血紅蛋白類的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種血紅蛋白類的測定方法，其能夠在短時間內(nèi)高精度地對血紅蛋白類進(jìn)行測定。另外，本發(fā)明的目的在于提供使用該血紅蛋白類的測定方法的血紅蛋白A1c的測定方法、血紅蛋白A1c與血紅蛋白F的同時測定方法、血紅蛋白A1c與血紅蛋白A2的同時測定方法、以及血紅蛋白A1c與異常血紅蛋白類的同時測定方法。本發(fā)明是一種借助液相色譜的血紅蛋白類的測定方法，其中，填充陽離子交換性粒子作為柱填充劑，所述陽離子交換性粒子包含在交聯(lián)聚合物粒子的表面含有陽離子交換基的聚合物，并且使用以1.0mL／分鐘輸送測定中所使用的洗脫液時的壓力值為9.8×103Pa以上且29.4×105Pa以下的柱。
【專利說明】血紅蛋白類的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用液相色譜的血紅蛋白類的測定方法。另外，本發(fā)明涉及使用該血紅蛋白類的測定方法的血紅蛋白AlC的測定方法、血紅蛋白Alc與血紅蛋白F的同時測定方法、血紅蛋白Alc與血紅蛋白A2的同時測定方法、以及血紅蛋白Alc與異常血紅蛋白類的同時測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]借助液相色譜的血紅蛋白類的測定方法能夠在短時間內(nèi)進(jìn)行測定，且精度比其他測定方法高，因此特別地被應(yīng)用于糖尿病患者的血紅蛋白Alc值的管理。
[0003]對于借助液相色譜的現(xiàn)有的血紅蛋白類的測定方法，為了在短時間內(nèi)進(jìn)行測定，要以一定速度以上的流速輸送洗脫液，或者為了維持高精度，要使用微小的填充劑粒子，因此測定體系中產(chǎn)生的壓力值變高。
[0004]例如在專利文獻(xiàn)I所公開的技術(shù)中，在洗脫液的流速為1.0mL /分鐘的情況下，測定體系中產(chǎn)生的壓力值為約5MPa。對于通常進(jìn)行的血紅蛋白類的測定中的測定體系中產(chǎn)生的壓力值，與專利文獻(xiàn)I中公開的技術(shù)同等或者為其以上。可見，現(xiàn)有技術(shù)中為了維持短的測定時間、高的精度，而不得不在高壓條件下進(jìn)行測定，因此使用高耐壓性的裝置。
[0005]但是，這種高壓條件下的測定由于對流路的壓力負(fù)載大，因此有時由于來自流路的連接部的微小的漏液、脈動電流而引起色譜圖的變形，使測定精度下降。另外，高壓的條件與低壓條件下相比而言，由于在包含柱、過濾器類在內(nèi)的流路內(nèi)的非特異吸附的存在、使用多種洗脫液時的洗脫液的切換、環(huán)境溫度的變化等而產(chǎn)生的對壓力值的影響較大，因此有時使測定精度下降。這些現(xiàn)象有時即使在使用高耐壓性的裝置的情況下也會產(chǎn)生。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特開平5-005730號公報
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明所要解決的課題
[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種血紅蛋白類的測定方法，其能夠在短時間內(nèi)高精度地對血紅蛋白類進(jìn)行測定。另外，本發(fā)明的目的在于提供使用該血紅蛋白類的測定方法的血紅蛋白Alc的測定方法、血紅蛋白Alc與血紅蛋白F的同時測定方法、血紅蛋白Alc與血紅蛋白A2的同時測定方法、以及血紅蛋白Alc與異常血紅蛋白類的同時測定方法。
[0010]用于解決課題的手段
[0011]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在血紅蛋白類的測定方法中，在使用填充有具有特定結(jié)構(gòu)的柱填充劑的情況下，通過選擇顯示出在一定條件下所示的特定范圍的壓力值的柱，從而使測定的重現(xiàn)性提高。另外發(fā)現(xiàn)，該壓力值的范圍是與現(xiàn)有的血紅蛋白類的測定方法中所使用的柱的壓力值不同的范圍，且顯著低于現(xiàn)有的柱的壓力值。
