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一種固相制備核酸分子克隆的方法

文檔序號(hào):85493閱讀:334來源:國知局
專利名稱:一種固相制備核酸分子克隆的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種分子克隆技術(shù),特別涉及一種固相制備核酸分子克隆的技術(shù)。
背景技術(shù)
人類基因組(測序)計(jì)劃已經(jīng)完成,后基因組計(jì)劃已步入實(shí)施。研究基因在生命過程中的功能,也就是功能基因組學(xué),成為全世界生命科學(xué)工作者共同的課題。功能基因組研究的目的是要認(rèn)識(shí)基因組中每個(gè)核酸的生物學(xué)含義,發(fā)現(xiàn)疾病易感基因。功能基因組的研究途徑是比較基因組學(xué),即通過比較和分析不同表型個(gè)體之間基因組序列差異,解碼基因組中每個(gè)核酸的生物學(xué)意義,發(fā)現(xiàn)功能基因,識(shí)別與疾病相關(guān)的分子遺傳信息。進(jìn)一步地,根據(jù)個(gè)體基因組信息,實(shí)現(xiàn)疾病的預(yù)測、預(yù)防和個(gè)體化治療。隨著功能基因組研究的發(fā)展以及人們對提高醫(yī)療健康水平的不懈追求,“個(gè)體化醫(yī)療”已開始進(jìn)入人們的生活。為了真正實(shí)現(xiàn)“個(gè)體化醫(yī)療”這一目標(biāo),首先要對每個(gè)人的基因組進(jìn)行再測序,找出不同個(gè)體在DNA序列上的差異與不同疾病、發(fā)育等的相關(guān)性。采用目前的測序技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模個(gè)體全基因組DNA的測序,即對大量的人類個(gè)體的基因組DNA(包含有30億堿基)進(jìn)行再測序,其成本仍太高。這嚴(yán)重地限制了功能基因組的研究進(jìn)展,影響到人類基因組計(jì)劃的研究成果的應(yīng)用。而對于目前的基因組測序成本而言,“個(gè)體化醫(yī)療”仍然是人類的一個(gè)遙遠(yuǎn)的夢想。因此,快速、經(jīng)濟(jì)地對大量個(gè)體全基因組進(jìn)行測序成為當(dāng)今挑戰(zhàn)科學(xué)家的一項(xiàng)重大課題,人們急需發(fā)展出一些快速、廉價(jià)的個(gè)體化基因信息檢測技術(shù)來解決目前所存在的問題。這有利于人們更加深入地從分子層次上認(rèn)識(shí)生命過程的機(jī)理,從根本上認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的根源,在分子層次上進(jìn)行疾病的預(yù)測、診斷和治療,將會(huì)使醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐產(chǎn)生革命性的變化。
傳統(tǒng)的測序方法,如1998年推出的ABI Prism3700 DNA自動(dòng)化測序儀以及ABI Prism3730 DNA測序儀,測序時(shí)間長花費(fèi)大。主要有兩個(gè)原因,首先是模板制備。傳統(tǒng)的模板制備方法是將待測基因組分成許多片斷,然后將每個(gè)片斷插入克隆載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后平板培養(yǎng),挑取克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,然后送測序儀測序。因?yàn)樵谔羧〈竽c桿菌克隆的過程中,每次挑取的克隆都很有限,而且操作煩瑣,需要投入大量的人力物力和財(cái)力。其次是測序過程。由于測序樣本都是單個(gè)克隆,每臺(tái)機(jī)器一次只能測序96個(gè)樣本,因此要測序30億堿基的人類基因組序列,需要耗費(fèi)大量的時(shí)間及測序用藥品試劑,從而導(dǎo)致人類基因組測序時(shí)間長、耗費(fèi)大,無法實(shí)現(xiàn)個(gè)體化測序。有人統(tǒng)計(jì),采用ABI Prism3730 DNA測序儀測序,平均每個(gè)堿基的成本是0.008美元,完成一個(gè)30億堿基的測序,需要150臺(tái)ABI Prism3730 DNA測序儀運(yùn)轉(zhuǎn)一年,測序成本達(dá)到二千四百萬美元。
在對傳統(tǒng)基因測序方法進(jìn)行改進(jìn)的過程中,美國454公司首先推出了一種新的測序方法。該方法將DNA測序成本降至目前成本的100倍。該技術(shù)目前已成功進(jìn)入市場化運(yùn)作。該方法基于焦磷酸測序與高通量模板制備兩個(gè)重要技術(shù),其中高通量模板的制備對于成本的降低及測序速度的提高起了重要的決定性作用。該公司將微球固定技術(shù)、linker-PCR與乳液PCR技術(shù)相結(jié)合,能夠通過一次PCR擴(kuò)增,同時(shí)將大量的待測序模板克隆出來并固定在不同一個(gè)微球上,然后再將單個(gè)微球固定在一個(gè)凹槽內(nèi),形成高密度的微球陣列,然后進(jìn)行高通量并行測序。該方法雖然將測序技術(shù)往前推進(jìn)了一步,但仍然存在著一些問題,如模板制備較為煩瑣,條件較難控制,成本較高等。而且該技術(shù)離生物科學(xué)家們提出的一千美元人類基因組測序的目標(biāo)還有相當(dāng)大的差距。在改進(jìn)454測序技術(shù)的過程中,許多科學(xué)家想到了應(yīng)用生物芯片技術(shù)制備測序模板,如Solexa公司采用生物芯片上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增,但這些技術(shù)都較難控制反應(yīng)條件,而且對基片處理具有較高的要求。
