專利名稱：多重固相核酸擴(kuò)增測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
采用與具有5′核酸酶活性的酶聯(lián)合使用的液相雙標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測核酸序列的擴(kuò)增是本領(lǐng)域公知的(參見，例如，美國專利Nos.5,210,015；5,487,972；5,804,375；和Holland，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1988)887276-80)。在本發(fā)明之前，還沒有在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用攜帶可以由5′-核酸酶活性釋放的標(biāo)記物部分的固定的雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，或者還沒有將其用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的實時監(jiān)測。
仍然需要用于同時檢測多個核酸序列的擴(kuò)增的更有效和更方便的方法。本發(fā)明滿足了該需要和其它需要。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供了檢測靶核酸的方法，該方法包括以下步驟a)提供通過3’末端固定在固體基質(zhì)上的寡核苷酸探針，該探針包含標(biāo)記物部分；b)在探針的存在下在含有具有5′-3′核酸酶活性的酶的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增懷疑含有靶核酸的核酸樣品，其中該探針與靶核酸特異性雜交，使得具有5′-3′核酸酶活性的酶從寡核苷酸探針釋放標(biāo)記物部分，并且檢測到核酸樣品中是否存在靶核酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了同時檢測多個靶核酸序列的方法，該方法包括以下步驟a)提供大量寡核苷酸探針，每個探針通過其3’末端固定在固體基質(zhì)上，每個探針包含相同的標(biāo)記物部分；b)在探針的存在下在含有具有5′-3′核酸酶活性的酶的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增懷疑含有靶核酸的多個核酸樣品，其中每個探針與多個靶核酸之一特異性雜交，使得具有5′-3′核酸酶活性的酶從寡核苷酸探針釋放標(biāo)記物部分，并且檢測到核酸樣品中是否存在靶核酸。在該方法中，從空間上區(qū)分代表靶核酸的熒光的檢測。采用本方法，可以同時檢測至少8、10、12、14、15、16、18、20、50、75、100或更多個靶核酸序列。
在一種實施方案中，標(biāo)記物部分是與探針的5’末端連接的熒光團(tuán)部分，由此熒光團(tuán)部分的釋放導(dǎo)致固定的探針上熒光的減少，從而檢測到核酸樣品中靶核酸的存在。
在一種實施方案中，標(biāo)記物部分是連接于探針的5’末端的猝滅劑部分，并且，固定的探針進(jìn)一步包含位于猝滅劑部分3’的、連接于探針的熒光團(tuán)部分，其中當(dāng)猝滅劑部分連接于探針時，熒光團(tuán)部分不發(fā)出熒光，并且，固定的探針上熒光團(tuán)部分的熒光隨著靶核酸擴(kuò)增的增加而增加，這是因為猝滅劑部分釋放到溶液中。
在一種實施方案中，標(biāo)記物部分是連接于探針的5’末端的猝滅劑部分，并且，固定在鄰近探針的位置的熒光團(tuán)部分的熒光隨著靶核酸擴(kuò)增的增加而增加。例如，熒光團(tuán)部分可以固定在固體基質(zhì)上，或固定在第二核酸(即，第二探針)上，所述第二核酸固定在固體基質(zhì)上足以接近攜帶猝滅劑部分的探針的位置，以便掩蓋熒光團(tuán)的熒光。
在一種實施方案中，擴(kuò)增是通過聚合酶鏈反應(yīng)。在一種實施方案中，具有5′-3′核酸酶活性的酶是具有5′-3′核酸酶活性的DNA聚合酶。
固體基質(zhì)可以是任何能夠承受間歇和重復(fù)的核酸變性溫度(即，80℃-105℃，通常約95℃)，并且保持與固定的探針結(jié)合的材料。優(yōu)選的基質(zhì)允許同時檢測多個核酸序列。在本發(fā)明的不同實施方案中，固體基質(zhì)可以是，例如，多孔板、顯微鏡載玻片、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)管、或平皿。固體基質(zhì)可以是任何多邊形，如圓形、橢圓形、正方形、矩形、三角形、六邊形等。
在一些實施方案中，擴(kuò)增檢測是定量的。在一些實施方案中，擴(kuò)增檢測與擴(kuò)增是同時的(即，“實時”)。在一些實施方案中，擴(kuò)增檢測是定量的并且擴(kuò)增檢測是實時的。在一些實施方案中，擴(kuò)增檢測是定性的(如是否存在靶核酸的終末檢測)。在一些實施方案中，擴(kuò)增檢測在擴(kuò)增后進(jìn)行。在一些實施方案中，擴(kuò)增檢測是定性的，并且擴(kuò)增檢測在擴(kuò)增后進(jìn)行。
在一些實施方案中，熒光團(tuán)部分選自熒光素家族染料、多鹵熒光素家族染料、六氯熒光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料和BODIPY家族染料。
在一些實施方案中，猝滅劑部分選自熒光素家族染料、多鹵熒光素家族染料、六氯熒光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、BODIPY家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料、低熒光猝滅劑部分(即，“暗淡的供體”)和非熒光猝滅劑部分(如，稱作“暗猝滅劑”，包括Black Hole QuenchersTM(BHQ))。
在一種實施方案中，熒光團(tuán)部分是熒光素家族染料，猝滅劑部分是花菁家族染料。在一種實施方案中，熒光團(tuán)部分是熒光素家族染料，猝滅劑部分是六氯熒光素家族染料。在一種實施方案中，熒光團(tuán)部分是六氯熒光素家族染料，猝滅劑部分是花菁家族染料。在一種實施方案中，猝滅劑是暗猝滅劑，例如，BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3(BiosearchTechnologies，Novato，CA)。在一種實施方案中，熒光團(tuán)部分是熒光素家族染料或花菁家族染料，猝滅劑部分是暗猝滅劑。
另一方面，本發(fā)明提供了包含以下成分的反應(yīng)混合物i)通過3’末端固定在固體基質(zhì)上的寡核苷酸探針，該探針包含標(biāo)記物部分，該標(biāo)記物部分由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放；ii)用于擴(kuò)增靶核酸的試劑，其中所述探針與靶核酸內(nèi)的序列雜交。
