用于發(fā)酵單胞菌發(fā)酵中污染控制的穩(wěn)定化的二氧化氯的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物學(xué)和發(fā)酵領(lǐng)域。更具體地，開發(fā)了當(dāng)將發(fā)酵單胞菌（Zymomonas) 用作水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中生物催化劑時，利用穩(wěn)定化的二氧化氯在發(fā)酵中控制細(xì)菌污染的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由可再生資源生產(chǎn)燃料乙醇是針對全球的化石燃料短缺、能源成本增加、以及與 大氣二氧化碳含量提高相關(guān)的全球變暖效應(yīng)的一種長期解決方案。來自可再生資源的燃料 乙醇是通過利用生物催化劑的糖的發(fā)酵生產(chǎn)的。當(dāng)前，最廣泛地用于乙醇生產(chǎn)的生物催化 劑是酵母。可發(fā)酵糖最典型地是得自經(jīng)處理的生物材料，包括玉米粒、甜菜和甘蔗。替代性 的豐富的生物材料糖源是纖維素類或木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)。利用物理的、化學(xué)的和/或酶 學(xué)的處理，用于加工纖維素類和木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)，以生產(chǎn)可發(fā)酵糖的方法正在被開發(fā)。
[0003] 在大規(guī)模發(fā)酵過程中維持無菌是困難的，尤其是當(dāng)生物材料被用作碳水化合物源 時。大規(guī)模發(fā)酵過程通常被可能來自經(jīng)處理的生物材料、設(shè)備、工藝用水或其它來源的細(xì)菌 污染。通常，污染性細(xì)菌是乳酸菌（LAB)，如乳桿菌菌種。污染性細(xì)菌通過利用糖和降低主 要產(chǎn)物生物催化劑的效果而使發(fā)酵產(chǎn)物的收率降低。污染性細(xì)菌產(chǎn)生非期望的產(chǎn)物如乙酸 和乳酸，它們增加了培養(yǎng)物中的脅迫條件，導(dǎo)致生物催化劑較差的生長和/或生物催化劑 產(chǎn)物較低的生產(chǎn)。
[0004] 在使用酵母作為生物催化劑，通常以糊料或糖漿用作碳水化合物源，用于燃料 或釀造的乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵中，污染性細(xì)菌（主要是乳酸菌）已經(jīng)成為了問題。由于酵 母和污染性細(xì)菌對一些抗微生物劑的不同敏感度，能夠在酵母發(fā)酵中使用一些抗微生 物劑來控制細(xì)菌。成功地在酵母發(fā)酵中被用于控制LAB污染的抗微生物劑包括青霉素 (Day等人（1954)AgriculturalandFoodChemistry，2:252_258)、維吉霉素（Hynes等 人（1997)J.ofIndustrialMicrobiology&Biotechnology18:284-291;Bischoff等人 (2009)，BiotechnologyandBioengineering103:117-122 ;W02007145857)、啤酒花酸 (US20090042276)、紅霉素、泰樂菌素、四環(huán)素和二氧化氯（FermaSure*;DupontCompany， WilmingtonDE;Fatka，F(xiàn)eedstuffs(2〇〇8 年11月 3 日）第I8 頁）。
[0005] 在WO2007/097874中公開了用（：102氣體處理包含可發(fā)酵碳水化合物和酵母的含 水物流以降低不期望的微生物濃度。在US2009/0061490中公開了用二氧化氯處理來自酵 母乙醇生產(chǎn)過程的酵母漿液以破壞微生物污染物，同時保持酵母活性。在W02007/149450 公開了包含可發(fā)酵糖、種菌（酵母）和用于基本上防止細(xì)菌生長的穩(wěn)定化的二氧化氯的發(fā) 酵方法。在W02011038317公開了使用穩(wěn)定化的二氧化氯保持碳水化合物溶液免于微生物 污染。