DNA測序模板制備技術(shù)發(fā)展的歷史也是核酸分子克隆技術(shù)的發(fā)展史。本發(fā)明針對目前DNA測序模板制備存在的技術(shù)瓶頸,提出了一種固相制備核酸分子克隆的新技術(shù)。該發(fā)明改進(jìn)了目前分子克隆的制備技術(shù),可用于高密度基因芯片制作及全基因組測序模板的制備,具有十分重要的應(yīng)用前景和使用價(jià)值。本發(fā)明不僅可用于高通量低成本測序模板的制備,同時(shí)還可以用于SNP檢測以及DNA甲基化檢測技術(shù)的改進(jìn),從而使人們能夠獲取大量的生物分子信息。

發(fā)明內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題,本發(fā)明提供了一種固相制備核酸分子克隆的技術(shù)。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種固相制備核酸分子克隆的技術(shù),制備步驟為通過現(xiàn)有技術(shù)制備單鏈環(huán)形核酸待克隆模板;設(shè)計(jì)模板引物,引物5’端修飾有丙烯酰胺基團(tuán)、氨基、醛基、或生物素等化學(xué)基團(tuán),這些修飾化學(xué)基團(tuán)的引物可向生物技術(shù)公司(如英駿生物技術(shù)有限公司)訂購;根據(jù)模板引物5’端修飾的基團(tuán)或下一步的用途,對基片的表面進(jìn)行相應(yīng)的硅烷化、氨基化、醛基化等處理、或親和素等修飾?;糠志唧w的修飾方法見實(shí)施例。修飾后的基片有兩種用途,一種是直接用作固相載體,也就是修飾在基片上的基團(tuán)與引物修飾基團(tuán)發(fā)生化學(xué)或生物反應(yīng)后,將引物牢固地固定在基片上。另一種基片是用來鋪上一層聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠等網(wǎng)狀多孔的固相支持物,其中引物能夠直接與該凝膠固相支持物中的生物化學(xué)基團(tuán)或埋在該支持物中的微球表面的生物化學(xué)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng),牢固地將引物固定在凝膠固相支持物中或微球表面;將所得模板和其他沒有固定的引物加入到固相支持物中,再加入相應(yīng)的生物酶及相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液和核酸單體等,利用超支滾環(huán)擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增,形成單一的核酸分子克?。蛔詈髮⒒パa(bǔ)自由鏈去除。
其中,該技術(shù)方案中使用的微球可以是由金屬及金屬氧化物制成,如磁珠。在微球表面修飾一層化學(xué)基團(tuán)或生物基團(tuán),表面修飾有基團(tuán)的磁珠可直接從Dynal Biotech公司購買。另外,該技術(shù)方案中使用的微球也可以是由塑料、橡膠、尼龍制成的固體微粒,微粒表面修飾一層化學(xué)基團(tuán)或生物基團(tuán),如美國的Lumirex公司生產(chǎn)的聚苯乙烯微球顆粒,該公司提供表面上化學(xué)基團(tuán)修飾的產(chǎn)品。
該技術(shù)的特點(diǎn)之一是固相分子克隆的制備,即模板的引物上的化學(xué)基團(tuán)能夠與固相載體上的化學(xué)基團(tuán)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)或生物反應(yīng),使全部引物或部分引物牢固地固定在固相載體上。從而使?jié)L環(huán)的產(chǎn)物能夠固定在固體的基片上。
該技術(shù)方案采用了固相超支滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng),同一模板的擴(kuò)增產(chǎn)物都集中在一個(gè)點(diǎn)附近有限的范圍內(nèi),因而沒有其他克隆產(chǎn)物的污染。本技術(shù)是將一條引物或多條引物牢固地固定在固相載體上,通過調(diào)整環(huán)狀核酸模板濃度將單個(gè)模板隨機(jī)均勻地分散在固相載體的不同部位,并與固定在載體上的引物復(fù)性,在恒溫及給定適合條件下發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。在反應(yīng)過程中,由于其中的一條鏈固定在固相載體中,而且是恒溫?cái)U(kuò)增,雙鏈無法發(fā)生解離,所以擴(kuò)增產(chǎn)物也就無法移動(dòng),因此也就聚集在擴(kuò)增部位。由于擴(kuò)增產(chǎn)物不能移動(dòng),也不會(huì)出現(xiàn)克隆之間的產(chǎn)物污染。在普通的微陣列芯片中由于在一個(gè)陣列點(diǎn)上要固定大量的同一核酸序列的片段作為檢測探針,這些核酸片段的純度,以及在制備過程中的污染將會(huì)直接影響的該陣列點(diǎn)的檢測質(zhì)量。在美國埃菲公司用微電子光刻工藝制備的高密度的核酸微陣列芯片,由于核酸原位化學(xué)合成的產(chǎn)率較低,在芯片的每個(gè)陣列點(diǎn)上將會(huì)有較多的合成錯(cuò)誤的核酸探針,這將在很大的程度上影響該芯片雜交的檢測準(zhǔn)確性。
