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一種固相法制備Eptifibatide的方法

文檔序號(hào):3564371閱讀:379來(lái)源:國(guó)知局

專(zhuān)利名稱(chēng)::一種固相法制備Eptifibatide的方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明本發(fā)明屬于制藥
技術(shù)領(lǐng)域
,尤其是涉及一種固相法合成愛(ài)啡肽(Eptifibatide)的新方法。
背景技術(shù)
:愛(ài)啡肽,又名依非巴特、埃替非巴肽,英文名Eptifibatide,分子式C3sH49Nn09S2,CAS登錄號(hào)148031-34-9,其結(jié)構(gòu)為IIMpr-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2Eptifibatide為抗血小板聚集劑,由美國(guó)CORTherapeutics公司與美國(guó)Schering-Plough公司共同研制開(kāi)發(fā)。1998年7月由Schering-Plough公司以商品名Intrifiban在美國(guó)首次上市,1999年以商品名Intrifiban在歐洲上市。異名IntrifibanTM,Sch-60936,C68-22,SB-1。埃替非巴肽為環(huán)形肽,是血小板糖蛋白GPlIb/nia受體拮抗劑,可阻斷由各種激活劑引起的血小板聚集反應(yīng),是已知最強(qiáng)的特異性血小板聚集抑制劑,主要用于防止心肌供氧動(dòng)脈閉塞,心臟病發(fā)作,不穩(wěn)定性心絞痛、無(wú)Q波心肌梗塞、冠脈介入治療引起的猝死。臨床研究結(jié)果顯示,病人推注埃替非巴肽進(jìn)行治療,在術(shù)后48小時(shí),死亡或嚴(yán)重問(wèn)題的聯(lián)合終點(diǎn)發(fā)生率(主要終點(diǎn)指標(biāo)包括心臟病發(fā)作、病死率及需要再次急診介入或溶栓治療率)埃替非巴肽比其他劑組減少了37%。死亡或心肌梗死發(fā)生率,埃替非巴肽組比其他劑組低40%。Eptifibatide在急性冠脈綜合征病人中呈劑量依賴(lài)性地抑制體外血小板的聚集,在健康志愿者和做PCI術(shù)的病人中能抑制纖維原與二磷酸腺苷活化的血小板結(jié)合。對(duì)急性冠脈綜合征病人,二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集早在本品注射后5分鐘即受到抑制,其在給藥期持續(xù)的48小時(shí)內(nèi)恢復(fù)正常。本品180pg/kg劑量靜注和以每分鐘2[ig/kg速率靜脈輸注均能達(dá)到抑制血小板聚焦80%以上。4利用枸櫞酸鹽抗凝劑評(píng)價(jià),本品抑制血小板聚焦作用較其它非螯合型抗凝劑強(qiáng)2-4倍。本品可使急性冠脈綜合征病人及進(jìn)行PCI術(shù)病人的出血時(shí)間延長(zhǎng)2-4倍(與其基線值相比),在停止輸注本品后1小時(shí)內(nèi)恢復(fù)正常。本品經(jīng)大鼠、兔和猴的安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn),未見(jiàn)毒性反應(yīng)的跡象,給猴連續(xù)靜脈輸注28天,每天劑量高達(dá)7.2mg/kg也未見(jiàn)毒性表現(xiàn)。血小板糖蛋白GPlIb/IIIa受體拮抗劑代表了目前介入性心臟病學(xué)最大進(jìn)展之一。大規(guī)模、隨機(jī)、對(duì)照臨床試驗(yàn)已無(wú)可爭(zhēng)議地確認(rèn)了其在心臟病介入治療中的地位,它可大約減少患者圍手術(shù)期缺血并發(fā)癥50%60%,而且,當(dāng)肝素使用劑量合適時(shí)可不明顯增加出血事件發(fā)生率。Eptifibatide適用于治療急性冠脈綜合征,包括不穩(wěn)定型心絞痛或無(wú)Q波心肌梗塞(既24小時(shí)內(nèi)胸痛持續(xù)發(fā)作、心電圖改變和/或心血管系統(tǒng)酶升高);也可用于經(jīng)皮冠脈介入療法,包括血管成形術(shù)或動(dòng)脈粥樣斑塊切除術(shù)。一般不用于無(wú)急性冠脈綜合征的血管成形術(shù)。在專(zhuān)人監(jiān)管下,本品可與阿司匹林或肝素輔用。Eptifibatide的優(yōu)點(diǎn)①對(duì)血小板糖蛋白IIb/IIIa受體的阻滯是可逆的,一旦出現(xiàn)不良反應(yīng)可立即停藥,不良反應(yīng)輕。②選擇性高,作用強(qiáng)。③本身幾乎無(wú)抗原性,不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)。Eptifibatide的制備與其它小的二硫化物連接的肽類(lèi)相似,可由常規(guī)的固相肽合成法或在溶液中進(jìn)行的碎片合成法制備?,F(xiàn)在己經(jīng)有了一些研究機(jī)構(gòu)和個(gè)人發(fā)表了一些合成專(zhuān)利CN1500805、EP1735345、US482263、US542488、US5968902和US20060036071等。目前已經(jīng)公布的Eptifibatide制備工藝都有著一定的缺陷,不能在操作復(fù)雜性、危險(xiǎn)性、生產(chǎn)周期、產(chǎn)品總收率、產(chǎn)品成本和污染環(huán)境等方面達(dá)到一種較好的結(jié)合;應(yīng)用價(jià)值不高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供了一種高收率、低成本、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的Eptifibatide固相法合成工藝,解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采取以下技術(shù)方案5一種固相法制備Eptifibatide的方法,包括以下步驟1)選擇替代度為0.2mmol/g1.0mmol/g的Sieber樹(shù)脂進(jìn)行去Fmoc反應(yīng),得到H2N-Sieber樹(shù)脂;2)以H2N-Sieber樹(shù)脂為起始原料,采用Fmoc/tBu固相法逐一偶聯(lián)依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸,合成得到側(cè)鏈全保護(hù)線性肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂,-3)對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)線性肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂進(jìn)行固相氧化,得到側(cè)鏈全保護(hù)氧化肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂;4)對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)氧化肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂進(jìn)行樹(shù)脂的切割和側(cè)鏈保護(hù)的脫除,得到Eptifibatide粗品;5)Eptifibatide粗品經(jīng)過(guò)高壓液相柱分離純化、凍干機(jī)凍干得到Eptifibatide精肽。