專利名稱：一種寡養(yǎng)單胞菌及其在降解啶蟲脒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種寡養(yǎng)單胞菌，尤其涉及一種能降解啶蟲脒的寡養(yǎng)單胞菌。
背景技術(shù)：
唳蟲脒(Acetamiprid)屬于氯化煙酰亞胺類新型高效殺蟲劑,于1996年由日本曹達(dá)株式會(huì)社開發(fā)并商品化，是繼吡蟲啉、烯啶蟲胺之后的第三個(gè)新煙堿類殺蟲劑。啶蟲脒是一種新型甲基乙酰胺類殺蟲劑，具有觸殺、胃毒、滲透和內(nèi)吸等殺蟲作用，高效、安全、廣譜，對(duì)半翅目、鱗翅目、鞘翅目等有效，具有活性高、持效期長、用量少、內(nèi)吸性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。啶蟲脒作為一種神經(jīng)性殺蟲劑，是煙酸乙酰膽堿酯酶受體的作用體，能選擇性抑制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的受體，表現(xiàn)出與這一受體的極高競爭性結(jié)合能力，可抑制煙酸乙酰膽堿的傳遞，干擾害蟲的神經(jīng)系統(tǒng)化學(xué)信號(hào)的傳遞，破壞昆蟲中樞神經(jīng)的正常傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致昆 蟲麻痹并最終死亡。隨著對(duì)該殺蟲劑研究的不斷展開，該殺蟲劑的毒性日益顯現(xiàn)。Hassani等在其研究中指出，唳蟲脒低濃度下會(huì)影響蜜蜂對(duì)刺激的靈敏度以及損傷蜜蜂的長期記憶。Kocaman等報(bào)道指出，體外實(shí)驗(yàn)中啶蟲脒顯示出了對(duì)人體外周血淋巴細(xì)胞的基因毒性以及細(xì)胞毒性25-40 u g/ml濃度的啶蟲脒處理24及48小時(shí)，會(huì)顯著誘發(fā)人體外周血淋巴細(xì)胞的姐妹染色單體交換以及染色體畸變，同時(shí)使用30-40ii g/ml啶蟲脒會(huì)顯著誘導(dǎo)細(xì)胞微核的產(chǎn)生，表明了啶蟲脒會(huì)誘發(fā)DNA損傷。因而有必要研究該殺蟲劑高效降解和轉(zhuǎn)化方法，減少其在環(huán)境中殘留，降低對(duì)益蟲及人類危害的目的。微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的酶系對(duì)底物的某一特定部位進(jìn)行有機(jī)反應(yīng)，在微生物體內(nèi)或體外促進(jìn)天然的和人工合成的化學(xué)分子的諸多轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)條 件溫和、專一性強(qiáng)、高效環(huán)保。由于微生物種類繁多、繁殖速度快、代謝能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以考慮使用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)降低農(nóng)殘中啶蟲脒的含量，并轉(zhuǎn)化獲得高值新型農(nóng)藥，減少對(duì)益蟲及人類的潛在危害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效降解啶蟲脒的寡養(yǎng)單胞菌及其在降解啶蟲脒中的應(yīng)用，所述寡養(yǎng)單胞菌能將有毒的啶蟲脒降解為無毒的化合物，保護(hù)了環(huán)境，且使用方法簡單、經(jīng)濟(jì)、無二次污染。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種寡養(yǎng)單胞菌,菌名為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. ) XP,已于2010年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏登記號(hào)為CCTCC NO M 2010375。所述寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. )XP,來源于生產(chǎn)唳蟲脒農(nóng)藥廠的土壤樣品、排污口水樣，經(jīng)富集培養(yǎng)、分離得到。所述寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. )XP,菌落成半透明乳白色或乳白色,菌落濕潤、邊緣整齊，多為規(guī)則圓形菌落，該菌為一株革蘭氏陰性菌，具有極生鞭毛，菌體為短桿狀，長約為Iu m,寬約為0. 5 Ii m,結(jié)果見圖I。使用16S rDNA基因序列分析,結(jié)果顯示該菌與假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)及寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas sp.)細(xì)菌相似性最高，同時(shí)進(jìn)化樹分析結(jié)果指出，該菌與寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)進(jìn)化距離更進(jìn)，結(jié)果見圖2。