[0006] 通過工程化菌株的改進，包括除葡萄糖之外還利用木糖和阿拉伯糖、以及使競爭 性代謝途徑失活，開發(fā)了發(fā)酵單胞菌，作為有效的生物催化劑用于生產(chǎn)乙醇。此外，通過提 高對纖維素類生物質(zhì)水解產(chǎn)物中存在的抑制劑的耐受性，已使發(fā)酵單胞菌適合用于水解產(chǎn) 物發(fā)酵培養(yǎng)基中。然而，使用發(fā)酵單胞菌作為用于乙醇發(fā)酵的生物催化劑顯示了在污染控 制方面另外的挑戰(zhàn)，因為這種生物催化劑與主要的污染物一樣是細(xì)菌。因此抗微生物劑對 酵母和細(xì)菌的不同活性不能夠被用于使用酵母生物催化劑生產(chǎn)乙醇的方法中。
[0007] 仍然存在對在使用細(xì)菌發(fā)酵單胞菌生物催化劑的發(fā)酵中控制細(xì)菌污染的方法的 需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了用于在發(fā)酵中控制細(xì)菌污染的組合物和方法，其中發(fā)酵單胞菌是生 物催化劑。
[0009] 因此，本發(fā)明提供了用于在包含發(fā)酵單胞菌生物催化劑的發(fā)酵過程中控制細(xì)菌污 染的發(fā)酵方法，所述方法包括：
[0010] a)提供生長培養(yǎng)基，所述生長培養(yǎng)基具有被細(xì)菌菌種污染的可能性；
[0011] b)將有效量的穩(wěn)定化的二氧化氯添加至（a)的生長培養(yǎng)基，從而形成穩(wěn)定化的二 氧化氯混合物，其中穩(wěn)定化的二氧化氯混合物的溫度大于約33°C;
[0012] c)在適于發(fā)酵單胞菌細(xì)胞的溫度下，用發(fā)酵單胞菌細(xì)胞接種b)的混合物，以產(chǎn)生 接種的培養(yǎng)液；以及
[0013] d)在適于發(fā)酵單胞菌細(xì)胞生長的條件下，使接種的培養(yǎng)液發(fā)酵；其中細(xì)菌污染在 發(fā)酵期間是受控的。
[0014] 在一個實施例中，發(fā)酵單胞菌是產(chǎn)乙醇生物，并且在該方法的發(fā)酵液中產(chǎn)生乙醇。
[0015] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供了發(fā)酵培養(yǎng)基混合物組合物，其包含：
[0016] a)纖維素類生物質(zhì)水解產(chǎn)物發(fā)酵培養(yǎng)基；和
[0017] b)穩(wěn)定化的二氧化氯。
[0018] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供了糖化反應(yīng)漿液混合物組合物，其包含：
[0019] a)纖維素類生物質(zhì)；
[0020] b)至少一種纖維素酶；和
[0021] c)穩(wěn)定化的二氧化氯。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供了用于在包含發(fā)酵單胞菌生物催化劑的發(fā)酵過程中控 制細(xì)菌污染的發(fā)酵方法，所述方法包括以下步驟：
[0023] a)提供缺乏纖維素類生物質(zhì)水解產(chǎn)物的種子培養(yǎng)基，其選自：i)限定培養(yǎng)基，ii) 包含非纖維素類生物材料糖源的培養(yǎng)基，和iii)澄清的纖維素類生物質(zhì)水解產(chǎn)物；
[0024] b)用發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇生物細(xì)胞接種a)的種子培養(yǎng)基，以形成種子培養(yǎng)物；
[0025] c)使發(fā)酵單胞菌細(xì)胞在b)的種子培養(yǎng)物中生長；