通過調(diào)整擴(kuò)增時(shí)間可以調(diào)整克隆分子拷貝數(shù)的多少,以及點(diǎn)陣中每個(gè)克隆點(diǎn)的大小。因?yàn)槌L環(huán)擴(kuò)增是非常高效的恒溫?cái)U(kuò)增,在有引物及其它條件具備的情況下,該擴(kuò)增就可以一直進(jìn)行下去。對于該項(xiàng)技術(shù),可以通過兩種方法來調(diào)整拷貝數(shù)的大小。首先是擴(kuò)增時(shí)間,擴(kuò)增時(shí)間越長,拷貝數(shù)就會(huì)越高,每個(gè)克隆的直徑也會(huì)越大。另一個(gè)控制克隆大小的方法就是通過改變固相載體的大小和結(jié)構(gòu)的方式來控制分子克隆擴(kuò)增的區(qū)域。例如,將引物固定在一個(gè)微小的區(qū)域內(nèi),當(dāng)擴(kuò)增進(jìn)行到一定程度,因?yàn)槿鄙僖锞蜔o法進(jìn)一步滾環(huán)擴(kuò)增下去,使該克隆的大小無法進(jìn)一步擴(kuò)大。
該發(fā)明可以制備出高密度的單鏈分子克隆微陣列。由于超支滾環(huán)擴(kuò)增的產(chǎn)物具有類似樹枝狀的特征,通過控制擴(kuò)增的過程容易控制其擴(kuò)增范圍的大小。因此,每個(gè)擴(kuò)增點(diǎn)的大小理論上可以減小到幾十到幾百個(gè)納米的范圍,這樣就大大提高了芯片單位面積上不同分子克隆的密度。而在現(xiàn)在的微陣列芯片上每個(gè)陣列點(diǎn)一般包含有數(shù)百至數(shù)百萬的核酸分子,目前每個(gè)陣列點(diǎn)的大小多在數(shù)微米和數(shù)百微米之間。例如,生物芯片的世界著名制造商美國埃菲公司用微電子光刻工藝制備的國際最高密度的核酸微陣列芯片,每個(gè)陣列點(diǎn)的直徑為5微米。用普通點(diǎn)樣法制備的微陣列芯片,其每個(gè)陣列點(diǎn)的直徑一般大于為50微米。用微噴頭制備的微陣列芯片,其每個(gè)陣列點(diǎn)的直徑一般大于為100微米。因此,本發(fā)明在原理上可以使核酸微陣列芯片可具有巨大的核酸微陣列的點(diǎn)陣密度,單位面積的核酸探針密度可以提高數(shù)萬倍。
該技術(shù)方案是一項(xiàng)恒溫高效而又簡單容易操作的克隆制備方法,非常適合高通量測序模板的制備。該項(xiàng)技術(shù)是基于超支滾環(huán)擴(kuò)增發(fā)展起來的一項(xiàng)高通量克隆制備技術(shù)。超支滾環(huán)擴(kuò)增是在恒溫條件下進(jìn)行的,而且擴(kuò)增效率極高,在相同時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物量是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的十幾倍甚至幾十倍,而PCR的擴(kuò)增反應(yīng)需要一個(gè)溫度循環(huán)過程,所以需要一個(gè)PCR儀這種特殊的裝置,而超支滾環(huán)擴(kuò)增是在恒溫條件下進(jìn)行,只要有一個(gè)恒溫的條件即可。由于PCR需要變性與復(fù)性反應(yīng)過程,所以固相PCR擴(kuò)增中容易擴(kuò)散,造成克隆之間的污染。而橋式PCR擴(kuò)增條件要求非??量蹋y以操作與控制。而本發(fā)明既發(fā)揚(yáng)了固相PCR及橋式PCR的優(yōu)點(diǎn),又改進(jìn)了其不足。因此,采用該項(xiàng)技術(shù)制備克隆時(shí)間短,方法簡單,成本低。
本技術(shù)方案提出的方法采用了超支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù),該方法對于不同的核酸片段具有較好的擴(kuò)增平行性,這對于全基因組測序模板的制備是十分重要的。目前,測序的DNA分子克隆的模板制備都是采用PCR技術(shù)。眾所周知,PCR擴(kuò)增技術(shù)對于不同序列的核酸模板其擴(kuò)增效率有很大的偏差,這極大地影響被測序基因組的測序覆蓋率。而本發(fā)明采用的超支滾環(huán)擴(kuò)增方法,對于不同的模板序列該方法已被證明沒有擴(kuò)增的偏向性。
本技術(shù)方案中制備的分子克隆,能夠方便地制備出相應(yīng)的單鏈分子克隆,可用于雜交、測序等應(yīng)用。因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物的一條鏈?zhǔn)枪潭ㄔ诠滔噍d體上,另一條鏈則是與固定的一條鏈通過互補(bǔ)配對形成的雙鏈結(jié)構(gòu)。另一條鏈可以通過變性電泳將其去除。通過變性電泳,未固定住的一條鏈則被去除,剩下一條單鏈,更加容易雜交與延伸檢測。目前,有些公司,如美國454公司,采用微球與乳液PCR相結(jié)合的方法進(jìn)行克隆制備,由于這項(xiàng)技術(shù)需要把兩條引物都要進(jìn)行固定,所以通過PCR反應(yīng)后,微球上兩條鏈都被固定下來,這樣在延伸或雜交過程中難免會(huì)產(chǎn)生干擾。
