一種聚合血紅蛋白的超濾方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及的是用于聚合血紅蛋白的超濾方法，其特征在于在0～4℃及通氮等條件下，本發(fā)明的技術(shù)方案：一種聚合血紅蛋白超濾方法，其特征在于它包括以下步驟：在超濾試驗裝置中，使溶液在泵送條件下正壓循環(huán)，調(diào)節(jié)蠕動泵的速度與調(diào)節(jié)閥來控制進口壓力為0.1MPa，回流壓力0.02MPa，料液pH7.0～8.0，溫度4℃，并在儲液罐里不斷補充磷酸鹽緩沖液，從而達到分離去掉溶液中小分子的目的。先對純化血紅蛋白進行聚合，所用雙功能試劑為戊二醛，再選用規(guī)格為為100kD截留分子量超濾膜堆對濃度為0.5％聚合血紅蛋白溶液進行超濾，超濾緩沖液倍數(shù)是原始體積的8～10倍。
【專利說明】一種聚合血紅蛋白的超濾方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種聚合血紅蛋白超濾方法。
(二)【背景技術(shù)】:
[0002]以輸入全血為主要手段的傳統(tǒng)輸血方式在醫(yī)療救護方面發(fā)揮了極為重要的作用，但同時其自身也存在難以克服的各種缺點，主要表現(xiàn)在:輸入前需進行交叉配型、存在多種病毒交叉感染的危險、血源緊張、貯存期較短且需要特殊的設(shè)施。為了解決上述矛盾，人們早在19世紀(jì)末就開始了有關(guān)紅細(xì)胞代用品的研究。紅細(xì)胞代用品是指具有擴充血容積、維持血管內(nèi)外滲透壓平衡并且有載氧功能，用以代替人紅細(xì)胞的各種氧載體的總稱。血液代用品的研制經(jīng)歷了從最初無載氧功能的血管擴容劑，如:高滲鹽溶液、羥乙基淀粉溶液、明膠等到目前具有攜氧功能的各種載體溶液。目前正在研制的以血紅蛋白為基礎(chǔ)各類產(chǎn)品與全血比較具有諸多優(yōu)點，如:來源廣泛、安全潔凈、可長期保存、輸入人體前無需進行交叉配型，特別適用于戰(zhàn)爭、自然災(zāi)害、以及其他突發(fā)事件中大量出血病人的急救。血紅蛋白是人體內(nèi)的物質(zhì)，它的溶液作為紅細(xì)胞代用品比化學(xué)合成物質(zhì)更具優(yōu)越性。
[0003]目前已有5家以血紅蛋白為基礎(chǔ)的產(chǎn)品完成或接近完成了III期臨床研究，取得了明顯的進展。然而，這些產(chǎn)品應(yīng)用于臨床時都程度不同地出現(xiàn)了諸如血管收縮、血壓升高，心臟、腎臟、肝臟等器官受損等毒副作用。雖然引起這類毒副作用的主要原因還需要進一步研究，但現(xiàn)在可以確定的是:一方面這些以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代用品(HBOCs)以小分子的形式進入血管壁內(nèi)皮細(xì)胞能結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的舒張因子一氧化氮，從而誘導(dǎo)系統(tǒng)血管收縮進而造成血壓升高；另一方面，由于小分子的粒徑小于腎小球的濾過作用的閾值，經(jīng)腎臟排出體外，引起血紅 蛋白尿，嚴(yán)重的還會造成腎功能損傷或衰竭。因此，對這些HBOCs中小分子要盡量的去除，目前降低HBOCs中小分子含量的技術(shù)主要是柱層析和超濾，但前者主要存在的問題是操作周期長、成本高、產(chǎn)品得率低、難以適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)需要，后者則不僅操作周期短、操作簡單且在操作的過程中不會對血紅蛋白的生物活性、二級結(jié)構(gòu)等造成損傷。
[0004]目前已有比較多的超濾技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量分級分離的研究報道，如平板式膜應(yīng)用于分離免疫球蛋白，在細(xì)胞色素丙的純化過程中使用超濾技術(shù)，應(yīng)用萃取-超濾兩步法從過期人血中提純?nèi)搜椎鞍?，以及?yīng)用超濾技術(shù)分離血漿蛋白等。但超濾法用于HBOCs制品分子量的分級鮮見系統(tǒng)報道。超濾的原理是通過篩孔分離，主要利用壓力差為推動力使溶液中的大分子截留，溶液中溶劑和小分子從高壓側(cè)透過到低壓側(cè)的分離過程。溶質(zhì)或懸浮物料按大小不同而分離，比膜孔小的物質(zhì)和溶劑一起透過膜，而較大的物質(zhì)則被截留。以戊二醛為交聯(lián)劑的PolyPHb是一種分子量連續(xù)分布且分布較寬的物質(zhì)，采用本專利工藝使得制品分子量的分布較窄，且達到去除小分子的效果。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種聚合血紅蛋白超濾方法，它針對上述情況，發(fā)明一種操作簡便、成本低廉、高效的超濾工藝。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種聚合血紅蛋白超濾方法，其特征在于它包括以下步驟:
