋酸鹽的發(fā)酵罐接種到另一個添加了2g/L醋酸鹽的發(fā)酵罐，其糖濃度相同。結果表明菌株AX101在2g/L醋酸鹽中的糖的利用能力并沒有提高。
實施例17以下實施例描述了AX101的連續(xù)發(fā)酵。連續(xù)發(fā)酵在MultiGen發(fā)酵罐(NewBruswick Scientific，NJ，USA)中進行，工作體積為300mL，攪拌器轉速300rpm。分析所取的pHs為4.5，5和5.5，采用KOH(2N)來控制。溫度始終保持為30℃。間歇發(fā)酵開始時，起始OD在600nm時為0.1。在發(fā)酵過程中，每個周期取一次樣，通過HPLC分析糖、乙醇和副產物的含量。當充分利用葡萄糖并且發(fā)酵罐中的木糖約為10g/L以后，開始連續(xù)發(fā)酵，添加一定糖組成的培養(yǎng)基，稀釋速率(D)低，為0.02(1/hr)。經過4至5個穩(wěn)定狀態(tài)的循環(huán)后，所有的葡萄糖和80％的木糖都被利用，此時提高稀釋速率(圖35)。這一過程一直持續(xù)到洗出階段，通過殘留的木糖濃度升高和乙醇濃度減少顯示出來。用最終乙醇生成的濃度除以最初加入到培養(yǎng)基中的總糖量計算出乙醇產率(Yp)。
菌株AX101能夠在玉米漿培養(yǎng)基中發(fā)酵80g/L葡萄糖、40g/L木糖和15g/L阿拉伯糖的混合物，添加的醋酸鹽只能達到6g/L，此后便觀察到洗出階段。
實施例18以下實施例描述了在高濃度醋酸鹽存在的情況下能夠發(fā)酵葡萄糖和木糖生成乙醇的整合體。醋酸鹽是一種抑制性化合物，通常發(fā)現(xiàn)于預處理的生物飼料的水解產物中。
在有35mL培養(yǎng)基的50mL帶擋板的搖瓶中進行評價，培養(yǎng)基包含添加了不同濃度醋酸鹽的RMGX(2％∶2％)。醋酸鹽添加到培養(yǎng)基RMGX中，用KOH顆粒將pH調解到5.8。在含有100mL培養(yǎng)基RMGX(2％∶2％)的125mL搖瓶中制備接種物，起始pH為5.8，溫度為30℃或37℃。
過夜生長后測量600nm時的OD，600nm下OD為0.1時對每個搖瓶進行接種，并在所需的溫度下于搖床中培養(yǎng)。在不同時間取樣然后用HPLC分析糖、乙醇和副產物的含量。如圖36所示，整合體8b和2032能夠在不控制pH以及培養(yǎng)基中醋酸鹽濃度為2g/L至6g/L時生長并且發(fā)酵木糖生成乙醇。在這些濃度下的醋酸鹽對木糖利用的抑制作用是最小的。
如圖37所示，甚至在醋酸鹽濃度為16g/L和未對培養(yǎng)基的pH進行控制時，所有的整合體都能發(fā)酵葡萄糖和木糖生成乙醇。測量出生長培養(yǎng)基的最終pHs為3.5-4.5之間。前述以39676宿主為基礎構建的菌株如AX101和C25卻受到低濃度如2g/L的醋酸強烈的抑制作用。
實施例19以下實施例描述了在發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶(PDC)啟動子Ppdc的控制下，可以使含有大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶基因ManA的質粒pZB701(圖38)轉化運動發(fā)酵單胞菌菌株39676和31821。
如圖39所示，兩種菌株的轉化體都能夠利用D-甘露糖作為唯一碳源。為了確定ManA得到表達，所有產生的中間構建體和最后構建體(包括pZB801)都用來轉化manA(-)宿主，大腸桿菌GMS407。轉化體接種到以甘露糖為碳源的McConkey瓊脂平板上。深粉紅色菌落表明甘露糖被克隆子利用。從深粉紅色菌落提取的質粒pZB701用來進一步轉化運動發(fā)酵單胞菌206C或者31821。在含有四環(huán)素(Tcr)的結合培養(yǎng)基(MMG)上篩選運動發(fā)酵單胞菌轉化體然后在含有甘露糖(RMM)的培養(yǎng)基中檢測。如圖39所示，所有轉化體初始都能在RMM中生長，經過在RMM中的幾次轉移后，其生長速率提高。
從大腸桿菌JM110制備pZB701用于運動發(fā)酵單胞菌31821的轉化。這些Tcr轉化體也能在RMM中生長。對RMM生長培養(yǎng)物的上清液進行分析，結果表明，39676和31821轉化體都能產生乙醇。
含有甘露糖利用基因的質粒pZB701可以進一步轉化申請人構建的基因組整合的木糖發(fā)酵和阿拉伯糖發(fā)酵菌株，例如以39676和31821宿主菌株為基礎的C25，AX101，AX1，321(5)，481，8b，2032，2122。已經證實了pZB701(含有ManA基因)成功轉化到運動發(fā)酵單胞菌39676和31821中，轉化體發(fā)酵甘露糖生成乙醇。上述發(fā)酵單胞菌整合體可以被質粒pZB701轉化從而獲得能夠發(fā)酵木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖生成乙醇的運動發(fā)酵胞菌菌株。預計轉化的發(fā)酵單胞菌菌株能夠利用生物飼料中的木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖并且能夠發(fā)酵以上所有糖生成乙醇。