本技術(shù)方案采用的固相載體既可以是整塊基片,如膠膜、修飾了一些化學(xué)基團(tuán)的玻片等,在整塊的基片表面上可以形成不同的結(jié)構(gòu),也可以是大量的微球等可分散固相載體。本發(fā)明可以采用鋪在基片上多孔網(wǎng)狀的整塊膠或者是修飾有一層化學(xué)基團(tuán)的整塊基片作為反應(yīng)載體。采用整塊膠或基片作為反應(yīng)載體,制備出來的克隆隨機(jī)分布在整塊膠或基片上。該載體也可以是以點(diǎn)陣的形式分布在基片上,制備出來的克隆便可有規(guī)則的分布在陣列中的每個(gè)點(diǎn)上。同時(shí)我們也可以在微球體系中制備分子克隆。將不同的微球載體鋪展在基底表面形成高密度的微球陣列,再進(jìn)行超支滾環(huán)擴(kuò)增,在每個(gè)微球上形成單一克隆,制備成克隆微陣列。
本發(fā)明中被固定的引物的5’端修飾了活性化學(xué)基團(tuán)(如醛基、氨基、丙烯酰胺基團(tuán)等);在固相載體中可進(jìn)行雙引物、多引物或隨機(jī)引物等多種形式的滾環(huán)擴(kuò)增,制備出核酸分子克隆。
本發(fā)明中用于克隆模板制備的核酸為DNA、RNA或其他人工核酸如PNA、LNA等。在一個(gè)反應(yīng)體系中包含有若干陣列點(diǎn)或微球。在每個(gè)陣列點(diǎn)或微球中包含有不同的核酸模板。在一次反應(yīng)中同時(shí)可以制備若干不同的核酸分子克隆。本發(fā)明中在固相載體中的非固定核酸產(chǎn)物,可以用電泳、加熱和流體沖洗等方法去除,以獲得單鏈的核酸分子克隆。
該分子克隆的制備技術(shù)具有制備簡單,擴(kuò)增效率高、對于不同的DNA片斷的擴(kuò)增平行性好等優(yōu)點(diǎn)。特別是該分子克隆為固定化的,經(jīng)過變性電泳后,可將被固定的一條鏈留下來,另一條互補(bǔ)鏈去除,形成單鏈分子克隆,以便進(jìn)行下一步的雜交或延伸實(shí)驗(yàn)。該技術(shù)可以在一個(gè)載體基片的不同位置制備不同的克隆,從而在一次擴(kuò)增中可以制備極大量的分子克隆,實(shí)現(xiàn)高密度測序模板芯片的制備。這對于實(shí)現(xiàn)高通量、低成本人類全基因組的測序,提供了可行的模板制備技術(shù)。
四圖1為整塊固相載體作為反應(yīng)載體進(jìn)行克隆制備滾環(huán)反應(yīng)后的平面示意圖(A)與切面示意圖(B),其中(1)隨機(jī)引物;(2)環(huán)形核酸模板;(3)正向引物;(5)滾環(huán)產(chǎn)物;(6)基片;(7)固相載體;(8)克隆。
圖2為以陣列作為反應(yīng)載體制備克隆滾環(huán)反應(yīng)后的平面示意圖(A)與切面示意圖(B),其中(1)隨機(jī)引物;(2)環(huán)形核酸模板;(3)正向引物;(5)滾環(huán)產(chǎn)物;(6)基片;(7)固相載體;(8)克?。?9)陣列。
圖3為實(shí)施例3反應(yīng)前(A)與反應(yīng)后(B)示意圖。其中(1)隨機(jī)引物;(2)環(huán)形核酸模板;(3)正向引物;(5)滾環(huán)產(chǎn)物;(6)基片;(7)固相載體;(8)克??;(9)陣列;(10)單鏈滾環(huán)產(chǎn)物;(12)磁珠;(13)聚丙烯酰胺凝膠。
圖4為采用實(shí)施例1方案制備出來的核酸分子克隆掃描儀掃描結(jié)果圖。
圖5為采用實(shí)施例2方案制備出來的核酸分子克隆陣列掃描儀掃描結(jié)果圖。
圖6為采用實(shí)施例3方案制備出來的核酸分子克隆掃描儀掃描結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1.采用醛基化硅片制備核酸分子克隆該方法所采用的固相載體為醛基修飾后的硅片,也就是將需要固定的引物固定在醛基硅片上,然后在硅片上進(jìn)行超支滾環(huán)擴(kuò)地反應(yīng),進(jìn)一步制備出核酸分子克隆。
單鏈環(huán)形基因組擴(kuò)增模板的制備基因組DNA的超聲波處理選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x,將基因組DNA隨機(jī)打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機(jī)片斷純化處理,去除一些小的和破碎的片斷,然后分別采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理,使隨機(jī)片段產(chǎn)生一個(gè)TA粘性末端,然后與一個(gè)通用連接子(linker15’-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’linker25’-GTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACT-3’)連接,形成一個(gè)雙鏈的環(huán),在外切酶I和外切酶III的作用下,形成單鏈環(huán)2。