[0012]本發(fā)明是一種借助液相色譜的血紅蛋白類的測定方法，其中，填充陽離子交換性粒子作為柱填充劑，所述陽離子交換性粒子包含在交聯(lián)聚合物粒子的表面含有陽離子交換基的聚合物，并且使用以l.0mL /分鐘輸送測定中所使用的洗脫液時的壓力值為9.8 X IO3Pa以上且29.4X IO5Pa以下的柱。
[0013]以下對本發(fā)明進(jìn)行詳述。
[0014]本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法中使用的柱填充劑是一種陽離子交換性粒子，所述陽離子交換性粒子包含在交聯(lián)聚合物粒子的表面含有陽離子交換基的聚合物。
[0015]交聯(lián)聚合物粒子優(yōu)選為將有機系的交聯(lián)性單體或者以有機系的交聯(lián)性單體為主要成分的單體類的混合物進(jìn)行聚合而得到的粒子。其中，更優(yōu)選為將交聯(lián)性丙烯酸系單體或者以交聯(lián)性丙烯酸系單體為主要成分的單體類的混合物進(jìn)行聚合而得到的粒子。另外，交聯(lián)聚合物粒子優(yōu)選為實質(zhì)上不具有離子交換性的粒子。
[0016]需要說明的是，在本說明書中，“丙烯酸系”是指具有丙烯?；蚣谆；那樾?。另外，在本說明書中，“(甲基)丙烯酸”是指“丙烯酸或甲基丙烯酸”，“(甲基)丙烯酸酯”是指“丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯”。
[0017]作為交聯(lián)性丙烯酸系單體，可以列舉例如:聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯類、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯類、烷撐二醇二(甲基)丙烯酸酯類、羥基烷基二(甲基)丙烯酸酯類、分子內(nèi)具有至少兩個(甲基)丙烯?；耐榇纪?甲基)丙烯酸酯類等。
[0018]作為聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯等。
[0019]作為聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等。
[0020]作為烷撐二醇二(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:聚四亞甲基二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚(丙二醇-四亞甲基二醇)_ 二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇聚丙二醇聚乙二醇-二(甲基)丙烯酸酯、1，3_ 丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4_ 丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，6_己二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，9_壬二醇二(甲基)丙烯酸酯、新戊二醇二(甲基)丙稀酸酷等。
[0021]作為羥基烷基二(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:2_羥基-1，3-二(甲基)丙烯酰氧基丙烷、2-羥基-1-(甲基)丙烯酰氧基-3-(甲基)丙烯酰氧基丙烷、2-羥基-3-(甲基)丙烯酰氧基丙基(甲基)丙烯酸酯、甘油二(甲基)丙烯酸酯、甘油丙烯酸酯甲基丙烯酸酯、氨基甲酸酯二(甲基)丙烯酸酯、異氰脲酸二(甲基)丙烯酸酯、異氰脲酸三(甲基)丙烯酸酯、1，10-二(甲基)丙烯酰氧基-4，7-二氧雜癸烷-2，9-二醇、1，10_ 二(甲基)丙稀酸氧基-5-甲基-4, 7- 二氧雜癸燒~2,9~ 二醇、1,11- 二(甲基)丙稀酸氧基_4，8- 二氧雜十一烷_2，6，10-三醇等。
[0022]作為分子內(nèi)具有至少兩個(甲基)丙烯酰基的烷醇烷(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、四羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二(三羥甲基丙烷)四(甲基)丙烯酸酯、四羥甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、四羥甲基甲烷四(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基乙烷三(甲基)丙烯酸酯等。