[0026] d)用c)的種子培養(yǎng)物接種糖化反應(yīng)漿液，以產(chǎn)生接種糖化漿液；
[0027] e)將接種糖化漿液與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，以產(chǎn)生發(fā)酵啤酒；以及
[0028] f)在由此產(chǎn)生乙醇的條件下，使發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙醇生物細(xì)胞在發(fā)酵啤酒中生長；
[0029] 其中：
[0030] 穩(wěn)定化的二氧化氯被添加至下列中的至少一者：i)步驟a)的種子培養(yǎng)基；ii)步 驟d)的糖化反應(yīng)漿液；或iii)步驟e)的發(fā)酵培養(yǎng)基；并且
[0031]其中：
[0032] 如果將穩(wěn)定化的二氧化氯添加至步驟a)的種子培養(yǎng)基，則在用發(fā)酵單胞菌產(chǎn)乙 醇生物接種種子培養(yǎng)基之前，將種子培養(yǎng)基在至少約33°C的溫度下保持至少約6小時；并 且
[0033]其中：
[0034] 如果將穩(wěn)定化的二氧化氯添加至步驟d)的糖化反應(yīng)漿液，則在用種子培養(yǎng)物接 種糖化反應(yīng)漿液之前，將糖化反應(yīng)漿液在至少約33°C的溫度下保持至少約8小時；并且
[0035]其中：
[0036] 如果將穩(wěn)定化的二氧化氯添加至步驟e)的發(fā)酵培養(yǎng)基，則在將發(fā)酵培養(yǎng)基與糖 化反應(yīng)漿液混合之前，將發(fā)酵培養(yǎng)基在至少約33°C的溫度下保持至少約8小時；并且
[0037]其中：
[0038] 在發(fā)酵單胞菌細(xì)胞生長期間，包含發(fā)酵單胞菌細(xì)胞的種子培養(yǎng)物、接種糖化漿液 或發(fā)酵啤酒中的任何一者包含小于約5g/L的乳酸。
【附圖說明】
[0039] 圖1示出了在針對木糖利用工程化的發(fā)酵單胞菌中的乙醇發(fā)酵途徑的圖表。
[0040] 圖2是示出發(fā)酵單胞菌細(xì)胞在包含不同量的穩(wěn)定化的二氧化氯（SCD)的MRM3G10 培養(yǎng)基中生長的圖。
[0041] 圖3是示出通過發(fā)酵單胞菌細(xì)胞在水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中生產(chǎn)乙醇的圖，該培養(yǎng)基添 加298mg/kgSCD或未添加SCD，在用發(fā)酵單胞菌細(xì)胞在33°C下接種之前在33°C或47°C下 保持6小時。
[0042]圖4示出了通過發(fā)酵單胞菌細(xì)胞在水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中生產(chǎn)乙醇的圖，該培養(yǎng)基添 加151mg/kg或301mg/kg二氧化氯，并且4(A)中立即接種；或者4(B)中47°C下保持24小 時或48小時之后在33 °C下接種。
[0043] 圖5示出了通過發(fā)酵單胞菌細(xì)胞的乳酸生產(chǎn)（A)和乙醇生產(chǎn)（B)的圖，該發(fā)酵單 胞菌細(xì)胞被接種到由糖化反應(yīng)產(chǎn)生的水解產(chǎn)物中，在糖化開始時將不同量的SCD添加該水 解產(chǎn)物，在47°C、初始pH5.3條件下保持48小時之后在33°C下接種。在另外的樣品中，在 糖化24小時之后添加316mg/kgSCD，在47°C下保持48小時，隨后在33°C下接種。
[0044] 圖6示出了通過發(fā)酵單胞菌細(xì)胞在MRM3G6培養(yǎng)基中生產(chǎn)乙醇的圖，該培養(yǎng)基添加 301mg/kg二氧化氯，并且在33°C保持在19. 5小時或23小時之后接種。