硅片的表面醛基化修飾(A)選擇大小合適的低熒光背景的硅片6,在80℃的piranha洗液(濃硫酸與30%的H2O2按體積比7∶3混合)超聲洗滌2小時(shí),然后用洗滌劑徹底清洗;用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘干備用;(B)硅烷化處理在上步洗滌干凈的硅片置于含有2%APTES(3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5~10分鐘,用丙酮、乙醇、去離子蒸餾水徹底清洗各兩次,氮?dú)獯蹈桑?80℃烘烤1~2小時(shí)。
(C)醛基化處理將硅烷化處理的硅片置于含5%的戊二醛(50%水溶液,Amresco)磷酸緩沖液(0.1M批H7.4)中浸泡2小時(shí),用丙酮、乙醇、去離子蒸餾水徹底清洗各3次,氮?dú)獯蹈桑?℃保存?zhèn)溆谩?br> (D)在硅片上固定親和素將醛基化處理的硅片置于含親和素蛋白質(zhì)的溶液中浸泡,用去離子蒸餾水徹底清洗各3次,氮?dú)獯蹈桑?℃保存?zhèn)溆谩?br> 引物固定及單克隆測序模板的制備(A)引物固定針對上述模板設(shè)計(jì)一對引物,其中的一條與環(huán)形模板互補(bǔ)的引物5’端做生物素修飾3。將5’端做生物素修飾寡聚核苷酸引物用碳酸緩沖液(pH9.0)稀釋到終濃度為8pmol/μL,然后將引物溶液均勻地鋪于表面修飾有親和素的硅片6,7上。將硅片置于潮濕的密封盒中室溫過夜、37℃水浴2小時(shí)。然后用0.1%SDS充分清洗,去除未連接的寡聚核苷酸探針。最后用硼氫化鈉(NaBH4)溶液處理30分鐘后待用。
(B)在片超支滾環(huán)擴(kuò)增將濃度為1pM的環(huán)形模板覆蓋在上述固定有引物的硅片上,95℃變性5分鐘,然后在水浴鍋內(nèi)慢慢降到室溫。然后,無菌去離子雙蒸水沖洗2遍,去除未結(jié)合的模板環(huán)。配制超支滾環(huán)擴(kuò)增溶液,其溶液包含濃度沒做修飾的反向引物(1μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/μL)、1×Bst DNA大片段聚合酶緩沖液、dNTP(800μM),混勻后滴加到固定有模板環(huán)的硅片上,然后用硅烷處理過的蓋玻片蓋在溶液上,形成約5-20微米一薄層溶液。然后置于潮濕的雜交盒內(nèi),50℃條件下滾環(huán)20-24時(shí)。
(C)沖洗法去除互補(bǔ)自由鏈將固定了大量滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物5的硅片取出后,置于0.1M的NaOH溶液中一分鐘,然后用去離子沖洗5遍后,氮?dú)獯蹈珊螅?℃保存待用。
圖4為實(shí)施例1方案制備出來的核酸分子克隆,經(jīng)過配對cy-3標(biāo)記的探針雜交后,掃描儀掃描結(jié)果圖,該圖點(diǎn)的大小為實(shí)際結(jié)果放大十倍。其中一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)核酸分子克隆。
實(shí)施例2采用聚丙烯酰胺凝膠陣列制備核酸分子克隆聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N,N’甲叉雙丙烯酰胺通過自由基引發(fā)聚合而成的大分子,無色透明,易觀察。凝膠中的網(wǎng)狀格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物,沒有或很少帶有離子的側(cè)基,因而電滲作用比較小,不易和樣品相互作用。另外,由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì),在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比,形成不同程度交鏈結(jié)構(gòu),其空隙度可在一個(gè)較廣的范圍內(nèi)變化,而且又有比較好的機(jī)械性質(zhì)。在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。
該方法所采用的固相載體為聚丙烯酰胺凝膠。首先將玻片表面修飾一層丙烯酰胺基團(tuán),需要固定的引物5’端修飾一個(gè)丙烯酰胺基團(tuán),然后將修飾后的引物混合在丙烯酰胺溶液中,通過某種方法將凝膠溶液在修飾過的基片上形成點(diǎn)陣,經(jīng)過丙烯酰胺凝集反應(yīng)后,使凝膠牢固地固定在基片上,同時(shí)引物牢固地固定在凝膠中。然后進(jìn)行超支滾環(huán)擴(kuò)增,制備出核酸克隆。
單鏈環(huán)形基因組擴(kuò)增模板的制備基因組DNA的超聲波處理選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x,將基因組DNA隨機(jī)打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機(jī)片斷純化處理,去除一些小的和破碎的片斷,然后分別采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理,使隨機(jī)片段產(chǎn)生一個(gè)TA粘性末端,然后與一個(gè)通用連接子(linker15’-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’linker25’-GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3’)連接,形成一個(gè)雙鏈的環(huán),在外切酶I和外切酶III的作用下,形成單鏈環(huán)。