[0023]這些交聯(lián)性丙烯酸系單體可以單獨使用，也可以組合使用兩種以上。另外，這些交聯(lián)性丙烯酸系單體優(yōu)選為不具有離子交換基的結(jié)構(gòu)。
[0024] 作為構(gòu)成交聯(lián)聚合物粒子的單體，可以進(jìn)一步使用非交聯(lián)性單體。
[0025]非交聯(lián)性單體優(yōu)選為非交聯(lián)性丙烯酸系單體。
[0026]非交聯(lián)性丙烯酸系單體優(yōu)選為親水性的非交聯(lián)性丙烯酸系單體，可以列舉例如:(甲基)丙烯酸烷基酯類、具有羥基的非交聯(lián)性丙烯酸系單體等。
[0027]作為(甲基)丙烯酸烷基酯類，可以列舉例如:(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯等。
[0028]作為具有羥基的非交聯(lián)性丙烯酸系單體，可以列舉例如:聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯類、聚丙二醇單(甲基)丙烯酸酯類、烷撐二醇單(二甲基)丙烯酸酯類、其他具有羥基的(甲基)丙烯酸酯類等。
[0029]作為聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、甲氧基三(聚)乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯等。
[0030]作為聚丙二醇單(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:丙二醇單(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇單(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇單(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇單(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇單(甲基)丙烯酸酯等。
[0031]作為烷撐二醇單(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如--聚(乙二醇-丙二醇)單(甲基)丙烯酸酯、聚(乙二醇四亞甲基二醇)單(甲基)丙烯酸酯、聚(丙二醇四亞甲基二醇)單(甲基)丙烯酸酯、辛氧基聚乙二醇聚丙二醇一單(甲基)丙烯酸酯等。
[0032]作為其他具有羥基的(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:甘油單(甲基)丙烯酸酯、2-羥基乙基(甲基)丙烯酸酯、2-羥基丙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二羥基乙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二羥基丙基(甲基)丙烯酸酯等。
[0033]這些非交聯(lián)性丙烯酸系單體可以單獨使用，也可以組合使用兩種以上。另外，這些非交聯(lián)性丙烯酸系單體優(yōu)選為不具有離子交換基的結(jié)構(gòu)。
[0034]在使用非交聯(lián)性單體作為構(gòu)成交聯(lián)聚合物粒子的單體的情況下，交聯(lián)性單體與非交聯(lián)性單體的混合物中的非交聯(lián)性單體的含量的上限為30重量％。在非交聯(lián)性單體的含量超過30重量％的情況下，所得到的柱填充劑的耐壓性及耐溶脹性下降，有時無法準(zhǔn)確地進(jìn)行血紅蛋白類的測定。非交聯(lián)性單體的含量的更優(yōu)選的上限為20重量％、進(jìn)一步優(yōu)選的上限為10重量％。
[0035]作為將交聯(lián)性單體、或者交聯(lián)性單體與非交聯(lián)性單體的混合物(以下也將兩者合稱為“交聯(lián)性單體類”)進(jìn)行聚合的方法，可以列舉例如:在聚合引發(fā)劑的存在下的乳液聚合法、無阜聚合法(soap-free polymerization)、分散聚合法、懸浮聚合法、種子聚合法等公知的聚合法。其中，優(yōu)選分散聚合法、懸浮聚合法、種子聚合法。