[0045] 圖7示出了通過發(fā)酵單胞菌細(xì)胞在培養(yǎng)基中生產(chǎn)乙醇的圖，該培養(yǎng)基添加301mg/ 1^二氧化氯，并且在47°0保持8、16、24或48小時之后在331：下在接種，其中仏）為水解產(chǎn) 物培養(yǎng)基，并且（B)為MRM3G6培養(yǎng)基。
【具體實施方式】
[0046] 本發(fā)明涉及使用穩(wěn)定化的二氧化氯（SCD)作為用于控制發(fā)酵中的污染細(xì)菌的抗 菌劑，該發(fā)酵利用發(fā)酵單胞菌作為生物催化劑，例如用于制備乙醇。存在于碳水化合物溶液 或漿液中的污染細(xì)菌受到SCD的控制，然而本文發(fā)現(xiàn)SCD對發(fā)酵單胞菌細(xì)胞的生長和生產(chǎn) 有害。開發(fā)了一種用于控制在利用穩(wěn)定化的二氧化氯的發(fā)酵單胞菌發(fā)酵期間的污染的方 法。具體地，將穩(wěn)定化的二氧化氯添加至生長培養(yǎng)基（其可包括發(fā)酵培養(yǎng)基或糖化反應(yīng)漿 液），其保持在大于33°C的溫度下一段時間，隨后降溫至適于發(fā)酵的溫度（如果需要的話）， 并且用發(fā)酵單胞菌細(xì)胞接種，形成發(fā)酵液。如果S⑶混合物保持的溫度高于適于發(fā)酵的溫 度，降溫是需要的。通過允許在添加SCD和用發(fā)酵單胞菌細(xì)胞接種之間經(jīng)歷高溫階段，減輕 了SCD的有害效應(yīng)，使得發(fā)酵單胞菌細(xì)胞能夠有效地生長并產(chǎn)生乙醇。影響所需時間長度 的一個因素是添加SCD的生長培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基的類型、或者是否將SCD添加至糖化反 應(yīng)漿液、以及漿液類型。
[0047] 就用作燃料添加劑而言，這一方法可用于乙醇從可再生的資源的高效生產(chǎn)，將解 決化石添加劑的短缺、降低能源成本和影響全球變暖。
[0048] 下列定義和縮寫用于解釋權(quán)利要求和說明書。
[0049] 如本文所用，術(shù)語"包含"、"包括"、"具有"或"含有"，或者其任何其它變型旨在包 括非排他的包括。例如，包含一系列元素的組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備不必僅 限于那些元素，而可以包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、混合物、工藝、方法、制 品或設(shè)備固有的元素。此外，除非另外特別說明，"或"是指包含性的或，而不是指排他性的 或。例如，以下任何一種情況均滿足條件A或B:A是真實的（或存在的）且B是虛假的（或 不存在的），A是虛假的（或不存在的）且B是真實的（或存在的），以及A和B都是真實 的（或存在的）。
[0050] 同樣，涉及元素或組分例證（即出現(xiàn)）次數(shù)的位于本發(fā)明元素或組分前的不定冠 詞"一個"或"一種"旨在是非限制性的。因此，應(yīng)將"一個"或"一種"理解為包括一個或至 少一個，并且元素或組分的詞語單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)形式，除非有數(shù)字明顯表示單數(shù)。
[0051] 如本文所用，術(shù)語"發(fā)明"或"本發(fā)明"是非限制性術(shù)語，并且不旨在意指本發(fā)明的 任何單獨實施例，而是涵蓋如本說明書和權(quán)利要求所述的所有可能的實施例。
[0052] 如本文所用，用術(shù)語"約"修飾本發(fā)明的成分或反應(yīng)物的數(shù)量時是指數(shù)值量的變 化，它們可能發(fā)生在，例如，典型的測量和用于制備濃縮液或?qū)嶋H使用溶液的液體處理程序 中；這些程序中的偶然誤差中；制造、來源、或用于制備組合物或?qū)嵤┓椒ǖ某煞值募兌鹊?差異中；等。術(shù)語"約"還涵蓋由于相對于由特定起始混合物所得的組合物的不同平衡條件 而不同的量。無論是否通過術(shù)語"約"來修飾，權(quán)利要求包括量的等同量。在一個實施例中，