基片的表面丙烯酰胺硅烷修飾基片清洗選擇大小合適的低熒光背景的全反射玻片,用洗衣粉清洗玻片的表面,然后用去離子水沖洗表面。將沖洗過的玻片置于盛有去離子水的燒杯,超聲清洗1-2小時(shí)。將超聲洗滌后的玻片放置在含有10%NaOH溶液的封閉的容器中浸泡30分鐘。最后用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘干備用;硅烷化處理在上步洗滌干凈的載玻片置于含有10%Alfa Aesar(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane,γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷)的丙酮溶液中浸泡1小時(shí),用丙酮和去離子蒸餾水徹底清洗各兩次,氮?dú)獯蹈桑娓蓚溆谩?br> 聚丙烯酰胺溶液制備高通量陣列及其單克隆測序模板的制備丙烯酰胺溶液制備高通量陣列及其在片超支滾環(huán)擴(kuò)增配制丙烯酰胺溶液,該溶液包含丙烯酰胺(3%)、N,N’甲叉雙丙烯酰胺(0.15%)、過硫酸銨(1%)、模板環(huán)(1PM)、5’端標(biāo)記丙烯酰胺基團(tuán)的正相引物(1μM)、30%甘油,混勻后灌注通過疏水感光膠制出的高通量陣列微孔(直徑為25微米),然后將玻片置于一濕度及TEMED濃度達(dá)到飽合的真空環(huán)境中,凝集2小時(shí)。將玻片取出后置于潮濕的雜交盒內(nèi),并將適量的滾環(huán)溶液(沒做修飾的反向引物(1μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/μL)、1×Bst DNA大片段聚合酶緩沖液、dNTP(800μM))加在陣列9上,蓋上蓋玻片,50℃條件下滾環(huán)20-24小時(shí)。
電泳法去除互補(bǔ)自由鏈將固定大量滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物5的玻片取出后,用去離子水沖洗幾遍后,置于變性電泳液(0.5*TBE,42%尿素)中電泳15分鐘,取出后使用洗液(Tris·HCL 10mM,PH7.5;KCL 50mM,EDTA 2mM,0.01%Triton X-100)沖洗2次,然后用去離子水沖洗2-4次,氮?dú)獯蹈珊螅?℃保存待用。
圖5為實(shí)施例2方案制備出來的核酸分子克隆陣列,經(jīng)過配對cy-3標(biāo)記的探針雜交后,掃描儀掃描結(jié)果圖,該圖點(diǎn)的直徑為50微米。其中一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)核酸分子克隆。
實(shí)施例3采用磁珠固定與聚丙烯酰胺凝膠包埋制備核酸分子克隆該方法所采用的固相載體為表面修飾有親合素基團(tuán)的磁珠。首先將玻片表面修飾一層丙烯酰胺基團(tuán),需要固定的引物5’端修飾一個(gè)生物素基團(tuán)。將修飾后的引物首先與磁珠反應(yīng),使引物牢固地固定在磁珠表面。然后將磁珠混合在丙烯酰胺溶液中,并均勻地鋪在丙烯酰胺修飾過的玻片上,凝固后進(jìn)行超支滾環(huán)擴(kuò)增,制備出核酸克隆。
單鏈環(huán)形基因組擴(kuò)增模板的制備基因組DNA的超聲波處理選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x,將基因組DNA隨機(jī)打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機(jī)片斷純化處理,去除一些小的和破碎的片斷,然后分別采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理,使隨機(jī)片段產(chǎn)生一個(gè)TA粘性末端,然后與一個(gè)通用連接子(linker15’-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’linker25’-GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3’)連接,形成一個(gè)雙鏈的環(huán),在外切酶I和外切酶III的作用下,形成單鏈環(huán)。
基片的表面丙烯酰胺硅烷修飾基片清洗選擇大小合適的低熒光背景的全反射玻片,用洗衣粉清洗玻片的表面,然后用去離子水沖洗表面。將沖洗過的玻片置于盛有去離子水的燒杯,超聲清洗1-2小時(shí)。將超聲洗滌后的玻片放置在含有10%NaOH溶液的封閉的容器中浸泡30分鐘。最后用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘干備用;硅烷化處理在上步洗滌干凈的載玻片置于含有10% Alfa Aesar(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane,γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷)的丙酮溶液中浸泡1小時(shí),用丙酮和去離子蒸餾水徹底清洗各兩次,氮?dú)獯蹈?,烘干備用?br> 磁珠固定引物與聚丙烯酰胺凝膠包埋磁珠以及超支滾環(huán)擴(kuò)增正向引物固定在磁珠表面將引物3的5’端修飾一個(gè)生物素的活性基團(tuán),然后與直徑為50微米以下修飾了鏈霉親合素的磁珠12結(jié)合,其反應(yīng)條件為磁珠(1pM)與生物素標(biāo)記的引物(1μM)在結(jié)合緩沖液(見Dynal Biotech公司磁珠產(chǎn)品說明書)中常溫條件下作用4-6小時(shí),并有規(guī)律地輕輕搖動(dòng)。結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后,采用沖洗液(見Dynal Biotech公司磁珠產(chǎn)品說明書)沖洗3次,每次5分鐘。固定有引物磁珠與1PM的模板環(huán)混勻,在PCR儀中加熱到90℃,5分鐘后關(guān)掉PCR儀,使其慢慢降到室溫。然后離心去除未結(jié)合在磁珠上的模板環(huán)。