[0036]例如在懸浮聚合法的情況下，將聚合引發(fā)劑溶解于交聯(lián)性單體類中并分散于適當(dāng)?shù)姆稚⒔橘|(zhì)中，然后根據(jù)需要在氮氣等不活潑氣體氣氛下邊攪拌邊加溫，由此可以得到作為柱填充劑的適當(dāng)?shù)慕宦?lián)聚合物粒子。
[0037]作為交聯(lián)性單體類的聚合中使用的聚合引發(fā)劑，可以使用水溶性或油溶性的公知的自由基聚合引發(fā)劑?？梢粤信e例如:過硫酸鉀、過硫酸鈉、過硫酸銨等過硫酸鹽，氫過氧化枯烯、過氧化苯甲酰、過氧化月桂酰、過氧化辛酰、鄰氯過氧化苯甲酰、過氧化乙酰、叔丁基過氧化氫、過氧化乙酸叔丁酯、過氧化異丁酸叔丁酯、雙(3，5，5_三甲基己酰)過氧化物、過氧化(2-乙基己酸)叔丁酯、二叔丁基過氧化物等有機過氧化物，2，2-偶氮二異丁腈、2，2-偶氮二(2，4-二甲基戊腈)、4，4-偶氮二(4-氰基戊酸)、2，2-偶氮二(2-甲基丁腈)、2,2-偶氮二(2，4- 二甲基戊腈)、偶氮二環(huán)己烷甲腈等偶氮化合物。
[0038]關(guān)于聚合引發(fā)劑的使用量，相對于交聯(lián)性單體類100重量份，優(yōu)選的下限為0.05重量份、優(yōu)選的上限為5重量份。在聚合引發(fā)劑的使用量小于0.05重量份的情況下，未反應(yīng)的單體殘留，有時對血紅蛋白類的測定造成不良影響。另外，如果為了使未反應(yīng)的單體聚合而進(jìn)行長時間的聚合，則有時在聚合過程中發(fā)生凝聚而無法得到粒子。在聚合引發(fā)劑的使用量超過5重量份的情況下，有時由于進(jìn)行劇烈的聚合反應(yīng)而產(chǎn)生凝聚物。
[0039]另外，在交聯(lián)性單體類的聚合時可以添加公知的添加劑等。作為這種添加劑，可以列舉例如:用于在交聯(lián)聚合物粒子中形成微孔的多孔化劑、用于控制聚合反應(yīng)的各種鏈轉(zhuǎn)移劑、用于使懸浮粒子穩(wěn)定化的分散劑等。
[0040]本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法中使用的柱填充劑是一種陽離子交換性粒子，所述陽離子交換性粒子包含在交聯(lián)聚合物粒子的表面含有陽離子交換基的聚合物。
[0041]作為陽離子交換基，可以列舉例如:羧基、磷酸基、磺酸基等。其中，優(yōu)選磺酸基。含有陽離子交換基的聚合物可以具有多種不同的陽離子交換基。
[0042]需要說明的是，對于本說明書中的“陽離子交換基”而言，與陽離子交換基相伴的結(jié)構(gòu)沒有限制，因此包括在末端具有陽離子交換基的全部官能團。例如本說明書中的“羧
基”包括羧基乙基、羧基丙基等。
[0043]對于含有陽離子交換基的聚合物，優(yōu)選為使含有陽離子交換基的單體進(jìn)行聚合而得到的聚合物、或者使含有能夠轉(zhuǎn)換為陽離子交換基的官能團的單體進(jìn)行聚合并且使該官能團轉(zhuǎn)換為陽離子交換基而得到的聚合物。其中，更優(yōu)選使含有陽離子交換基的單體進(jìn)行聚合而得到的聚合物。
[0044]含有陽離子交換基的單體(以下也稱為陽離子交換性單體)，為含有聚合反應(yīng)性的官能團及陽離子交換基的單體。
[0045]陽離子交換性單體優(yōu)選為含有陽離子交換基的丙烯酸系單體類。
[0046]作為含有羧基的丙烯酸系單體，可以列舉例如:(甲基)丙烯酸、2_(甲基)丙烯酰氧基乙基琥珀酸酯、2_(甲基)丙烯酰氧基乙基鄰苯二甲酸酯等(甲基)丙烯酸衍生物類。
[0047]作為含有磷酸基的丙烯酸系單體，可以列舉例如:((甲基)丙烯酰氧基乙基)酸性磷酸酯、(2-(甲基)丙烯酰氧基乙基)酸性磷酸酯、(3-(甲基)丙烯酰氧基丙基)酸性磷酸酯等(甲基)丙烯酸衍生物類等。
[0048]作為含 有磺酸基的丙烯酸系單體，可以列舉例如:2-(甲基)丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸、2-磺基乙基(甲基)丙烯酸酯、3-磺基丙基(甲基)丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸衍生物類等。
[0049]這些陽離子交換性單體可以單獨使用，也可以組合使用兩種以上。