另一方面，本發(fā)明提供了包含以下成分的試劑盒i)通過3’末端固定在固體基質(zhì)上的寡核苷酸探針，該探針包含標(biāo)記物部分，該標(biāo)記物部分由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放；ii)用于擴(kuò)增靶核酸的試劑，其中所述探針與靶核酸雜交。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含至少一個通過3’末端固定在固體基質(zhì)上的寡核苷酸探針的固體基質(zhì)，所述至少一個探針包含由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放的標(biāo)記物部分。
本發(fā)明也涉及用于進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增的裝置，該裝置包含至少一個通過3’末端固定在固體基質(zhì)上的寡核苷酸探針，所述至少一個探針包含由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放的標(biāo)記物部分。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增的裝置，該裝置包含用于容納固體基質(zhì)的空間，所述固體基質(zhì)包含至少一個通過3’末端固定在固體基質(zhì)上的寡核苷酸探針，所述至少一個探針包含由具有5′-3′核酸酶活性的酶釋放的標(biāo)記物部分。
反應(yīng)混合物、試劑盒和裝置的實施方案與方法的實施方案相同。


圖1圖示了固體基質(zhì)平皿陣列。(1)陣列組件；(2)流液口；(3)通道；(4)室；(5)體；(6)密封壁；(7)陣列基質(zhì)；和(8)光學(xué)窗。
圖2圖示了密封壁上的固體基質(zhì)平皿陣列。
圖3圖示了組裝的固體基質(zhì)平皿陣列。
具體實施例方式
1.導(dǎo)言如此處所示，用固定的雙標(biāo)記的探針得到擴(kuò)增生長曲線，幾乎不需要或不需要聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的修飾。此外，從固定的雙標(biāo)記的探針得到的循環(huán)閾值(Ct)的測量值與用液相的雙標(biāo)記的抗體獲得的那些相似。由固定的探針進(jìn)行的靶核酸的捕獲速度可以與液相擴(kuò)增反應(yīng)的速度競爭。
如下文所示，寡核苷酸探針的固定使得能夠同時進(jìn)行多個核酸擴(kuò)增反應(yīng)的實時分析。目前的多重分析需要使用多種染料和猝滅劑的組合，并且通常由單個儀器上可利用的激發(fā)和檢測系統(tǒng)限制到每個樣品約6個同時的反應(yīng)。采用本發(fā)明，通過二維陣列上雙標(biāo)記的寡核苷酸探針的空間分布，可以用單一的染料和猝滅劑組合實現(xiàn)多重測定。因此，每個樣品的分析數(shù)目受到進(jìn)行多重擴(kuò)增反應(yīng)和設(shè)計具有足夠選擇性的探針的能力的限制。采用本發(fā)明，可以在單一反應(yīng)中同時監(jiān)測多個同時進(jìn)行的反應(yīng)。
2.縮寫在本說明書中通篇使用的縮寫是指包含特定核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列是常規(guī)的一字母縮寫。因此，當(dāng)包含在DNA中時，天然存在的編碼核苷酸的脫氧核糖核苷的縮寫如下脫氧腺苷(dA)、脫氧鳥苷(dG)、脫氧胞苷(dC)和脫氧胸苷(dT)。核糖核苷的縮寫如下腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)和尿苷(U)。核苷酸堿基的縮寫如下腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。同樣，除非特別指出，以一系列一字母縮寫表示的核酸序列是以5′-＞3′的方向列出的。
3.定義“擴(kuò)增反應(yīng)”是指任何導(dǎo)致模板核酸序列的拷貝數(shù)增加或?qū)е卤砻髂０宕嬖诘男盘栐黾拥姆磻?yīng)(如化學(xué)、酶促或其它類型的反應(yīng))。擴(kuò)增反應(yīng)包括，例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(參見，美國專利4,683,195和4,683,202；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications(Innis et al.，eds，1990))、鏈置換擴(kuò)增(SDA)(Walker，et al Nucleic Acids Res.20(7)1691-6(1992)；Walker PCRMethods Appl 3(1)1-6(1993))、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(Phyffer，et al.，J.Clin.Microbiol.34834-841(1996)；Vuorinen，et al，J.Clin.Microbiol.331856-1859(1995))、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)(Compton，Nature 350(6313)91-2(1991)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)(Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)75-99(1999))；Hatch et al.，Genet.Anal.15(2)35-40(1999))和Q-Beta復(fù)制酶(Lizardi et al.，Bio/Technology 61197(1988))。
本文用到的“用于擴(kuò)增的試劑”或“擴(kuò)增試劑”可互換使用，是指本領(lǐng)域技術(shù)人員通常在擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)容器中包括的試劑。例如，典型的聚合酶鏈反應(yīng)中位于引物上游和下游的試劑可以包括，但不限于，至少一個模板、脫氧核糖核苷三磷酸(包括dATP、dCTP、dGTP、TTP、dUTP)、聚合酶、緩沖液、金屬陽離子和鹽?；诤怂嵝蛄械臄U(kuò)增(NASBA)反應(yīng)可以包括引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H和DNA聚合酶。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)反應(yīng)可以包括引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶。鏈置換擴(kuò)增(SDA)反應(yīng)可以包括修飾的核苷酸和限制性內(nèi)切核酸酶。某些擴(kuò)增反應(yīng)也可以包括脫氧尿苷N-糖基化酶(UNG)作為輔助的擴(kuò)增試劑(如Amperase，Roche Molecular Sciences，Alameda，CA)(參見，Kleiboeker，Virol J(2005)1129)。