之后針對(duì)假單胞菌與寡養(yǎng)單胞菌氧化酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的不同設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果指出，該菌為氧化酶反應(yīng)陰性，與寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)反應(yīng)結(jié)果一致。本發(fā)明所述的高效降解唳蟲脒寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP,在添加 lg/L酵母粉的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，菌體初始濃度0D600nm為0. 04，能夠在26小時(shí)的培養(yǎng)過程中將lg/L啶蟲脒降解完全，結(jié)果見圖3。較佳的，所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配方為每IOOOml去離子水中含有13. 3gK2HPO4 *3H20,4g KH2PO4,0. 2gMgS04 *7H20，5ml微量金屬鹽溶液。其中的微量金屬鹽溶液配方為 IOOOmL 0. IM鹽酸溶液中含有0. 05g CaCl2 *2H20,0. 05g CuCl2 *2H20,0. 008g MnSO4 .H2O,0. 004g FeSO4 7H20，0. Ig ZnSO4,0. Ig NaMoO4 2H20，0. 05g NaffO4 2H20。較佳的，所述寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. )XP的培養(yǎng)溫度為30°C,培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所述寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. )XP在高效降解唳蟲脒的同時(shí)，可以將其轉(zhuǎn)化為C7H9N2Cl,該產(chǎn)物為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. )XP脫去啶蟲脒藥效基團(tuán)氰基所得，結(jié)果見圖5，保護(hù)了環(huán)境。


圖I為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP的電鏡照片。圖2為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP16S rDNA基因序列分析比對(duì)結(jié)果。圖3為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. ) XP生長及降解曲線?！?寡養(yǎng)單胞菌菌株生長曲線； 菌株降解曲線。圖4為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. )XP降解及代謝產(chǎn)物鑒定。圖5為代謝產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)不限于下屬的實(shí)施例。實(shí)施例I :寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. ) XP的分離篩選及鑒定I、分離及篩選篩菌使用土樣分別從上海東風(fēng)農(nóng)藥廠以及江蘇克勝集團(tuán)廠區(qū)采集了土樣、排污口水樣以及曝氣池水樣。密封保存后，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。土樣及水樣懸浮處理，洗掉砂石后轉(zhuǎn)接入含有一定濃度啶蟲脒的選擇性培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基(pH 7. 0)中(富集培養(yǎng))中，30°C、200轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)，菌液長濃后，再次轉(zhuǎn)接入新的含有啶蟲脒的選擇性培養(yǎng)基中。按照上述操作，反復(fù)轉(zhuǎn)接三次，每輪轉(zhuǎn)接后菌液_80°C保存，后續(xù)做DGGE分析菌落變化情況。同時(shí)從第三輪篩選過程中挑菌液平板劃線，挑選出長勢較好的單菌落分別培養(yǎng)這些單一菌株，進(jìn)行農(nóng)藥降解實(shí)驗(yàn)，HPLC檢測農(nóng)藥降解情況從中篩選出3-4株較好菌株進(jìn)行后續(xù)的生理生化鑒定，以及代謝途徑的研究。
選擇性培養(yǎng)基如下唯一碳源培養(yǎng)基(gL—1) 13. 3g K2HPO4 *3H20,4g KH2PO4,0. 2gMgSO4 7H20, 5ml無機(jī)鹽混合液，啶蟲脒0. 5g，加蒸餾水至1000ml。待以上培養(yǎng)基混勻后，使用已滅菌微孔濾膜過濾除菌至已滅菌的300ml三角瓶中，每瓶裝入50ml。無機(jī)鹽混合液配方為:0. 05g CaCl2 2H20，0. 05gCuCl2 2H20，0. 008g MnSO4 H2O, ,0. 004g FeSO4 7H20,0. Ig ZnSO4,0. Ig NaMoO4 2H20，和 0. 05g NaffO4 2H20，溶于 IOOOmL 0. IM 鹽酸溶液中。