[0050]另外，除這些陽離子交換性單體以外，也可以使用其他非交聯(lián)性的親水性單體。作為非交聯(lián)性的親水性單體，優(yōu)選上述具有羥基的非交聯(lián)性丙烯酸系單體?？梢粤信e例如--聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯類、聚丙二醇單(甲基)丙烯酸酯類、烷撐二醇單(甲基)丙烯酸酯類、其他具有羥基的(甲基)丙烯酸酯類等。
[0051]對于使這些陽離子交換性單體在交聯(lián)聚合物粒子的表面進(jìn)行聚合而得到的陽離子交換性粒子，優(yōu)選為在交聯(lián)聚合物粒子及聚合引發(fā)劑的存在下使陽離子交換性單體進(jìn)行聚合而得到的粒子。其中，更優(yōu)選為在在內(nèi)部含有聚合引發(fā)劑的交聯(lián)聚合物粒子的存在下使上述陽離子交換性單體進(jìn)行聚合而得到的粒子。
[0052]關(guān)于在內(nèi)部含有聚合引發(fā)劑的交聯(lián)聚合物粒子，優(yōu)選為將聚合引發(fā)劑溶解于能夠使交聯(lián)聚合物粒子溶脹并且能夠?qū)⒕酆弦l(fā)劑溶解的有機溶劑中、并使交聯(lián)聚合物粒子浸滲在該有機溶劑中而得到的粒子。
[0053]例如，作為使陽離子交換性單體在交聯(lián)聚合物粒子的表面進(jìn)行聚合而得到的陽離子交換性粒子，可以列舉:使交聯(lián)聚合物粒子的內(nèi)部含有聚合引發(fā)劑后，將交聯(lián)聚合物粒子分散到適當(dāng)?shù)姆稚⒔橘|(zhì)中，在該分散介質(zhì)中添加陽離子交換性單體并進(jìn)行聚合而得到的粒子等。[0054]關(guān)于陽離子交換性粒子，進(jìn)一步優(yōu)選為在制備交聯(lián)聚合物粒子時的聚合反應(yīng)中，在該聚合反應(yīng)結(jié)束前、即聚合引發(fā)劑完全被消耗前，向反應(yīng)體系中添加陽離子交換性單體來繼續(xù)聚合反應(yīng)而得到的粒子。該粒子是利用為了進(jìn)行交聯(lián)聚合物粒子的聚合反應(yīng)而在最初添加的聚合引發(fā)劑，使陽離子交換性單體在交聯(lián)聚合物粒子的表面高效地進(jìn)行聚合而得到的粒子。
[0055]另外，作為陽離子交換性粒子，還優(yōu)選為使含有能夠轉(zhuǎn)換為陽離子交換基的官能團的單體在交聯(lián)聚合物粒子的表面進(jìn)行聚合、進(jìn)而使該官能團轉(zhuǎn)換為陽離子交換基而得到的粒子。
[0056]能夠轉(zhuǎn)換為陽離子交換基的官能團(以下也稱為反應(yīng)性基團)優(yōu)選為非離子性的親水性基團。作為非離子性的親水性基團，可以列舉例如:羥基、二醇基、環(huán)氧基、縮水甘油基、伯胺基、仲氨基、氰基、醛基等。其中，優(yōu)選羥基、環(huán)氧基、縮水甘油基、伯胺基、仲氨基，更優(yōu)選羥基、環(huán)氧基、縮水甘油基。
[0057]對于含有這些反應(yīng)性基團的單體(以下也稱為反應(yīng)性單體)，優(yōu)選(甲基)丙烯酸酯類。
[0058]作為(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯類、聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯類、烷撐二醇單(甲基)丙烯酸酯類、環(huán)氧化或羥基化(甲基)丙烯酸酯類、氨基化(甲基)丙烯酸酯類、醛基化或氰基化(甲基)丙烯酸酯類等。
[0059]作為聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、甲氧基三(聚)乙二醇單(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇單(甲基)丙烯酸酯等。
[0060]作為聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:丙二醇單(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇單(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇單(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇單(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇單(甲基)丙烯酸酯等。