本文使用的“樣品”是指任何含有或推斷含有靶核酸的物質(zhì)。樣品可以是天然或合成來源，并且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法獲得。樣品可以是分離自一個或多個個體的組織或體液的樣品，所述組織或體液包括，但不限于，例如，皮膚、血漿、血清、全血、腦脊液、精子、精液、淋巴液、滑液、尿、淚、血細(xì)胞、器官、腫瘤、支氣管-肺泡灌洗液，所述樣品也指體外細(xì)胞培養(yǎng)成分(包括，但不限于細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長導(dǎo)致的條件培養(yǎng)基、重組細(xì)胞和細(xì)胞成分)的樣品?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的任何程序從生物樣品獲得核酸。
本文使用的術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指引物、探針、待檢測的寡聚物片段、寡聚物對照和未標(biāo)記的封閉寡聚物，通常指多脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)的線性聚合物，以及嘌呤或嘧啶堿基，或修飾的嘌呤或嘧啶堿基的其它任何N-糖苷類似物。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可含有磷酸二酯鍵或經(jīng)過修飾的鍵，包括，但不限于磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲酯、acetamidate、氨基甲酸酯、硫醚、橋聯(lián)氨基磷酸酯、橋聯(lián)亞甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯(lián)硫代磷酸酯或砜，以及這些鍵的組合。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括5個生物學(xué)存在的堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或除了這5個堿基以外的其它堿基。這些堿基可能具有多種用途，例如，使雜交穩(wěn)定或不穩(wěn)定；促進(jìn)或抑制探針降解；或者充當(dāng)連接可檢測部分或猝滅劑部分的連接點(diǎn)。例如，本發(fā)明的多核苷酸可含有一個或多個修飾的、非標(biāo)準(zhǔn)或衍生的堿基部分，包括但不限于N6-甲基-腺嘌呤、N6-叔丁基-芐基-腺嘌呤、咪唑、取代的咪唑、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-Dmannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine，2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶(即胸腺嘧啶)、尿嘧啶-5-羥乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w，2，6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶。修飾的、非標(biāo)準(zhǔn)或衍生的堿基部分的其它實例可參見被完整引入本文作為參考的美國專利Nos.6,001,611、5,955,589、5,844,106、5,789,562、5,750,343、5,728,525和5,679,785。
此外，核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包括一個或多個經(jīng)過修飾的糖部分，包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
本發(fā)明不希望受限于核酸、多核苷酸或寡核苷酸的來源。核酸、多核苷酸或寡核苷酸可來源于人類或非人類的哺乳動物，或其它任意生物體，或者來源于體外合成或通過化學(xué)方法合成的任意重組來源。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、鎖定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、雜合體或它們的任意混合物，并可能以雙鏈、單鏈或部分雙鏈形式存在。核酸還可以是美國專利5,696,248所描述的衍生核酸。本發(fā)明的核酸包括純化或未純化形式的核酸及其片段，包括諸如微生物，例如細(xì)菌、酵母、病毒、類病毒、霉、真菌、植物、動物、人類等的生物學(xué)材料的基因、染色體、質(zhì)粒，基因組。
術(shù)語核酸、多核苷酸和寡核苷酸的長度無特定的差別，且這些術(shù)語均可互換使用。這些術(shù)語包括雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA。本發(fā)明的寡核苷酸可以用作引物和/或探針。
本文所用術(shù)語“殘基”指上文所定義核酸內(nèi)的核苷酸或堿基。不加限制的話，殘基可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意核苷酸，包括上述所有生物學(xué)存在的核苷酸和非生物學(xué)存在的核苷酸。
術(shù)語“引物”指能夠在特定條件下，沿模板核酸鏈充當(dāng)多核苷酸合成起始點(diǎn)的寡核苷酸，所述特定條件即允許合成與所述模板鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。該引物可從重組來源中獲得，形式為純化的限制片段，或者通過合成方法制備而得。引物延伸條件典型地包括在合適的溫度下，在合適的緩沖液(“緩沖液”可以包括本身是輔因子或影響pH、離子強(qiáng)度等的替代物)中含有四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸和具有聚合活性的試劑，諸如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。該引物優(yōu)選在擴(kuò)增中效率最高的單鏈。本發(fā)明的引物可能含有，例如5-500個核苷酸，在某些實施方案中，將含有至少10、20、30、25、30、40、50、75或100個核苷酸和/或含有少于500、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、25或20個的核苷酸。
術(shù)語“雜交”指單鏈核酸或雙鏈核酸的局部單鏈區(qū)域與具有互補(bǔ)序列的另一個單鏈核酸或雙鏈核酸的局部單鏈區(qū)域的結(jié)合。就本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，兩條核酸鏈并不需要完全互補(bǔ)便可彼此雜交。根據(jù)雜交條件，核酸可與其互補(bǔ)序列雜交，即使兩條鏈或其中的一條鏈中存在較少、若干或許多錯配、缺失或添加的情況也可雜交。在某些實施方案中，正如下文所定義的，本發(fā)明的引物和探針可以選擇性地與至少部分互補(bǔ)的核酸雜交。在某些實施方案中，本發(fā)明的引物和探針可在下文定義的嚴(yán)格條件下與至少部分互補(bǔ)的序列雜交。