優(yōu)選的方案是所述Sieber樹(shù)脂替代度為0.4mmol/g0.6mmol/g。更為優(yōu)選的方案是所述具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸氨基均采用Fmoc基團(tuán)保護(hù),而側(cè)鏈采用特定保護(hù),各種氨基酸分別以Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc國(guó)Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(pbf)-OH和Acm-Mpr-OH的形式應(yīng)用。更為優(yōu)選的方案是所述的逐一偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑體系DIC+A或B+A,其中A為HOBt或者HOAt;B為HBTU或者HATU或者TBTU或者PyBOP。更為優(yōu)選的方案是所述的逐一偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑體系是DIC/HOAt。更為優(yōu)選的方案是所述側(cè)鏈全保護(hù)線性肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂進(jìn)行固相氧化采用的氧化劑是碘,該氧化劑碘的用量是相對(duì)于合成規(guī)模摩爾數(shù)的5-20倍;反應(yīng)溶劑是N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和二甲基亞砜(DMSO)中的一種或者幾種混合物;反應(yīng)時(shí)間采用4小時(shí);反應(yīng)溫度2030攝氏度。更為優(yōu)選的方案是:所述氧化劑碘的用量是相對(duì)于合成規(guī)模摩爾數(shù)的10倍,反應(yīng)溶劑采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。更為優(yōu)選的方案是所述對(duì)線性肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂進(jìn)行氧化,得到氧化肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂,反應(yīng)結(jié)束反應(yīng)物碘的清除采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)輪換清洗,然后使用六氫吡啶/DMF溶液進(jìn)行清洗。更為優(yōu)選的方案是所述側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide-Sieber經(jīng)過(guò)脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng),獲得Eptifibatide粗品的過(guò)程中,使用的裂解液體系是三氟乙酸:水=95:5(v/v),或者是三氟乙酸:水:三乙基硅垸二90:5:5(v/v),或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:1,2-乙二硫醇=82.5:5:5:5:2.5(v/v),或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:1,2-乙二硫醇:三異丙基硅烷=82.5:5:5:5:2.5:1(v/v),或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:1,2-乙二硫醇=90:5:3:2(v/v)。更為優(yōu)選的方案是所述裂解液體系是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:l,2-乙二硫醇二90:5:3:2(v/v)。與已有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明提供了一種反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的Eptifibatide的固相合成工藝。本發(fā)明的工藝具有反應(yīng)操作簡(jiǎn)單、后處理容易、原料投入少、成本低、收率高等特點(diǎn),具有可觀的經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值,同時(shí)在多肽藥物設(shè)計(jì)合成領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。圖l是本發(fā)明總的工藝流程圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的縮寫(xiě)的含義列如表1所示表1縮略詞表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>TBTUO-(苯并三唑-l-氧)-N,N,N,,N,-四甲基脲鑰六氟硼酸鹽PyBOP(苯并三唑-l-氧)三吡咯垸子基磷鎗六氟磷酸鹽DIC二異丙基碳二亞胺HOBtl-羥基苯并三唑HOAtl-羥基-7-偶氮苯并三唑DIPEA二異丙基乙胺TMP2,4,6-三甲基吡啶pbf2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?;鵗rt三苯甲基但u叔丁基DMFN,N-二甲基甲酰胺DCM二氯甲烷20%DBLK2(P/。六氫吡啶/DMF溶液Acm乙酰胺基甲基Mpr3-巰基丙酸SieberResin9-氨基-口占噸-3-氧-Merrifield樹(shù)脂實(shí)施例1線性側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂的制備將Sieber樹(shù)脂100.0g,替代度為0.6mmol/g,加入到固相反應(yīng)柱中,用DMF溶脹樹(shù)脂30分鐘。溶脹完全后,用20%DBLK去Fmoc保護(hù)10min+20min,后用DMF洗滌六次。將Fmoc-Cys(Acm)-OH49.74g、HBTU38.52g、HOBt16.2g和DIPEA41.8ml加入到反應(yīng)柱中,反應(yīng)兩小時(shí)結(jié)束。