[0061]作為烷撐二醇單(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如--聚(乙二醇-丙二醇)單(甲基)丙烯酸酯、聚(乙二醇-四亞甲基二醇)單(甲基)丙烯酸酯、聚(丙二醇-四亞甲基二醇)單(甲基)丙烯酸酯、辛氧基聚乙二醇聚丙二醇-單(甲基)丙烯酸酯等。[0062]作為環(huán)氧化或羥基化(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:縮水甘油基(甲基)丙烯酸酯、丙三醇單(甲基)丙烯酸酯、2-羥基乙基(甲基)丙烯酸酯、2-羥基丙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二羥基乙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二羥基丙基(甲基)丙烯酸酯等。
[0063]作為氨基化(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:2_氨基乙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二氨基乙基(甲基)丙烯酸酯、2-氨基丙基(甲基)丙烯酸酯、2，3-二氨基丙基(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺等。
[0064]作為醛基化或氰基化(甲基)丙烯酸酯類，可以列舉例如:(甲基)丙烯醛、氰基(甲基)丙烯酸酯、乙基-2-丙烯酸酯等。
[0065]這些反應(yīng)性單體可以單獨使用，也可以組合使用兩種以上。
[0066]作為使這些反應(yīng)性單體在交聯(lián)聚合物粒子的表面進(jìn)行聚合而得到的粒子，優(yōu)選代替上述陽離子交換性單體而使反應(yīng)性單體進(jìn)行聚合而得到的粒子。該粒子是在交聯(lián)聚合物粒子及聚合引發(fā)劑的存在下使反應(yīng)性單體進(jìn)行聚合而得到的粒子。其中，更優(yōu)選為在內(nèi)部含有聚合弓I發(fā)劑的交聯(lián)聚合物粒子的存在下使反應(yīng)性單體進(jìn)行聚合而得到的粒子。
[0067]作為將使反應(yīng)性單體在交聯(lián)聚合物粒子的表面進(jìn)行聚合而得到的粒子的反應(yīng)性基團轉(zhuǎn)換為陽離子交換基而得到的粒子，優(yōu)選為使具有陽離子交換基的化合物(以下也稱為陽離子交換性化合物)與反應(yīng)性基團進(jìn)行反應(yīng)而得到的粒子。
[0068]作為使反應(yīng)性基團與陽離子性化合物進(jìn)行反應(yīng)而得到的粒子，可以列舉:使用公知的化學(xué)反應(yīng)使反應(yīng)性基團與陽離子交換性化合物進(jìn)行反應(yīng)而得到的粒子。可以列舉例如:使在表面具有作為反應(yīng)性基團的羥基的交聯(lián)聚合物粒子、與作為陽離子交換性化合物的溴乙烷磺酸鈉等鹵代乙烷磺酸類、氯乙酸鈉等鹵代乙酸類在氫氧化堿水溶液中進(jìn)行反應(yīng)而得到的、在交聯(lián)聚合物粒子的表面具有磺酸基或羧基的陽離子交換性粒子。
[0069]另外可以列舉:使在表面具有作為反應(yīng)性基團的羥基的交聯(lián)聚合物粒子、與作為陽離子交換性化合物的具有陽離子交換基的醛基化合物在酸催化劑下進(jìn)行縮醛化反應(yīng)而得到的、在交聯(lián)聚合物粒子的表面具有陽離子交換基的陽離子交換性粒子。
[0070]另外可以列舉:使在表面具有作為反應(yīng)性基團的羥基的交聯(lián)聚合物粒子、與作為陽離子交換性化合物的丙三羧酸、丁烷四甲酸等多官能羧酸化合物進(jìn)行基于脫水反應(yīng)的酯化而得到的、在交聯(lián)聚合物粒子的表面具有羧基的陽離子交換性粒子。
[0071]另外可以列舉:使在表面具有作為反應(yīng)性基團的羥基的交聯(lián)聚合物粒子、與作為陽離子交換性化合物的1，3_丙磺酸內(nèi)酯、1，4- 丁磺酸內(nèi)酯等在氫氧化堿的水溶液中或有機溶劑溶液中進(jìn)行反應(yīng)而得到的、在交聯(lián)聚合物粒子的表面具有磺酸基的陽離子交換性粒子。