本文所用術(shù)語“嚴(yán)格”或“嚴(yán)格條件”正如本領(lǐng)域所熟知的，指低離子強(qiáng)度和高溫度的雜交條件；參見，例如Maniatis等人于1989年出版的第2版分子克隆實驗室手冊；J.Wiley & Sons publ.，NewYork 1988年出版的Ausubel等人編輯的Current Protocols inMolecular Biology和Tijssen在1993的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面的技術(shù)-與核酸探針的雜交中的“雜交原理綜述和核酸試驗方案”。通常，所選嚴(yán)格條件比特定序列在定義的離子強(qiáng)度和pH條件下的熱解鏈溫度(Tm)低大約5-30℃。可選地，所選嚴(yán)格條件比特定序列在定義的離子強(qiáng)度和pH條件下的熱解鏈溫度(Tm)低大約5-15℃。Tm指在與靶互補(bǔ)的探針中，處于平衡狀態(tài)時有50％的探針與靶序列雜交的溫度(在定義的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度條件下)(即當(dāng)靶序列過量存在時，在Tm條件下，處于平衡狀態(tài)時50％的探針被占用)。例如，嚴(yán)格雜交條件可以如下，其中在大約pH 7.0到大約pH 8.3的條件下，鹽濃度小于大約1.0M鈉(或其它鹽)離子，典型地為大約0.01到大約1M鈉離子濃度，且對短探針(例如具有10-50個核苷酸)而言，溫度至少為大約25℃，對長探針(例如具有多于50個的核苷酸)而言，溫度至少為大約55℃。嚴(yán)格條件還可通過加入諸如甲酰胺的雜交去穩(wěn)定劑而得以改變。
本文所用術(shù)語“選擇性”或“選擇性條件”指適用于本發(fā)明引物和/或探針的雜交條件，所述條件可實現(xiàn)對樣品中的可檢測的靶核酸進(jìn)行的擴(kuò)增、檢測和/或定量，所述樣品可能含有其它非靶核酸。
本文所用的核酸序列的“互補(bǔ)序列”指處于反平行結(jié)合狀態(tài)的寡核苷酸，即當(dāng)其與所述核酸序列進(jìn)行比對時，一個序列的5’末端可與另一個序列的3’末端配對。核酸序列的互補(bǔ)序列無需與該序列的每一個核苷酸都準(zhǔn)確配對；穩(wěn)定的雙鏈體可能含有錯配堿基對或未配對堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)經(jīng)驗考慮許多變量，包括例如所述寡核苷酸的長度、該寡核苷酸的堿基組成和序列、離子強(qiáng)度、錯配堿基對的發(fā)生率的影響，確定雙鏈體的穩(wěn)定性。
核酸雙鏈體的穩(wěn)定性是通過解鏈溫度或“Tm”而得以確定的。特定核酸雙鏈體在特定條件下的Tm是一半的潛在堿基對解離的溫度。
本文所用術(shù)語“探針”指可與靶核酸的一個區(qū)域形成雙鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，而形成雙鏈結(jié)構(gòu)的原因是該探針的至少一個亞序列與靶核酸中的亞序列具有互補(bǔ)性。優(yōu)選的探針不包括與引物序列互補(bǔ)的序列。如下所述，該探針可以是標(biāo)記或未標(biāo)記的。該探針的3’末端可以被“封閉”，以阻止該探針摻入引物延伸產(chǎn)物中。“封閉”可通過利用非互補(bǔ)堿基或通過將諸如生物素或磷酸基團(tuán)的化學(xué)部分加入最后一個核苷酸的3’羥基中而得以實現(xiàn)，根據(jù)所選部分的不同，封閉可能具有雙重用途，即還充當(dāng)標(biāo)記，可用于后續(xù)檢測或捕獲與該標(biāo)記相連的核酸。封閉還可通過除去上述3’羥基或通過利用無3’羥基的核苷酸，諸如雙脫氧核苷酸而得以實現(xiàn)。
“探針的5’末端”是指由具有5’核酸酶活性的酶消化的本發(fā)明的固定的探針的部分。
“探針的3’末端”是指在暴露于具有5’核酸酶活性的酶之后保持連接于固體基質(zhì)的本發(fā)明的固定的探針的部分。
術(shù)語“標(biāo)記物部分”是指在暴露于具有5’核酸酶活性的酶時可以從本發(fā)明的固定的探針釋放的化合物。如下文所述，標(biāo)記物部分可以是熒光部分或猝滅劑部分。在某些實施方案中，標(biāo)記物部分可以是非熒光可檢測部分，例如，放射性同位素(如3H、32P、125I)、生物素或生物素結(jié)合部分(如親和素、鏈親和素、neutravidin等)。
本文可互換使用的術(shù)語“熒光部分”或“熒光團(tuán)部分”是指可在特定條件下發(fā)射光的化學(xué)部分，該條件即適用于該特定部分的條件。典型地，特定的熒光部分或熒光團(tuán)部分可在吸收較短波長的光之后發(fā)射特定波長的光。由特定熒光部分發(fā)射的光的波長是該部分的特征。因此，可在利用較短波長的光激發(fā)特定熒光部分之后，通過檢測合適波長的光，以檢出該熒光部分?？蓱?yīng)用于本發(fā)明方法和組合物的熒光部分的實例包括，但不限于熒光素家族染料、多鹵熒光素家族染料、六氯熒光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料和BODIPY家族染料。
本文所用術(shù)語“猝滅劑部分”指可在特定條件下吸收熒光部分所發(fā)射能量的化學(xué)部分，所述特定條件即當(dāng)該猝滅劑部分充分接近熒光部分，例如當(dāng)該猝滅劑和熒光部分與同一多核苷酸相連時。該現(xiàn)象在本領(lǐng)域通常被稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(“FRET”)。猝滅劑部分可再次發(fā)射從熒光部分吸收的能量，形成該猝滅劑部分的特有信號，因此猝滅劑也可以是“熒光部分”?；蛘?，猝滅劑部分可能在加熱時或其它非放射性過程中將從熒光部分吸收的能量散失?？蓱?yīng)用于本發(fā)明方法和組合物的猝滅劑部分的實例包括，但不限于熒光素家族染料、多鹵熒光素家族染料、六氯熒光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、BODIPY家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染料、低熒光猝滅劑部分(即，“暗淡的供體”)和非熒光猝滅劑部分(如，稱作“暗猝滅劑，包括Black HoleQuenchersTM(BHQ))。