(I)在超濾試驗裝置中，使溶液在泵送條件下正壓循環(huán)，調(diào)節(jié)蠕動泵的速度與調(diào)節(jié)閥來控制進口壓力為0.1MPa，回流壓力0.02MP，料液PH7.0~8.0，溫度4°C (由于PolyPHb溫度高會造成高鐵血紅蛋白產(chǎn)生及變性)，并在儲液罐里不斷補充磷酸鹽緩沖液，從而達到分離去掉溶液中小分子的目的。
[0007]上述步驟(1)中制備所用的原料天然紅細(xì)胞來源為人胎盤血或過期的庫存人血。
[0008]上述步驟(1)中先對純化血紅蛋白進行聚合，所用雙功能試劑為戊二醛。
[0009]上述步驟(1)中對聚合后血紅蛋白進行超濾，所用超濾膜堆規(guī)格為為IOOkD截留
分子量。
[0010]上述步驟(1)中超濾聚合血紅蛋白濃度為0.5%。
[0011]上述步驟(1)中超濾緩沖液倍數(shù)是原始體積的8~10倍
[0012]本發(fā)明的工作原理為:篩孔分離，主要利用壓力差為推動力使溶液中的大分子截留，溶液中溶劑和小分子從高壓側(cè)透過到低壓側(cè)的分離過程。溶質(zhì)或懸浮物料按大小不同而分離，比膜孔小的物質(zhì)和溶劑一起透過膜，而較大的物質(zhì)則被截留。以戊二醛為交聯(lián)劑的PolyPHb是一種分子量連續(xù)分布且分布較寬的物質(zhì)，采用本專利工藝使得制品分子量的分布較窄，且達到去除小分子的效果。
[0013]本發(fā)明的技術(shù)效果在于:在優(yōu)選合`適超工藝上做了大量研究，結(jié)果表明，以結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)穩(wěn)定、截留分子量合適、超濾效果最好為原則，確定超濾膜的規(guī)格為IOOkD截留分子量膜堆、PolyPHb濃度為0.5%、超濾倍數(shù)8~10倍為最適組和。
(四)【具體實施方式】:
[0014]以下將通過【具體實施方式】的形式再對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于以下的【具體實施方式】，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0015]實施例1超濾實驗
[0016]在超濾試驗裝置中，使溶液在泵送條件下正壓循環(huán)，調(diào)節(jié)蠕動泵的速度與調(diào)節(jié)閥來控制進口壓力為0.1MPa,回流壓力0.02MP，料液ρΗ7.3~7.4，溫度4°C，并在儲液罐里不斷補充磷酸鹽緩沖液，使之達到分離濃縮目的。
[0017]實施例2超濾膜的選擇與實驗前清洗
[0018]I)選用的膜堆面積均為0.lm2，截留分子量為IOOkD與300kD2種規(guī)格，超濾液經(jīng)
0.22 um膜過濾后使用，PolyPHb濃度為0.5 %，容量為200mL，邊超濾邊加入PBS液保持200mL體積，直至超濾10倍(超濾2L)后停止，取樣以HPLC檢測PolyPHb分子量分布。
[0019]2)先將調(diào)節(jié)閥門打開，用蒸餾水洗滌殘留液體后，再將加熱到50°C的0.5mol / LNaOH溶液采取連續(xù)體積洗濾方式循環(huán)>1L，再逐次用50°C蒸餾水和4°C磷酸鹽緩沖液充分洗滌至中性待用；使用后的超濾膜經(jīng)同樣步驟清洗，最后打入0.1mol / L NaOH溶液浸泡放置。
[0020]實施例3PolyPHb濃度的選擇
[0021]超濾前，將0.22 μ m膜過濾的PBS液，以PolyPHb將其濃度分別稀釋成0.5%、I %，1.5%，均為200mL ;在相同條件下用IOOkD膜堆超濾，邊超濾邊加入PBS保持200mL體積，
0.5%、1%、1.5%各超濾20倍(4L)后停止，取樣HPLC檢測PolyPHb分子量分布。
[0022]實施例4超濾倍數(shù)的選擇
[0023]超濾前，經(jīng)0.22μπι膜過濾的PBS液，PolyPHb濃度為0.5%、容量為200mL，用IOOkD膜堆超濾，邊超濾邊加入PBS保持200mL體積，分別等體積超濾8倍、10倍、12倍，取樣HPLC檢測PolyPHb分子量分布`。
【權(quán)利要求】
1.一種聚合血紅蛋白的超濾方法，其特征在于它包括以下步驟:(1)在超濾試驗裝置中，使溶液在泵送條件下正壓循環(huán)，調(diào)節(jié)蠕動泵的速度與調(diào)節(jié)閥來控制進口壓力為0.1MPa,回流壓力0.02MP，料液pH7.0~8.0，溫度4°C，并在儲液罐里不斷補充磷酸鹽緩沖液，從而達到分離去掉溶液中小分子的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的一種聚合血紅蛋白超濾方法，所超濾聚合血紅蛋白濃度為0.5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚合血紅蛋白超濾方法，超濾緩沖液倍數(shù)是原始體積的8~10倍。
【文檔編號】C07K1/34GK103694344SQ201310703254
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】李鳳娟, 李燊, 馮杰 申請人:天津工業(yè)大學(xué)