[0072]作為使反應(yīng)性基團與陽離子性化合物進(jìn)行反應(yīng)而得到的粒子，可以列舉以下的1)、2)、3)等粒子。I)使在表面具有作為反應(yīng)性基團的環(huán)氧基或縮水甘油基的交聯(lián)聚合物粒子、與作為陽離子交換性化合物的硫酸鈉、?；撬?、乙醇酸等進(jìn)行反應(yīng)而得到的、在交聯(lián)聚合物粒子的表面具有磺酸基或羧基的陽離子交換性粒子。2)對在表面具有作為反應(yīng)性基團的環(huán)氧基或縮水甘油基的交聯(lián)聚合物粒子、與醚合三氟化硼及作為陽離子交換性化合物的亞硫酸鈉進(jìn)行加熱處理而得到的、在交聯(lián)聚合物粒子的表面具有磺酸基的陽離子交換性粒子。3)使在表面具有作為反應(yīng)性基團的氨基的交聯(lián)聚合物粒子、與表氯醇、三縮水甘油醚等環(huán)氧化合物在氫氧化堿的水溶液中或有機溶劑溶液中進(jìn)行反應(yīng)而發(fā)生環(huán)氧化后進(jìn)行與上述的環(huán)氧基或縮水甘油基的情況相同的處理而得到的、在交聯(lián)聚合物粒子的表面具有陽離子交換基的陽離子交換性粒子。
[0073]陽離子交換性粒子的體積平均粒徑的優(yōu)選的下限為5 Pm、優(yōu)選的上限為30 Pm。在陽離子交換性粒子的體積平均粒徑小于5 u m的情況下，輸送洗脫液時的壓力值增大，難以得到本發(fā)明中規(guī)定的壓力范圍內(nèi)的柱。在體積平均粒徑超過30 iim的情況下，柱內(nèi)的孔隙率增大，測定試樣等擴散，峰變得易于鈍化，因此有時測定精度下降。陽離子交換性粒子的體積平均粒徑的更優(yōu)選的下限為6 u m、更優(yōu)選的上限為25 u m。
[0074]對于填充了陽離子交換性粒子的柱，具有陽離子交換性粒子的體積平均粒徑越小則柱的壓力值越大，陽離子交換性粒子的體積平均粒徑越大則柱的壓力值越小的傾向。因此，在要使柱的壓力值下降的情況下，則使陽離子交換性粒子的體積平均粒徑增大，在要使柱的壓力值上升的情況下，則使陽離子交換性粒子的體積平均粒徑減小，由此能夠進(jìn)行微調(diào)整。
[0075]本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法中使用的柱是填充了上述陽離子交換性粒子的柱，以l.0mL /分鐘輸送測定中所使用的洗脫液時的壓力值為9.SXlO3Pa以上且29.4X IO5Pa 以下。
[0076]以下，將以l.0mL /分鐘輸送測定中所使用的洗脫液時的柱的壓力值稱為“柱壓力值”，將9.8X IO3Pa以上且29.4X IO5Pa以下的壓力范圍稱為“柱的壓力規(guī)定值”。另外，在本說明書中所說的壓力值是在輸送泵與柱之間設(shè)置壓力計且以上述流速輸送測定中所使用的洗脫液時壓力計所示的值。
[0077]在使用柱壓力值小于9.8X IO3Pa的柱情況下，測定體系中產(chǎn)生的壓力值難以變得穩(wěn)定，因此測定精度下降。另外，有時測定時間延長。在使用柱壓力值超過29.4X IO5Pa的柱情況下，成為在高壓下的測定，因此測定精度下降。對于本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法中使用的柱，優(yōu)選其柱壓力值為4.9 X IO4Pa以上且24.5 X IO5Pa以下的柱。
[0078]在本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法中，作為填充上述陽離子交換性粒子作為柱填充劑的空柱，可以使用金屬制、樹脂制、玻璃制等的公知的原材料的空柱。另外，可以使用由收納柱填充劑的柱主體、和含有玻璃料(frit)的終端部件構(gòu)成的公知的結(jié)構(gòu)的空柱。
[0079]本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法中使用的柱主體的長度的優(yōu)選的下限為3mm、優(yōu)選的上限為70mm。在柱主體的長度小于3mm的情況下，填充劑與血紅蛋白類的相互作用變得不充分，因此有時分離性能變差，測定精度下降。在柱主體的長度超過70mm的情況下，測定時間延長，另外，變得難以將柱壓力值設(shè)定為柱的壓力規(guī)定值。柱主體的長度的更優(yōu)選的下限為5mm、更優(yōu)選的上限為50mm。