磁珠摻入丙烯酰胺溶液并鋪膠配制摻有磁珠的丙烯酰胺溶液,該溶液包含磁珠(1pM)、丙烯酰胺(6%)、N,N’甲叉雙丙烯酰胺(0.3%)、過硫酸銨(0.085%)、TEMED(0.085%)、沒做修飾的反向引物(1μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/μL)、1×Bst DNA大片段聚合酶緩沖液、dNTP(800μM),其中,TEMED最后再加到溶液中,混勻后滴加到硅烷化處理的載玻片上,然后用排斥硅烷處理過的蓋玻片蓋在丙烯酰胺溶液上,形成約5-20微米一薄層溶液。然后將玻片置于一濕度達(dá)到飽合的真空環(huán)境中,凝集2小時(shí),形成凝膠13。將玻片取出后置于潮濕的雜交盒內(nèi),50℃條件下滾環(huán)20-24小時(shí)。
電泳法去除互補(bǔ)自由鏈將滾環(huán)擴(kuò)增后的玻片取出后,用去離子沖洗幾遍后,置于變性電泳液(0.5×TBE,42%尿素)中電泳15分鐘,取出后使用洗液(Tris·HCL 10mM,PH7.5;KCL 50mM,EDTA 2mM,0.01%Triton X-100)沖洗2次,然后用去離子水沖洗2~4次,氮?dú)獯蹈珊螅?℃保存待用。
圖6為采用實(shí)施例3方案制備出來的核酸分子克隆,經(jīng)過配對cy-3標(biāo)記的探針雜交后,掃描儀掃描結(jié)果圖,該圖點(diǎn)的大小為實(shí)際結(jié)果放大40倍。其中一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)核酸分子克隆。
實(shí)施例4采用聚苯乙烯高分子微球固定與瓊脂糖凝膠包埋制備核酸分子克隆該方法所采用的固相載體為表面修飾有氨基基團(tuán)的聚苯乙烯高分子微球。首先將玻片表面清洗干凈,需要固定的引物5’端修飾一個(gè)醛基基團(tuán)。將修飾后的引物首先與微球反應(yīng),使引物牢固地固定在微球表面。然后將微球混合在瓊脂糖溶液中,并均勻地鋪在干凈的玻片上,凝固后進(jìn)行超支滾環(huán)擴(kuò)增,制備出核酸克隆。
單鏈環(huán)形基因組擴(kuò)增模板的制備基因組DNA的超聲波處理選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x,將基因組DNA隨機(jī)打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機(jī)片斷純化處理,去除一些小的和破碎的片斷,然后分別采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理,使隨機(jī)片段產(chǎn)生一個(gè)TA粘性末端,然后與一個(gè)通用連接子(linker15’-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3’linker25’-GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3’)連接,形成一個(gè)雙鏈的環(huán),在外切酶I和外切酶III的作用下,形成單鏈環(huán)。
玻片清洗基片清洗選擇大小合適的玻片,用洗衣粉清洗玻片的表面,然后用去離子水沖洗表面。將沖洗過的玻片置于盛有去離子水的燒杯,超聲清洗1-2小時(shí)。將超聲洗滌后的玻片放置在含有去離子水中煮沸1小時(shí)。最后用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘干備用。
瓊脂糖包裹聚微球鋪膠引物固定在塑料微球表面準(zhǔn)備與環(huán)形通用連接子互補(bǔ)且5’端修飾有醛基基團(tuán)的引物,以及準(zhǔn)備表面修飾有氨基基團(tuán)的微球(直徑為2.5微米)。適當(dāng)條件下醛基基團(tuán)與氨基基團(tuán)發(fā)生縮水反應(yīng),并將引物牢固地固定在微球表面。離心沖洗去除未結(jié)合上去的引物。
環(huán)形模板與引物復(fù)性結(jié)合將一定量的1pM的環(huán)形模板與等量1μM的固定有引物的微球在75℃條件下變性10分鐘,然后加入與總量相等的2*雜交緩沖液,45℃條件下復(fù)性1小時(shí),然后離心沖洗去除雜交液及未雜交上去的模板環(huán)。瓊脂糖包裹微球鋪膠將1pmol量載有引物與模板的微球溶解在4ml 1%的瓊脂糖溶液中,混勻后,將瓊脂糖均勻地鋪在上述處理好的玻片上,凝固后,4℃保存待用。
