專利名稱：：一種血紅蛋白提取液的制備方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明屬于血紅蛋白的分離純化工藝
技術(shù)領域：
，具體地說，涉及血紅蛋白分離純化工藝中制備血紅蛋白提取液的方法。
背景技術(shù)：
：血紅蛋白的分離純化工藝是攜氧材料研制的重要工藝步驟。已有的以無基質(zhì)血紅蛋白為載體的攜氧材料中，除基因工程重組表達的血紅蛋白外，大部分血紅蛋白都來源于動物，包括牛、豬、人等，要利用這些動物血紅蛋白，首先需要一種低成本、易標準化的血紅蛋白純化方法。現(xiàn)有的血紅蛋白純化方法主要有加熱法、超濾法、萃取法、陰離子交換柱層析法等。加熱法和萃取法對血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響不可避免，且萃取法引入的有機溶劑也是一種潛在的危險因素；超濾法雖然便于進行密閉的流水線生產(chǎn)，但超濾膜需要經(jīng)常更換，成本高昂；陰離子交換柱層析法成本低，對血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)沒有影響，且不引入有機溶劑，因而是最有前景的血紅蛋白純化方法。陰離子交換柱層析法對用于上柱的蛋白提取液有以下兩個方面的要求(1)蛋白提取液必須不含大顆粒物，一般要求經(jīng)0.45,濾膜過濾；(2)蛋白提取液中的蛋白成分應盡可能少，并盡可能減少與陰離子交換柱層析介質(zhì)作用強烈的成分的含量。傳統(tǒng)的用于陰離子交換層析的血紅蛋白提取液的制備方法，一般包括以下步驟(1)將壓積紅細胞與低滲溶液(通常是水)按照一定體積比混合以制備低滲環(huán)境，靜置過夜使紅細胞破碎；(2)離心紅細胞破碎液，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管；(3)將上清以0.45,濾膜過濾，得到血紅蛋白提取液；(4)將血紅蛋白提取液置換至陰離子交換層析平衡緩沖液體系。通過上述傳統(tǒng)方法制備血紅蛋白提取液，除了紅細胞破碎液體積大，不利于后續(xù)步驟開展以外，更重要的是存在以下兩個方面的問題:(1)得到的血紅蛋白提取液難于通過0.45jiim濾膜，因此需要頻繁地更換濾膜，更換濾膜的過程提高了提取液中高鐵血紅蛋白的含(2)得到的血紅蛋白提取液中含有較多的磷脂及脂蛋白，以填料能耐受的最大強度的洗脫溶液也不能將其洗脫，必須執(zhí)行清潔程序。清潔程序需要耗費大量的乙醇或異丙醇，且時間較長，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種適用于陰離子交換柱層析法大量生產(chǎn)要求的血紅蛋白提取液的制備方法，采用該方法制備的血紅蛋白提取液易于通過0.45拜濾膜，脂蛋白及磷脂含量少。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述血紅蛋白提取液的制備方法，包括以下步驟，各步驟均在010"C的環(huán)境溫度條件下進行(1)將壓積紅細胞置于透析袋中，用緩沖液經(jīng)低滲透壓破碎，得到紅細胞破碎液；(2)將與0。C時終飽和度為540%對應量的硫酸銨加入紅細胞破碎液中，待硫酸銨充分溶解后以400016000G離心；(3)向步驟(2)離心所得的上清液中加入與0。C時終飽和度為4080%對應量的硫酸銨，待硫酸鉸充分溶解后以200010000G離心；(4)將步驟(3)離心所得的蛋白沉淀重懸后轉(zhuǎn)入透析袋中，用緩沖液透析去除硫酸銨；(5)經(jīng)過透析的蛋白液用緩沖液按體積比為1:11:10進行稀釋，然后以800016000G離心，去除顆粒物。本發(fā)明的步驟(1)中采用透析的方式制造低滲透壓環(huán)境使紅細胞破碎，有效減小了紅細胞破碎液的體積，增加了溶液的密度，從而為后續(xù)的硫酸銨分級分離創(chuàng)造了條件；并且因為紅細胞破碎液體積小，極大的節(jié)約了硫酸銨的用量。采用步驟(2)和步驟(3)的兩步硫酸銨沉淀操作，制備不同的溶液密度，使得脂蛋白和磷脂在相應密度與離心力條件下與血紅蛋白處于離心管中的不同位置，因而使絕大部分的脂蛋白以及部分雜蛋白得以去除。實踐表明，經(jīng)過本發(fā)明方法制備的血紅蛋白提取液，與傳統(tǒng)的用于陰離子交換層析的血紅蛋白提取液制備方法相比，其脂蛋白與磷脂含量殘留率小于2%，易于通過0.45nm濾膜；且硫酸銨用量少，純化成本低，血紅蛋白回收率較高，具有很好的應用前景。