本文所定義的“5’-3’核酸酶活性”或“5’核酸酶活性”指可以序貫方式將核苷酸從寡核苷酸5’末端除去的酶活性。該5’核酸酶活性優(yōu)選是5’-3’外切核酸酶活性，但也可以是5’-3’內(nèi)切核酸酶活性。例如，許多模板特異性核酸聚合酶表現(xiàn)的是通常與某些DNA聚合酶相關(guān)的5’-3’外切核酸酶活性，(即大腸桿菌DNA聚合酶I具有該活性，而大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段則無該活性)。5’-3’外切核酸酶活性還可從底物核酸的5’末端開始裂解多于一個的磷酸二酯鍵(核苷酸)。雖然無意受限于任何特定的操作理論，對導(dǎo)致探針釋放裂解的寡核苷酸片段這一方面而言，與DNA聚合酶相關(guān)的5’-3’外切核酸酶活性仍然被認(rèn)為取決于所述探針的特定核苷酸組成。例如，在所述寡核苷酸與模板核酸二者的核苷酸之間，尤其是出現(xiàn)在所述寡核苷酸5’末端處的匹配或錯配數(shù)目可影響該活性，正如例如，Holland et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-80所描述的。5’核酸酶反應(yīng)基于美國專利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015的描述。
與靶核酸進(jìn)行的探針和引物雜交內(nèi)容中的術(shù)語“鄰近”指所述引物相對于所述探針在模板核酸的相同或互補(bǔ)鏈上的定位。所述引物和探針可能被多于大約150個的核苷酸、多于大約125個的核苷酸、多于大約100個的核苷酸、多于大約80個的核苷酸、多于大約60個的核苷酸、多于大約50個的核苷酸、多于大約40個的核苷酸、多于大約30個的核苷酸、多于大約20個的核苷酸、大約1到大約20個核苷酸、大約1到大約10個核苷酸分隔開，或者可能直接地彼此相鄰而不重疊。在某些實施方案中，探針與引物隔開大約1到大約10個核苷酸。通常，探針可能與待擴(kuò)增序列任意位置，即引物下游的可靶核酸雜交，從而使引物延伸可以確定聚合酶的位置，進(jìn)而得以斷裂該探針。
在“在鄰近固定的探針的位置上固定的熒光團(tuán)部分”的內(nèi)容中使用的術(shù)語“鄰近”是指固定的熒光團(tuán)部分的位置。在鄰近固定的探針的位置上固定的熒光團(tuán)部分與連接于固定的探針的5’末端的猝滅劑部分足夠接近，使得熒光被掩蓋。在鄰近固定的探針的位置上固定的熒光團(tuán)部分可以通常通過連接部分連接于例如另一核酸或固體基質(zhì)本身，所述另一核酸連接于固體基質(zhì)。
術(shù)語“熱穩(wěn)定核酸聚合酶”指與例如大腸桿菌來源的核苷酸聚合酶相比，對熱相對穩(wěn)定并可催化核苷三磷酸的聚合作用的酶。通常，這種酶是從被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為嗜熱的生物體中獲得。該酶通常會在已退火至引物結(jié)合序列的引物的3’末端處開始合成，并將繼續(xù)向模板的5’末端合成新鏈。如果該聚合酶具有5’-3’核酸酶活性，它可以水解已退火至模板的間插探針，以釋放已標(biāo)記和未標(biāo)記的探針片段，直到聚合作用終止或所有探針片段與待檢測的核酸解離為止。美國專利4,889,818描述了分離自棲熱水生菌(Taq)的代表性熱穩(wěn)定酶，Saiki etal.，1988，Science 239487-91描述了將其應(yīng)用于常規(guī)PCR的方法。另一種代表性的熱穩(wěn)定酶包括棲熱菌種Z05 DNA聚合酶。參見例如美國專利5,674,738。
Taq DNA聚合酶具有DNA合成依賴型鏈置換5’-3’外切核酸酶活性(參見Gelfand在Stockton Press，N.Y.(1989)出版和Erlich編輯的“PCR技術(shù)原理及其在DNA擴(kuò)增方面的應(yīng)用“第2章中的“TaqDNA聚合酶”)。因此，當(dāng)探針未與模板DNA結(jié)合時，Taq DNA聚合酶不會降解該探針。
為確定兩個核酸序列的“互補(bǔ)性百分率”或“同一性百分率”，對這兩個序列進(jìn)行比對，以獲得最優(yōu)比較結(jié)果(例如，可將空位導(dǎo)入第一個核酸序列中，用于與第二個核酸序列進(jìn)行最優(yōu)比對)。接著比較相應(yīng)核苷酸位置上的核苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€序列中的一個位置被與第二個序列中相應(yīng)位置上的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸占據(jù)時，這兩個分子在該位置上是互補(bǔ)的。同樣，當(dāng)?shù)谝粋€序列中的一個位置被與第二個序列中相應(yīng)位置上的相同核苷酸占據(jù)時，則這兩個分子在該位置上是一致的。這兩個序列的互補(bǔ)性百分率(或同一性百分率)是被比較的總位置數(shù)目除這兩個序列所共有的互補(bǔ)位置(或一致位置)數(shù)目后所獲結(jié)果的函數(shù)(即％互補(bǔ)性＝互補(bǔ)重疊位置數(shù)目/較短核苷酸的總位置數(shù)目×100％；和％同一性＝一致重疊位置數(shù)目/較短核苷酸的總位置數(shù)目×100％)。
對兩個序列之間的同一性百分率的測定還可利用數(shù)學(xué)算法實現(xiàn)。被用于比較兩個序列的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選非限制性實例是Karlin和Altschul于1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.872264-2268公開的算法，以及Karlin和Altschul于1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.905873-5877公開的改良算法。這種算法被合并進(jìn)Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215403所公開的NBLAST程序中。
如無另外指明，本發(fā)明的實踐將應(yīng)用到屬于本領(lǐng)域技術(shù)范疇的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)技術(shù)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得到了完整闡釋。參見例如Sambrook et al.，2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；和a series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)。
“大量”是指兩個或多個。
4.寡核苷酸探針另一方面，本發(fā)明提供了包含用于檢測靶核酸的可以釋放的標(biāo)記物部分的固定的探針。該探針可以不受限制地是能夠用于鑒定本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的靶核酸的存在的核酸探針。典型地，探針包含與靶核酸的區(qū)域雜交的核苷酸序列，所述區(qū)域與引物雜交的區(qū)域不同。典型地，探針通過其3’末端固定于固體基質(zhì)。