雖然通過實施例來描述本發(fā)明，但應該理解，在不背離本發(fā)明實質精神和范圍的情況下可以作任意修改。
權利要求
1.一種利用基因修飾的發(fā)酵單胞菌整合體從戊糖生產乙醇的方法，所述方法包括制備含有編碼一種以上戊糖發(fā)酵酶的序列的發(fā)酵單胞菌整合體，所述戊糖發(fā)酵酶包括木糖異構酶，木酮糖激酶，轉酮酶和轉醛酶；在適當的發(fā)酵條件下，將整合體發(fā)酵單胞菌加入到含有戊糖的原料中；以及發(fā)酵戊糖從而提供包括乙醇的混合物，所述編碼戊糖發(fā)酵酶的序列是通過第一步整合和第二步整合結合到所述整合體發(fā)酵單胞菌中的。
2.如權利要求1所述的方法，其中第一步整合是轉座，第二步整合是同源重組。
3.如權利要求2所述的方法，其中第一步整合包括含有編碼一種以上戊糖發(fā)酵酶序列的第一操縱子的轉座整合。
4.如權利要求3所述的方法，其中第一操縱子包括編碼轉醛酶和轉酮酶的序列。
5.如權利要求3所述的方法，其中第一操縱子進一步包括Penotaltkt或者Pgaptaltkt。
6.如權利要求2所述的方法，其中第二步整合包括含有編碼一種以上戊糖發(fā)酵酶序列的第二操縱子的同源重組。
7.如權利要求6所述的方法，其中第二操縱子進一步包括PgapxylAB。
8.如權利要求6所述的方法，其中第二操縱子包括編碼木糖異構酶和木酮糖激酶的序列。
9.如權利要求1所述的方法，其中發(fā)酵單胞菌整合體是ATCC31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB。
10.如權利要求1所述的方法，其中發(fā)酵單胞菌整合體是ATCC31821-5C Pgaptaltkt/PgapxylAB。
11.如權利要求1所述的方法，其中第一步整合包括同源重組并且第二步整合包括轉座方法。
12.一種制備能夠發(fā)酵含有戊糖的原料并生成乙醇的發(fā)酵單胞菌整合體的方法，所述方法包括對天然發(fā)酵單胞菌菌株實施第一步整合以結合含有編碼戊糖發(fā)酵酶的序列的第一操縱子，從而提供發(fā)酵單胞菌部分整合體；對發(fā)酵單胞菌部分整合體實施第二步整合以結合第二操縱子，所述第二操縱子含有編碼除第一操縱子的酶之外的一種以上的戊糖發(fā)酵酶的序列，從而提供能夠發(fā)酵含有戊糖的原料并生成乙醇的發(fā)酵單胞菌整合體。
13.如權利要求12所述的方法，其中發(fā)酵單胞菌整合體含有編碼至少四種戊糖發(fā)酵酶的序列，所述戊糖發(fā)酵酶包括木糖異構酶、木酮糖激酶、轉酮酶和轉醛酶。
14.如權利要求12所述的方法，其中第一操縱子進一步包括PgapxylAB。
15.如權利要求12所述的方法，其中第二操縱子進一步包括Penotaltkt或者Pgaptaltkt。
16.根據權利要求12的方法制備的能夠發(fā)酵戊糖的發(fā)酵單胞菌整合體。
17.如權利要求12所述的方法，其中發(fā)酵單胞菌整合體是ATCC31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB。
18.如權利要求12所述的方法，其中發(fā)酵單胞菌整合體是ATCC31821-5C Pgaptaltkt/PgapxylAB。
19.一種發(fā)酵單胞菌整合體，其能在每升培養(yǎng)基含有8克醋酸鹽/醋酸的條件下生長。
20.一種用于戊糖發(fā)酵的生物催化劑，其含有權利要求16的發(fā)酵單胞菌整合體。
21.一種能夠發(fā)酵戊糖生成乙醇的發(fā)酵單胞菌整合體，其染色體或天然質粒整合了編碼一種以上戊糖發(fā)酵酶的序列，其中所述整合體至少穩(wěn)定80代。
22.如權利要求21所述的發(fā)酵單胞菌整合體，進一步能在醋酸鹽存在時發(fā)酵戊糖生成乙醇。
23.如權利要求22所述的發(fā)酵單胞菌整合體，進一步能在每升培養(yǎng)基含有8克醋酸鹽/醋酸的條件下發(fā)酵戊糖。
24.如權利要求21所述的發(fā)酵單胞菌整合體，進一步包括編碼甘露糖發(fā)酵酶的序列。
25.發(fā)酵單胞菌整合體Z.Mobilis 8b。
26.發(fā)酵單胞菌整合體Z.Mobilis 2032。
全文摘要
一種能夠發(fā)酵戊糖生成乙醇的發(fā)酵單胞菌整合體。通過兩步整合方法即同源重組和轉座將編碼戊糖發(fā)酵酶的操縱子整合入發(fā)酵單胞菌的基因組內。每種操縱子可以包括一種以上戊糖還原酶的編碼序列。在一些實施例中，整合體包括編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉酮酶和轉醛酶的序列。發(fā)酵單胞菌整合體高度穩(wěn)定，在80－160代時仍保留產生戊糖發(fā)酵酶的活性。整合體還對醋酸鹽的抑制作用具有抗性，即使在每升培養(yǎng)基含有8克醋酸鹽的條件下，整合體仍然表現(xiàn)出足夠的生產乙醇的能力。
文檔編號C12N1/21GK1665919SQ03815229
公開日2005年9月7日 申請日期2003年4月25日 優(yōu)先權日2002年4月27日
發(fā)明者張敏, 周逸珍, 威廉·豪, 克里斯廷·埃迪, 肯特·埃文斯 申請人:米德韋斯特研究院