附圖是本發(fā)明與傳統(tǒng)的用于陰離子交換層析的血紅蛋白提取液制備方法相比，制備的血紅蛋白提取液的SDS-PAGE分析結(jié)果對照圖；圖中M表示蛋白分子量標準；C表示傳統(tǒng)方法制備的血紅蛋白提取液；D表示本發(fā)明方法制備的血紅蛋白提取液。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1:在010r的環(huán)境溫度條件下依次進行以下操作(1)將壓積紅細胞置于平均截留分子量為514kDa的透析袋中經(jīng)低滲透壓破碎得到紅細胞破碎液，透析所用的緩沖液為經(jīng)過脫氧處理的Tris-HC1緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為50raM，pH值為9.0;(2)將與0。C時終飽和度為40%對應量的硫酸銨加入紅細胞破碎液中，待硫酸銨充分溶解后以12000G離心；(3)向步驟(2)中離心所得的上清液中加入與O"C時終飽和度為80%對應量的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后以16000G離心；(4)將步驟(3)所得的沉淀蛋白重懸后轉(zhuǎn)入平均截留分子量為514kDa的透析袋中透析以除去硫酸銨，透析所用緩沖液為經(jīng)過脫氧處理的Tris-HC1，NaCl緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為100mM，NaCl濃度為50mM，緩沖液的pH值為9.0;(5)經(jīng)過透析的蛋白液用緩沖液按體積比為1:10的比例進行稀釋，然后以8000G離心去除顆粒物，所用緩沖液是經(jīng)過脫氧處理的Tris-HC1，NaCl緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為100mM，NaCl濃度為50mM，緩沖液的pH值為9.0。實施例2:在010'C的環(huán)境溫度條件下依次進行以下操作(1)將壓積紅細胞在平均截留分子量為32kDa的透析袋中經(jīng)低滲透壓破碎得到紅細胞破碎液，所用透析液為經(jīng)過脫氧處理的THs-HCl緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為5mM，pH值為7.0;(2)將與O'C時終飽和度為5%對應量的硫酸銨加入紅細胞破碎液中，待硫酸銨充分溶解后以8000G離心；(3)向步驟(2)中離心所得的上清液中加入與O'C時終飽和度為40%對應量的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后以2000G離心；U)將步驟(3)所得的沉淀蛋白重懸后轉(zhuǎn)入平均截留分子量為32kDa的透析袋中透析以除去硫酸銨，透析所用緩沖液為經(jīng)過脫氧處理的Tris-HC1,NaCl緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為10mM，NaCl濃度為10mM，緩沖液的pH值為8.0;(5)經(jīng)過透析的蛋白液用緩沖液按體積比為1:1的比例進行稀釋，然后以16000G離心去除顆粒物，所用緩沖液為經(jīng)過脫氧處理的Tris-HC1，NaCl緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為10mM，NaCl濃度為lOmM，緩沖液的pH值為8.0;實施例3:在010匸的環(huán)境溫度條件下依次進行以下操作(1)將壓積紅細胞在平均截留分子量為60kDa的透析袋中經(jīng)低滲透壓破碎得到紅細胞破碎液，透析所用緩沖液為經(jīng)過脫氧處理的Tris-HCl緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為100mM，pH值為8.0;(2)將與0。