所述探針的核苷酸序列可具有任意長度，該長度足以特異性結(jié)合待檢測的靶核酸。在某些實施方案中，所述探針具有至少大約6個核苷酸。在某些實施方案中，所述探針具有少于大約140個的核苷酸。在某些實施方案中，所述探針的長度可以是大約18到大約45個、大約25到大約35個或大約25到大約30個核苷酸?？蓪υ撎结樀拈L度和組成進(jìn)行選擇，以提供充分的熱動力學(xué)穩(wěn)定性，進(jìn)而確保該探針與靶核酸在合適反應(yīng)條件下的雜交，該反應(yīng)條件則取決于待實施的檢測方法。通常設(shè)計的探針具有比引物的解鏈溫度(Tm)高的Tm。具有修飾的、非標(biāo)準(zhǔn)或衍生核苷酸的探針可能比具有常規(guī)核苷酸的探針長或短，卻仍具有類似的熱動力學(xué)雜交特性。這種非標(biāo)準(zhǔn)堿基的實例可參見美國專利6,320,005、6,174,998、6,001,611和5,990,303。另一個實例是，與具有富含A/T序列且長度相似的探針相比，具有富含G/C序列的探針可能在較高溫度下退火至靶序列。
在所述探針的核苷酸序列中，與可檢測核酸雜交的部分典型地與該可檢測核酸中被所述探針雜交的區(qū)域一致或互補(bǔ)。不過，探針的該部分與可檢測的靶核酸中被該探針雜交的區(qū)域的序列同一性或互補(bǔ)性可小于100％。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述探針中與可檢測的靶核酸雜交的部分的核苷酸序列可以與可檢測的靶核酸中被該探針雜交的區(qū)域具有大約99％、大約98％、大約97％、大約96％、大約95％、大約90％、大約85％或大約80％的互補(bǔ)性或同一性。本發(fā)明的固定的探針特別適于基因型分析、單核苷酸多態(tài)性和其它堿基對錯配分析。采用固定的、標(biāo)記的探針，使得能夠進(jìn)行與常規(guī)線性陣列相比高度靈敏的單堿基區(qū)分，這是因為錯配堿基對和內(nèi)部標(biāo)記物部分的累積的去穩(wěn)定作用。
本發(fā)明的核酸探針可額外包括并非來源于靶核酸并且/或者不與靶核酸雜交的其它核酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對這些額外核酸序列進(jìn)行選擇，使所述探針具有預(yù)期的功能性。例如，所述核酸探針可包括能使檢測方法改進(jìn)的額外序列。可包括額外核酸序列或可通過其它方法被調(diào)整用于本發(fā)明探針、方法和試劑盒的探針實例可參見美國專利6,323,337、6,248,526、6,150,097、6,117,635、6,090,552、5,866,336和5,723,591。
除了上述探針核苷酸序列，所述探針還可包括不抑制本發(fā)明方法的額外核苷酸序列或其它部分。在本發(fā)明的簡便實施方案中，所述探針可包括有助于實施本發(fā)明方法的額外核苷酸序列。所述探針內(nèi)可存在特定部分，以使該探針或探針片段與所述核苷酸序列的雜交穩(wěn)定或不穩(wěn)定。例如，寡聚T接頭可以用于促進(jìn)雜交。本發(fā)明的探針還可包括上文定義的修飾的、非標(biāo)準(zhǔn)或衍生的核苷酸。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法制備本發(fā)明的核酸探針，不受任何限制。具體地，上文所述的制備本發(fā)明的核酸引物的方法也可以用于制備本發(fā)明的核酸探針。
可通過多種技術(shù)使一個或多個標(biāo)記物部分與探針直接或間接相連。在一些實施方案中，標(biāo)記物部分位于探針的5’末端(即，探針的被具有5’核酸酶活性的酶消化的末端)、位于探針的核苷酸序列內(nèi)部、或連接于多種大小的間隔臂或組合物，以促進(jìn)信號相互作用。典型地，標(biāo)記物部分是通過非核苷接頭連接，而不是連接于核苷堿基。利用通過商業(yè)渠道獲得的亞磷酰胺試劑，可借助于經(jīng)過適當(dāng)保護(hù)的亞磷酰胺制備在任一末端具有官能團(tuán)(例如硫醇或伯胺)的寡核苷酸，并可采用例如PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，ed.byInnis et al.，Academic Press，Inc.，1990中描述的方法使其連接標(biāo)記物部分。
美國專利4,914,210描述了導(dǎo)入寡核苷酸官能化試劑的方法，可將一個或多個巰基、氨基或羥基部分導(dǎo)入所述寡核苷酸探針序列中，典型地導(dǎo)入在該序列的5’末端。使包括熒光部分在內(nèi)的標(biāo)記物部分猝滅劑部分或非熒光可檢測部分與探針相連的其它方法可參見美國專利5,118,802。當(dāng)然，將標(biāo)記物部分連接或綴合于探針的方法依賴于使用的標(biāo)記物部分的類型和標(biāo)記物部分在探針上的位置。
在某些實施方案中，一個或多個標(biāo)記物部分可與探針的5’末端相連。在另一些實施方案中，一個或多個標(biāo)記物部分可在探針的5’末端內(nèi)，例如，距探針5’末端位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大約35或大約40個殘基內(nèi)的殘基位置上與探針相連。在某些實施方案中，一個或多個標(biāo)記物部分可與探針的3’末端相連。在另一些實施方案中，所述一個或多個標(biāo)記物可在探針的5’末端內(nèi)，例如，距探針3’末端位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大約35或大約40個殘基內(nèi)的殘基位置上與探針相連。該一個或多個標(biāo)記物部分可與探針殘基的任意部分相連。例如，一個或多個標(biāo)記物部分可與探針中核苷酸的糖、磷酸或堿基部分相連。在另一些實施方案中，所述一個或多個標(biāo)記物部分可連接在探針的兩個殘基之間。
在本發(fā)明的某些實施方案中，可以用一個以上的標(biāo)記物部分標(biāo)記探針。在某些所述實施方案中，可以分別將每個標(biāo)記物部分與探針的不同堿基連接。在其它實施方案中，可以將一個以上的標(biāo)記物部分與探針的相同堿基連接。
在某些實施方案中，固定的探針包含熒光部分。不受限制地，熒光部分可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意熒光部分。通常優(yōu)選具有寬斯托克斯頻移的熒光部分，從而可以應(yīng)用具有濾波器的熒光計，而不是單比色計，并提高檢測效率。在某些實施方案中，所述熒光部分可選自熒光素家族染料(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA)、多鹵熒光素家族染料(ABI，F(xiàn)oster City，CA)、六氯熒光素家族染料(ABI，F(xiàn)oster City，CA)、香豆素家族染料(Tnvitrogen-MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)、羅丹明家族染料(GE Healthcare)、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料和BODIPY家族染料(Molecular Probes，Inc.)。在一種實施方案中，所述熒光部分為6-羧基熒光素(FAMTM)。可應(yīng)用于本發(fā)明探針、方法和試劑盒的其它熒光部分實例可參見美國專利6,406,297、6,221,604、5,994,063、5,808,044、5,880,287、5,556,959和5,135,717。用于本發(fā)明的熒光部分可以購自例如Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR。