2、菌株的鑒定如圖2所示，使用16S rDNA基因序列分析，結(jié)果顯示該菌與假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)及寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas sp.)細(xì)菌相似性最高，同時(shí)進(jìn)化樹分析結(jié)果指出，該菌與寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)進(jìn)化距離更近。之后針對(duì)假單胞菌與寡養(yǎng)單胞菌氧化酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的不同設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果指出，該菌為氧化酶反應(yīng)陰性，與寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)反應(yīng)結(jié)果一致。該菌株脂肪酸分析的結(jié)果同上述一致。該菌株為革蘭氏陰性菌，具有極生鞭毛，菌體為短桿狀，長約為I U m,寬約為0. 5 y m， 參考圖I。該菌株已于2010年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏登記號(hào)為 CCTCC NO M 2010375。實(shí)施例2 :寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. ) XP對(duì)唳蟲脒農(nóng)藥的降解在添加lg/L酵母粉的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(pH 7. 0)中，啶蟲脒濃度lg/L，30°C，200轉(zhuǎn) /分鐘培養(yǎng)情況下，4%的接種量接種，菌體初始濃度0D600nm為0. 04，該菌在10小時(shí)左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，通過液相色譜鑒定，26小時(shí)啶蟲脒可以完全降解。在生長體系中，隨著啶蟲脒的不斷降解、減少，其降解產(chǎn)物也隨之生成。啶蟲脒在HPLC中出峰時(shí)間在5. 5分鐘左右，降解產(chǎn)物出峰時(shí)間為4. 25分鐘左右，該降解產(chǎn)物為終產(chǎn)物，參考圖3和圖4。無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配方為每1000ml去離子水中含有13. 3g K2HPO4 3H20,4gKH2PO4,0.2gMgS04 7H20, 5ml微量金屬鹽溶液。其中的微量金屬鹽溶液配方為IOOOmL0. IM 鹽酸溶液中含有 0. 05g CaCl2 2H20，0. 05g CuCl2 2H20，0. 008g MnSO4 H20,0. 004gFeSO4 7H20，0. Ig ZnSO4,0. Ig NaMoO4 2H20，0. 05g NaffO4 2H20。實(shí)施例3 :寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp. ) XP對(duì)唳蟲脒農(nóng)藥降解產(chǎn)物鑒定按照實(shí)施例2中的培養(yǎng)方法,培養(yǎng)菌株寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)XP約1L，5500轉(zhuǎn)/分鐘離心7分鐘，取上清，使用SHB-3循環(huán)水多用真空泵真空抽濾后，濾液使用RE52-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，減壓55°C蒸發(fā)濃縮上述液體至約100ml。液體濃縮后為極粘稠液體，然后倒入約IOOml氯仿，搖振萃取，以使?jié)饪s后液體中啶蟲脒代謝物最大程度溶于氯仿中。之后，取氯仿相(分層后下層)，氮吹濃縮。濃縮后氯仿溶解的代謝產(chǎn)物使用TLC薄層層析分離，紫外燈下畫出代謝產(chǎn)物出現(xiàn)的區(qū)域，然后使用手術(shù)刀將硅膠板上有代謝產(chǎn)物的區(qū)域割下。加入適量的TLC展層劑(約IOml)，然后使用KQ-100E型超聲波清洗器超聲處理30分鐘，以使硅膠吸附的代謝產(chǎn)物盡可能多的溶解到展層劑中。取超聲后液體上清，做TLC檢測，以確定代謝產(chǎn)物已溶解到展層劑中。之后N2吹吹干，干后粉末使用l-2ml氯仿溶解，使用0. 22 ii m濾膜過濾，濾液用于氣相、氣質(zhì)聯(lián)用及核磁共振檢測。結(jié)合啶蟲脒GC-MS標(biāo)準(zhǔn)品譜圖及啶蟲脒分子結(jié)構(gòu)圖，由于知道啶蟲脒的分子量為222. 68Da，可以看出質(zhì)譜圖右側(cè)的222Da處峰應(yīng)為分子離子峰，221Da處的峰應(yīng)為啶蟲脒分子被打掉一個(gè)氫原子的結(jié)果，參考圖5。