重復(fù)前面的操作,分別對(duì)Fmoc畫(huà)Pro-OH、Fmoc國(guó)Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Homoarg(pbf)-OH和Acm-Mpr-OH進(jìn)行偶聯(lián)。偶聯(lián)結(jié)束,樹(shù)脂用DMF洗滌三次,DCM洗滌三次,甲醇收縮三次,真空干燥后稱(chēng)重得到172.1g線性側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂。本實(shí)施例的另一優(yōu)選方案是將Sieber樹(shù)8脂1200.0g,替代度為0.59mmol/g,加入到固相反應(yīng)柱中,用DMF溶脹樹(shù)脂30分鐘。溶脹完全后,用20%DBLK去Fmoc保護(hù)10min+20min,后用DMF洗滌六次。將Fmoc-Cys(Acm)陽(yáng)OH597g、HBTU462g、HOBt194g和DIPEA502ml加入到反應(yīng)柱中,反應(yīng)三小時(shí)結(jié)束。重復(fù)前面的操作,分別對(duì)Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Homoarg(pbf)-OH和Acm-Mpr-OH進(jìn)行偶聯(lián)。偶聯(lián)結(jié)束,樹(shù)脂用DMF洗滌三次,DCM洗滌三次,甲醇收縮三次,真空干燥后稱(chēng)重得到2031g線性側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂。實(shí)施例2氧化型側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂的制備將172.1g線性側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂用DMF溶脹30分鐘。溶脹完全后,將用適量DMF溶解的304.8g碘加入到裝有樹(shù)脂的反應(yīng)柱中,氧化反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束,用DMF洗滌十次,DCM洗滌三次,甲醇收縮三次,真空干燥后稱(chēng)重得到164.1g氧化型側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂。實(shí)施例3氧化型側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂的制備將1893g線性側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂用DMF溶脹30分鐘。溶脹完全后,將用適量DMF溶解的3350g碘加入到裝有樹(shù)脂的反應(yīng)柱中,氧化反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束,用DMF洗滌十次,DCM洗滌三次,甲醇收縮三次,真空干燥后稱(chēng)重得到1740g氧化型側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂。實(shí)施例4Eptifibatide粗肽的制備將164.1g氧化型側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂加入至3L的圓底燒瓶中,后加入1641ml裂解液(配比三氟乙酸水三異丙基硅烷=95:2.5:2.5),反應(yīng)兩小時(shí)。裂解反應(yīng)結(jié)束,過(guò)濾,濾液用16.4L冰乙醚沉淀、離心、洗滌、再離心、再洗滌、再離心,最后真空干燥。稱(chēng)重得到Eptifibatide粗肽46.9g。實(shí)施例5Eptifibatide粗肽的制備將1477g氧化型側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide肽樹(shù)脂加入至30L的反應(yīng)瓶中,后加入14.8L裂解液(配比三氟乙酸水三異丙基硅垸=95:2.5:2.5),反應(yīng)兩小時(shí)。裂解反應(yīng)結(jié)束,過(guò)濾,濾液用140L冰乙醚沉淀、離心、洗滌、再離心、再洗滌、再離心,最后真空干燥。稱(chēng)重得到Eptifibatide粗肽420g。實(shí)施例6Eptifibatide精肽的制備將Eptifibatide粗肽46.9g采用高壓液相制備后,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)鹽、凍干,最后稱(chēng)重得到Eptifibatide精肽30.9g??偸章士蛇_(dá)61.2%。實(shí)施例7Eptifibatide精肽的制備將Eptifibatide粗肽375g采用高壓液相制備后,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)鹽、凍干,最后稱(chēng)重得到Eptifibatide精肽251g??偸章士蛇_(dá)62.3%。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明,不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換,都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1.一種固相法制備Eptifibatide的方法,包括以下步驟1)選擇替代度為0.2mmol/g~1.0mmol/g的Sieber樹(shù)脂進(jìn)行去Fmoc反應(yīng),得到H2N-Sieber樹(shù)脂;2)以H2N-Sieber樹(shù)脂為起始原料,采用Fmoc/tBu固相法逐一偶聯(lián)依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸,合成得到側(cè)鏈全保護(hù)線性肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂;3)對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)線性肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂進(jìn)行固相氧化,得到側(cè)鏈全保護(hù)氧化肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂;4)對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)氧化肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂進(jìn)行樹(shù)脂的切割和側(cè)鏈保護(hù)的脫除,得到Eptifibatide粗品;5)Eptifibatide粗品經(jīng)過(guò)高壓液相柱分離純化、凍干機(jī)凍干得到Eptifibatide精肽。