在某些實施方案中，固定的探針包含猝滅劑部分。猝滅劑部分可選自熒光素家族染料、多鹵熒光素家族染料、六氯熒光素家族染料、香豆素家族染料、羅丹明家族染料、花菁家族染料、嗪家族染料、噻嗪家族染料、squaraine家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、BODIPY家族染料、低熒光猝滅劑部分和非熒光猝滅劑部分。在某些實施方案中，非熒光猝滅劑部分可以是BHQTM家族染料(包括WO01/86001所述的猝滅劑、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3)(BioSearchTechnologies，Novato，CA)、Iowa BlackTM或Dabcyl(Integrated DNATechnologies，Inc.)。其它特異性猝滅劑部分的實例包括但不限于，例如TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明)(Invitrogen-Molecular Probes，Inc.)、DABCYL(4-(4’-二甲基氨苯基偶氮)苯甲酸)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Technologies，Inc.)、Cy3TM(GEHealthcare)或Cy5TM(GE Healthcare)。在一種優(yōu)選實施方案中，猝滅劑部分為BHQ-2?？蓱?yīng)用于本發(fā)明探針、方法和試劑盒的其它猝滅劑部分的實例可參見美國專利6,399,392、6,348,596、6,080,068和5,707,813。用于本發(fā)明的猝滅劑部分可以購自例如Invitrogen-Molecular Probes，Eugene，OR。
在本發(fā)明的某些實施方案中，探針可以包含熒光部分和猝滅劑部分。在這樣的實施方案中，熒光部分可以是上文所述的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何熒光部分。此外，猝滅劑部分可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何猝滅劑部分，不受任何限制。典型地，猝滅劑部分將連接于探針的5’末端，并且熒光部分將連接于探針上連接猝滅劑部分3’的位置。
雖然不想受限于任何特定的理論或作用機(jī)制，當(dāng)探針完整時，熒光部分發(fā)射的光子仍被認(rèn)為可以被猝滅劑部分吸收并猝滅。該猝滅劑部分接著以不同波長光子的形式或熱形式釋放光子的能量。因此，猝滅劑部分也可以是熒光部分。如上所述，該現(xiàn)象被稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(“FRET”)。探針在熒光部分與猝滅劑部分之間的裂解導(dǎo)致猝滅劑部分對熒光部分所發(fā)射熒光的猝滅的減少。
通常，熒光部分與猝滅劑部分之間的能量轉(zhuǎn)移取決于該熒光部分與猝滅劑部分之間的距離和特定的熒光部分-猝滅劑部分對的臨界轉(zhuǎn)移距離。該臨界轉(zhuǎn)移距離是與已知猝滅劑部分配對的已知熒光部分的特征和常數(shù)。此外，當(dāng)熒光部分-猝滅劑部分對的臨界轉(zhuǎn)移距離接近該熒光部分與猝滅劑部分之間的距離時，便可更靈敏地確定熒光部分與猝滅劑部分的空間關(guān)系。相應(yīng)地，熟練的實施者可以選擇熒光部分和猝滅劑部分，以具有特定的臨界轉(zhuǎn)移距離，該距離與探針上熒光部分和猝滅劑部分的分隔距離相近。特定的熒光部分-猝滅劑部分對的臨界轉(zhuǎn)移距離是本領(lǐng)域熟知的，可參見例如，Wu和Brand在1994，Anal.Biochem.2181-13中的論文。
對特定熒光部分-猝滅劑部分對而言的其它標(biāo)準(zhǔn)包括例如，熒光部分發(fā)射的熒光的量子產(chǎn)率；熒光部分發(fā)射的熒光的波長；猝滅劑部分的消光系數(shù)；猝滅劑部分發(fā)射的熒光的波長，如果有的話；以及猝滅劑部分發(fā)射的熒光的量子產(chǎn)率，如果有的話。此外，如果猝滅劑部分也是熒光部分，可優(yōu)選地對該猝滅劑部分和熒光部分進(jìn)行選擇，以易于將其中一個部分發(fā)射的熒光與另一個部分發(fā)射的熒光區(qū)分開。與選擇特定熒光部分-猝滅劑部分對有關(guān)的進(jìn)一步指導(dǎo)可參見被完整引入本文作為參考的Klostermeier和Millar在2002，Biopolymers 61159-179中的綜述論文。
可應(yīng)用于本發(fā)明的熒光部分和猝滅劑部分的典型組合包括，但不限于，6-羧基熒光素(FAM)熒光團(tuán)部分和Cy5TM猝滅劑部分；選自FAM、TET、JOE、HEX、Oregon Green的熒光團(tuán)部分和BHQ-1猝滅劑部分；選自FAM、TAMRA、ROX、Cy3、Cy3.5，、CAL Red、Red 640的熒光團(tuán)部分和BHQ-2猝滅劑部分；選自Cy5和Cy5.5的熒光團(tuán)部分和BHQ-3猝滅劑部分?？杀粦?yīng)用于本發(fā)明探針、方法和試劑盒中的其它熒光部分-猝滅劑部分對實例可參見美國專利6,245,514。
可作為熒光和猝滅劑部分應(yīng)用于FRET的分子實例包括熒光素、6-羧基熒光素、2’7’-二甲氧基-4’5′-二氯-6-羧基熒光素、羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基-X-羅丹明和5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。熒光部分究竟是供體還是受體是根據(jù)其激發(fā)和發(fā)射光譜以及與其配對的熒光部分確定的。例如，F(xiàn)AMTM是由波長為494nm的光最為有效地激發(fā)的，并發(fā)射光譜為500-650nm的光，且最大發(fā)射波長為525nm。因此，F(xiàn)AMTM是適合與作為猝滅劑部分且最大激發(fā)波長為555nm的TAMRA一起應(yīng)用的熒光部分。
在某些實施方案中，標(biāo)記物部分是非熒光可檢測部分，例如，放射性同位素、生物素部分或生物素結(jié)合部分(如親和素、鏈親和素、neutravidin)。當(dāng)非熒光可檢測部分是生物素或生物素結(jié)合部分時，可以用分別連接于第二生物素結(jié)合部分或生物素的本領(lǐng)域公知的可檢測標(biāo)記物檢測靶核酸。例如，可以將放射性同位素、酶(如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶)或熒光團(tuán)連接于第二生物素結(jié)合部分或生物素、