各主要離子峰對(duì)應(yīng)的啶蟲脒集團(tuán)為Mw = 222. ODa處，為啶蟲脒分子離子峰位置(CltlH11ClN4)，即[M]+ ；Mw = 221. ODa處，為啶蟲脒分子打掉一個(gè)H原子結(jié)果，即[M]+_H+ ；Mw = 207. ODa處，為啶蟲脒分子打掉一個(gè)甲基后結(jié)果，即[M]+_CH3 ；Mw = 181. ODa處，為啶蟲脒分子打掉CH3-CNH之后的結(jié)果，即[M]+-CH3-CNHMw = 166. ODa 處，為[Cl-C5H3N-CH2-N-CN] +Mw = 152. ODa 處，為[Cl-C5H3N-CH2-N-C] + Mw = 141. ODa 處，為[Cl-C5H3N-CH2-N]+H+Mw = 126. ODa 處，為[Cl-C5H3N-CH2] +Mw = 112. ODa 處，為[Cl-C5H3N] +Mw = 67. ODa 處，為[CH3-C = N-C = N] +Mw = 42. ODa 處，為[N_C = N] +2H+由分子離子峰155Da左右可以推斷，該降解產(chǎn)物的分子式為Cl-C5H3N-CH2-NH-CH3,即啶蟲脒結(jié)構(gòu)除掉最右端[CH3-C = N-C = N]結(jié)構(gòu)后的產(chǎn)物。核磁波譜分析其各主要裂分峰如下分子離子峰[M+]° = 156，(符合N規(guī)則)，CL37的同位素峰為158，基本符合3 I的同位素分布。[M+] -H = 155，126 為[M+]_30，即[Cl-C5H3N-CH2]+，113 為 Cl-C5H4N, 78 為 C5H4N, 44為-CH2-NH-CH3。從H譜的各峰歸屬H譜的溶劑峰不知是哪一種，目前把無法確定的4. 6 4. 9的峰暫時(shí)劃歸溶劑H.(可能是CH3OD)。其中8. 3，IH為6-位；7. 8，IH為3-位；7. 4，IH為4-位；3. 73，2H 為-CH2 ；3. 05，IH 為-NH ; I. 9，3H 為-CH3 ;其他可能為 H2O 的氫峰。從C譜來看150可歸屬為2-位C ; 139歸屬為6-位C ; 134歸屬為5-位C ; 130歸屬為4-位C ；124歸屬為3-位；34歸屬為-CH3的C ；47左右可能為溶劑峰(推測可能是CD3OD) ；48 為-CH2 的峰。綜合以上GC-MS以及核磁共振的結(jié)果，可以確定ACE-6-8降解啶蟲脒的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分子式為 Cl-C5H3N-CH2-NH-CH3O
權(quán)利要求
1.一種寡養(yǎng)單胞菌，其特征在于其菌名為寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas sp. XP,已于2010年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC NO M2010375。
2.—種權(quán)利要求I所述寡養(yǎng)單胞菌在降解啶蟲脒中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其中所述寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonassp. XP在添加酵母粉和啶蟲脒的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配方為每IOOOml去離子水中含有 13. 3g K2HPO4 3H20、4g KH2P04、0. 2gMgS04 7H20 和 5ml 微量金屬鹽溶液；所述微量金屬鹽溶液的配方為IOOOmL 0. IM鹽酸溶液中含有0.05g CaCl2 2H20、0. 05gCuCl2 2H20、0. 008g MnSO4 H20,0. 004g FeSO4 7H20、0. Ig ZnSO4,0. Ig NaMoO4 2H20 和0.05g NaffO4 2H20。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中啶蟲脒的濃度為lg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonassp. XP的培養(yǎng)溫度為30°C，
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其中所述寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonassp. XP的培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述酵母粉的濃度為lg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種寡養(yǎng)單胞菌及其在降解啶蟲脒中的應(yīng)用，該菌菌名為寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas sp.XP，已于2010年12月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏登記號(hào)為CCTCC NOM2010375；所述寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas sp.XP能在含酵母粉和啶蟲脒的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將有毒的啶蟲脒降解為無毒的化合物，從而保護(hù)了環(huán)境，且使用方法簡單、經(jīng)濟(jì)、無二次污染。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102747007SQ20121011365
公開日2012年10月24日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者唐鴻志, 李健, 胡海洋, 許平, 陶飛 申請人:上海交通大學(xué)