隨機(jī)引物1超支滾環(huán)擴(kuò)增將玻片取出后置于潮濕的雜交盒內(nèi),并將適量的滾環(huán)溶液(沒做修飾的隨機(jī)引(每條引物濃度0.5μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/μL)、1×BstDNA大片段聚合酶緩沖液、dNTP(800μM))加在瓊脂糖凝膠上,蓋上蓋玻片,50℃條件下滾環(huán)20-24小時(shí)。
電泳法去除互補(bǔ)自由鏈將滾環(huán)擴(kuò)增后的玻片取出后,用去離子水沖洗幾遍后,置于變性電泳液(0.5*TBE,42%尿素)中電泳15分鐘,取出后使用洗液(Tris·HCL 10mM,PH7.5;KCL 50mM,EDTA 2mM,0.01% Triton X-100)沖洗2次,然后用去離子水沖洗2-4次,氮?dú)獯蹈珊螅?℃保存待用。
權(quán)利要求
1.一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于制備步驟為a.制備單鏈環(huán)形核酸模板;b.制備與上述模板相應(yīng)的引物,其5’端核酸上修飾有化學(xué)基團(tuán)丙烯酰胺基團(tuán)、氨基、醛基或生物素;c.將步驟b所得的引物加入到有硅烷基、氨基、醛基或親和素的固相載體中,將引物經(jīng)過化學(xué)反應(yīng),連接在固相載體上;d.將步驟a所得的模板、生物酶、核酸單體、以及擴(kuò)增溶液加入到經(jīng)步驟c處理完畢的固相載體中;e.利用超支滾環(huán)擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增,形成單一的核酸分子克??;f.互補(bǔ)自由鏈的去除。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于所述的固相載體為凝膠微粒中的瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于所述的固相載體為無機(jī)微粒中的磁珠、金屬及金屬氧化物或高分子固體微粒中的塑料、橡膠、尼龍。。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于所述的固相載體為需要進(jìn)行硅烷化、氨基化或醛基化處理的硅片和玻片。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于固相載體支持物為多聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠,該支持物具有網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于克隆模板為DNA、RNA或人工核酸PNA、LNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于互補(bǔ)自由鏈,即固相載體中的非固定核酸產(chǎn)物,可以用電泳、加熱或流體沖洗方法去除。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于固相載體中進(jìn)行雙引物、多引物或隨機(jī)引物多種形式的滾環(huán)擴(kuò)增,制備出核酸分子克隆。
9.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于所述固相載體支持物為陣列式,陣列中的每一個(gè)點(diǎn)可以制備出一個(gè)核酸分子克隆。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的一種固相制備核酸分子克隆的方法,其特征在于陣列中的每一個(gè)點(diǎn)包含有不同的核酸模板,在一次反應(yīng)中同時(shí)可以制備不同的核酸分子克隆。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種固相制備核酸分子克隆的方法,制備步驟為制備單鏈環(huán)形核酸模板;制備與上述模板相應(yīng)的引物,其5’端核酸上修飾有化學(xué)基團(tuán)丙烯酰胺基團(tuán)、氨基、醛基或生物素;將所得的引物加入到固相載體中,將引物經(jīng)過化學(xué)反應(yīng),連接在固相載體上;將所得的模板、生物酶、核酸單體、以及擴(kuò)增溶液加入到經(jīng)處理完畢的固相載體中;利用超支滾環(huán)擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增,形成單一的核酸分子克??;互補(bǔ)自由鏈的去除。該技術(shù)具有制備簡單,擴(kuò)增效率高、對于不同DNA片斷的擴(kuò)增平行性好等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)可以在一個(gè)載體基片的不同位置制備不同的克隆,實(shí)現(xiàn)高密度測序模板芯片的制備。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1995369SQ200610098379
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月14日
發(fā)明者陸祖宏, 周東蕊 申請人:東南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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