C時終飽和度為25%對應量的硫酸銨加入紅細胞破碎液中，待硫酸銨充分溶解后以4000G離心；(3)向步驟(2)中離心所得的上清液中加入與O'C時終飽和度為60%對應量的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后以6000G離心；(4)將步驟(3)所得的沉淀蛋白重懸后轉(zhuǎn)入平均截留分子量為60kDa的透析袋中透析以除去硫酸銨，透析所用緩沖液為經(jīng)過脫氧處理的Tris-HC1，NaCl緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為55mM，NaCl濃度為30涵，緩沖液的pH值為8.5;(5)經(jīng)過透析的蛋白液用緩沖液按體積比為1:5的比例進行稀釋，然后以10000G離心去除顆粒物，所用緩沖液是經(jīng)過脫氧處理的Tris-HC1，NaCl緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為55mM，NaCl濃度為30mM，緩沖液的pH值為8.5。上述三個實施例所得血紅蛋白提取液的參數(shù)如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>可以看出，利用本發(fā)明方法制備血紅蛋白提取液，血紅蛋白回收率大于80%，脂蛋白及磷脂殘留量小于2%，易于通過0.45,濾膜，非常適合于陰離子交換柱層析法大量生產(chǎn)的要求。說明書附圖是本發(fā)明方法與傳統(tǒng)方法制備的血紅蛋白提取液的SDS-PAGE對照分析圖。從圖中可以看出，采用本發(fā)明方法制備的血紅蛋白提取液中蛋白成分得到有效的減少，且血紅蛋白含量提高。權(quán)利要求1.一種血紅蛋白提取液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟，各步驟均在0～10℃的環(huán)境溫度條件下進行(1)將壓積紅細胞置于透析袋中，用緩沖液經(jīng)低滲透壓破碎，得到紅細胞破碎液；(2)將與0℃時終飽和度為5～40％對應量的硫酸銨加入紅細胞破碎液中，待硫酸銨充分溶解后以4000～16000G離心；(3)向步驟(2)離心所得的上清液中加入與0℃時終飽和度為40～80％對應量的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后以2000～10000G離心；(4)將步驟(3)離心所得的蛋白沉淀重懸后轉(zhuǎn)入透析袋中，用緩沖液透析去除硫酸銨；(5)經(jīng)過透析的蛋白液用緩沖液按體積比為1∶1～1∶10進行稀釋，然后以8000～16000G離心，去除顆粒物。2.如權(quán)利要求1所述的一種血紅蛋白提取液的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)和步驟(4)中所用透析袋的平均截留分子量小于64kDa。3.如權(quán)利要求1所述的一種血紅蛋白提取液的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中所用緩沖液為經(jīng)過脫氧處理的Tris-HCl緩沖液，緩沖液的Trisbase濃度為5100mM，pH值為7.09.0。4.如權(quán)利要求1所述的一種血紅蛋白提取液的制備方法，其特征在于，步驟(4)和步驟(5)中所用的緩沖液為經(jīng)過脫氧處理的Tris-HCl，NaCl緩沖液，緩沖液中的Trisbase濃度為10100mM，NaCl濃度為1050mM，緩沖液的pH值為8.09.0。全文摘要本發(fā)明提供了一種血紅蛋白提取液的制備方法，依次進行如下操作將壓積紅細胞在透析袋中經(jīng)低滲透壓破碎得到紅細胞破碎液；用0℃時終飽和度為5～40％和40～80％對應量的硫酸銨進行兩步沉淀，然后將沉淀蛋白重懸后轉(zhuǎn)入透析袋中透析以去除硫酸銨，最后將透析的蛋白液用緩沖液稀釋，并離心去除顆粒物。利用本發(fā)明方法制備血紅蛋白提取液，血紅蛋白回收率大于85％，脂蛋白及磷脂殘留量小于2％，易于通過0.45μm濾膜，非常適合于陰離子交換柱層析法大量生產(chǎn)的要求。文檔編號C07K1/34GK101575373SQ200910104070公開日2009年11月11日申請日期2009年6月12日優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日發(fā)明者劉建倉,劉良明,李東紅,婷胥,臧家濤申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所