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述固相法制備Eptifibatide的方法,其特征在于所述Sieber樹(shù)脂替代度為0.4mmol/g0.6mmol/g。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述固相法制備Eptifibatide的方法,其特征在于所述具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸氨基均采用Fmoc基團(tuán)保護(hù),而側(cè)鏈采用特定保護(hù),各種氨基酸分別以Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Pro隱OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(pbf)-OH和Acm-Mpr-OH的形式應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述固相法制備Eptifibatide的方法,其特征在于所述的逐一偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑體系是DIC+A或B+A,其中A為HOBt或者HOAt;B為HBTU或者HATU或者TBTU或者PyBOP。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述固相法制備Eptifibatide的方法,其特征在于所述的逐一偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑體系是DIC/HOAt。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述固相法制備Eptifibatide的方法,其特征在于:所述對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)線性肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂進(jìn)行固相氧化采用的氧化劑是碘,該氧化劑碘的用量是相對(duì)于合成規(guī)模摩爾數(shù)的5-20倍;反應(yīng)溶劑是N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲垸、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亞砜中的一種或者幾種混合物;反應(yīng)時(shí)間采用4小時(shí);反應(yīng)溫度2030攝氏度。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述固相法制備Eptifibatide的方法,其特征在于所述氧化劑碘的用量是相對(duì)于合成規(guī)模摩爾數(shù)的10倍,反應(yīng)溶劑采用N,N-二甲基甲酰胺。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述固相法制備Eptifibatide的方法,其特征在于所述對(duì)線性肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂進(jìn)行氧化,得到氧化肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)月旨,反應(yīng)結(jié)束反應(yīng)物碘的清除采用N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷輪換清洗,然后使用六氫吡啶/DMF溶液進(jìn)行清洗。9.根據(jù)權(quán)利要求l所述固相法制備Eptifibatide的方法,其特征在于所述側(cè)鏈全保護(hù)Eptifibatide-Sieber經(jīng)過(guò)脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng),獲得Eptifibatide粗品的過(guò)程中,使用的裂解液體系是三氟乙酸:水-95:5(v/v),或者是三氟乙酸:水:三乙基硅烷=90:5:5(v/v),或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:l,2-乙二硫醇=82.5:5:5:5:2.5(v/v),或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:水:苯酚:l,2-乙二硫醇:三異丙基硅烷=82.5:5:5:5:2.5:1(v/v),或者是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:l,2-乙二硫醇-90:5:3:2(v/v)。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述固相法制備Eptifibatide的方法,其特征在于所述裂解液體系是三氟乙酸:苯甲硫醚:苯甲醚:l,2-乙二硫醇-90:5:3:2(v/v)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種固相法制備Eptifibatide的方法,包括步驟1)選擇Sieber樹(shù)脂進(jìn)行去Fmoc反應(yīng),得到H<sub>2</sub>N-Sieber樹(shù)脂;2)采用Fmoc/tBu固相法逐一偶聯(lián)合成側(cè)鏈全保護(hù)線性肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂;3)進(jìn)行樹(shù)脂固相氧化,得到側(cè)鏈全保護(hù)氧化肽Eptifibatide-Sieber樹(shù)脂;4)進(jìn)行樹(shù)脂的切割和側(cè)鏈保護(hù)的脫除,得到Eptifibatide粗品;5)分離純化、凍干機(jī)凍干得到Eptifibatide精肽。本發(fā)明的工藝操作簡(jiǎn)單、后處理容易、原料投入少、成本低、收率高等特點(diǎn),具有可觀的經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值,同時(shí)在多肽藥物設(shè)計(jì)合成領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C07K7/00GK101538316SQ20091010499公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年1月13日優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日發(fā)明者李紅玲,袁建成,覃亮政,馬亞平申請(qǐng)人:深圳市翰宇藥業(yè)有限公司
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