探針通常是通過其3’末端連接于固體基質(zhì)。典型地，探針是共價結(jié)合的，但也可以非共價連接于基質(zhì)。固定的探針和固體基質(zhì)之間特定的鍵對本發(fā)明的成功不是關(guān)鍵的，只要該鍵可以承受擴(kuò)增反應(yīng)所需的條件。例如，在PCR反應(yīng)中，鍵應(yīng)該承受間歇和重復(fù)暴露于使核酸序列變性的溫度(80℃-105℃，通常約95℃)。在一些實施方案中，探針可以通過在探針3’末端位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、大約35或大約40個殘基的范圍內(nèi)的殘基上與固體基質(zhì)連接。典型地，探針將通過其3’末端連接于固體基質(zhì)?？梢孕揎椞结?，使其在3’末端含有親核基團(tuán)(即，氨基)或親電基團(tuán)。通常可以采用本領(lǐng)域公知的亞磷酰胺化學(xué)法修飾探針。例如，可以從GlenResearch of Sterling，Virginia購買核苷氨基酸修飾劑亞磷酰胺?；蛘?，探針可以連接于與寡核苷酸結(jié)合的固體基質(zhì)上的活化的化學(xué)基團(tuán)，例如，羧酸酯、醛部分、環(huán)氧化物部分、包括N-羥基琥珀酰亞胺的NHS酯、氨基部分、硝基部分、羥基部分、異硫氰酸酯部分、二氯三嗪基部分。典型的活化的化學(xué)基團(tuán)包括環(huán)氧化物部分、羧酸酯部分、NHS酯、醛部分。包含用于捕獲寡核苷酸的活化的化學(xué)部分的固體基質(zhì)可以購自Telechem International，Inc.，Sunnyvale，CA，NalgeNunc，Intl.，Rochester NY和Exiqon，Vedbaek，Denmark。用于固定本發(fā)明的探針的額外的連接部分可以購自Pierce Biotechnology，Rockford，IL。
5.固體基質(zhì)固體基質(zhì)可以包括任何能夠承受擴(kuò)增反應(yīng)所需條件的材料。例如，在PCR中，固體基質(zhì)應(yīng)該承受間歇和重復(fù)暴露于使核酸序列變性的溫度(80℃-105℃，通常約95℃)。用于固體基質(zhì)組成的示例的材料包括，但不限于，玻璃、硅組合物、塑料、合成聚合物(即聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯等)、金屬、陶瓷等。固體基質(zhì)通常具有平坦的表面，在其上連接寡核苷酸探針，并且可以是適于用于實施本發(fā)明的方法的特定測定或裝置的任何性狀。固體基質(zhì)的示例的形狀包括圓形、橢圓形、正方形、矩形、三角形，和任意其它多邊形。固體基質(zhì)可以是平皿、多孔板、測定管(即PCR管)、顯微鏡載玻片的形式。用于本發(fā)明的方法的平皿的表面積通常是大約1.0mm2-1.0cm2，例如，大約1.0mm2、2.0mm2、3.0mm2、4.0mm2、5.0mm2、6.0mm2、7.0mm2、8.0mm2、9.0mm2、1.0cm2、2.0cm2、3.0cm2、4.0cm2、5.0cm2。本發(fā)明的平皿的厚度是大約0.5mm-大約1.0cm，更通常是大約1.0mm、2.0mm、3.0mm、4.0mm、5.0mm、6.0mm、7.0mm、8.0mm、9.0mm。適用于本發(fā)明的微孔板包括可以從例如Corning Lifesciences，Acton，MA(DNA binding Thermowell板)和Nalge Nunc，Intl.(ArrayCoteTM板)購買的那些。用于本發(fā)明的顯微鏡載玻片包括可以獲自例如Telechem International，Inc.，Sunnyvale，CA(即SuperEpoxide和SuperAldehyde載玻片)、Asper Biotech，Tartu，Estonia(即3-氨基丙基三甲氧基硅烷+1，4-亞苯基二異硫氰酸酯活化的載玻片)、Nalge Nunc，Intl.，Rochester NY(即NucleolinkTM微陣列載玻片)、Grace Bio-Labs，Bend，OR(即Hybriwell chamber載玻片)和Bio-Rad Laboratories，South San Francisco，CA(即Frame-Seal system)的那些。
具有平坦表面的固體基質(zhì)通常具有反應(yīng)室，例如，可密封的凹孔或可密封的凸出的容器，以容納用于擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增試劑。凹孔或凸出的容器應(yīng)該密封，使得用于擴(kuò)增反應(yīng)的預(yù)定體積的液體不會蒸發(fā)。任選地，凸出的反應(yīng)容器任選可以從具有平坦表面的固體基質(zhì)上除去。反應(yīng)室可以用例如適于密封的蓋子或用橡膠或硅墊圈密封?？梢酝ㄟ^用膠水或填縫材料密封閉合處，或通過將反應(yīng)室維持在壓力下而使漏液或漏氣最少或不發(fā)生。
6.檢測和/或定量靶核酸的方法概言之，本發(fā)明的方法包括在通過3’末端固定于固體基質(zhì)并且在5’末端包含標(biāo)記物部分的寡核苷酸探針的存在下，通過擴(kuò)增靶核酸而檢測靶核酸。這些方法通常包括在擴(kuò)增試劑存在下，使與靶核酸雜交的固定的探針與具有5’核酸酶的酶接觸。然后，具有5’核酸酶的酶在5’核酸酶反應(yīng)中使與靶核酸雜交的固定的探針斷裂，從而釋放與5’末端連接的標(biāo)記物部分?？捎糜糜跈z測探針斷裂的標(biāo)記物部分標(biāo)記該探針。這種方法是基于美國專利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015所描述的方法。
不加限制，在5′核酸酶反應(yīng)中，所述核酸、引物和固定的探針可與本領(lǐng)域已知具有5′-3′核酸酶活性的任意酶接觸。優(yōu)選條件可使聚合酶裂解固定的探針的5’末端并從所述核酸釋放探針的多個片段。具有5′核酸酶活性的優(yōu)選酶包括模板依賴型核酸聚合酶。已知天然和重組形式的這種聚合酶包括例如，大腸桿菌DNA聚合酶I(Fermentas，Inc.，Hanover，MD)、嗜熱脂肪芽胞桿菌DNA聚合酶和Thermococcuslittoralis DNA聚合酶。
在優(yōu)選的實施方案中，具有5′核酸酶活性的酶是熱穩(wěn)定性和熱活性的核酸聚合酶。這種熱穩(wěn)定聚合酶包括但不限于來源于真細(xì)菌屬，即棲熱菌屬、棲熱袍菌屬和棲熱腔菌屬的多個菌種的天然和重組形式的聚合酶。例如，可應(yīng)用于本發(fā)明方法的棲熱菌屬菌種的聚合酶包括美國專利5,405,774、5,352,600、5,079,352、4,889,818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和5,795,762所述的水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶、嗜熱棲熱菌(Tth)DNA聚合酶、棲熱菌種Z05(Z05)DNA聚合酶和棲熱菌種sps17(sps17)?？蓱?yīng)用于本發(fā)明方法的棲熱袍菌屬聚合酶包括例如海棲熱袍菌DNA聚合酶和那不勒斯棲熱袍菌DNA聚合酶，而可被采用的一個棲熱腔菌屬聚合酶實例是非洲棲熱腔菌DNA聚合酶。國際專利申請PCT/US91/07035其
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