[0080]存在柱主體的長度越短則柱的壓力值越小，柱主體的長度越長則柱的壓力值越大的傾向。因此，在要使柱的壓力值下降的情況下，則縮短柱主體的長度，在要使柱的壓力值上升的情況下，則延長柱主體的長度，由此能夠進(jìn)行微調(diào)整。
[0081]本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法中使用的柱主體的內(nèi)徑的優(yōu)選的下限為1mm、優(yōu)選的上限為10mm。在柱主體的內(nèi)徑小于Imm的情況下，變得難以將柱壓力值設(shè)定為柱的壓力規(guī)定值，有時測定精度下降。在柱的內(nèi)徑超過IOmm的情況下，有時試樣在柱內(nèi)擴散，因而測定精度下降。另外，測定時間延長。柱主體的更優(yōu)選內(nèi)徑的下限為2mm、更優(yōu)選的上限為4mm o[0082]存在柱主體的內(nèi)徑越小則柱的壓力值越大，柱主體的內(nèi)徑越大則柱的壓力值越小的傾向。因此，在要使柱的壓力值下降的情況下，則使柱主體的內(nèi)徑增大，在要使柱的壓力值上升的情況下，則使柱主體的內(nèi)徑減小，由此能夠進(jìn)行微調(diào)整。
[0083]本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法可以使用連接有上述柱的公知的液相色譜來進(jìn)行。例如是具備用于導(dǎo)入測定試樣的導(dǎo)入裝置、用于輸送洗脫液的泵、用于檢測血紅蛋白類的檢測器等的液相色譜。本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法中的液相色譜的構(gòu)成的一例如圖1所示。
[0084]對于本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法所使用的洗脫液，優(yōu)選使用含有公知的氯化合物的緩沖液類、有機溶劑類，更優(yōu)選使用緩沖液類。
[0085]作為緩沖液類，可以列舉例如:有機酸、無機酸及它們的鹽類、氨基酸類、Good緩沖液(Good, s buffer)等。
[0086]作為有機酸，可以列舉例如:檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、蘋果酸等。
[0087]作為無機酸，可以列舉例如:鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、乙酸等。
[0088]作為氨基酸類，可以列舉例如:甘氨酸、牛磺酸、精氨酸等。
[0089]另外，這些緩沖液類中可以適當(dāng)添加通常添加的公知的成分，例如:表面活性劑、聚合物類、親水性的低分子化合物、離液序列高的離子(chaotropic ions)類等。
[0090]進(jìn)行血紅蛋白類的測定時的緩沖液類的鹽濃度的優(yōu)選的下限為IOmmol / L、優(yōu)選的上限為IOOOmmol / L。在緩沖液類的鹽濃度小于IOmmol / L的情況下，離子交換反應(yīng)無法充分進(jìn)行，因此有時無法將血紅蛋白類分離。如果緩沖液類的鹽濃度超過lOOOmmol /L，則有時鹽類析出，對系統(tǒng)造成不良影響。
[0091]在進(jìn)行血紅蛋白類的測定時，優(yōu)選將測定體系中產(chǎn)生的壓力值設(shè)定為9.8X IO3Pa以上且19.6X IO5Pa以下。以下，也將測定時的測定體系中產(chǎn)生的壓力值稱為“測定時的壓力值”，將9.8X IO3Pa以上且19.6X IO5Pa以下的壓力范圍稱為“測定時的壓力規(guī)定值”。因此，在以流速1.0mL /分鐘的流速進(jìn)行測定的情況下，柱壓力值與測定時的壓力值一致。
[0092]在測定時的壓力值小于9.SXlO3Pa的情況下，測定時的壓力值難以變得穩(wěn)定，測定精度下降。另外，有時測定時間延長。在測定時的壓力值超過19.6X IO5Pa的情況下,成為在高壓下的測定，因此測定精度下降。
[0093]測定時的壓力值能夠通過使洗脫液的輸送速度等進(jìn)行增減等來進(jìn)行調(diào)整。
[0094]根據(jù)本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法，可以對各種血紅蛋白類進(jìn)行測定。例如可以對正常人所具有的血紅蛋白A0、血紅蛋白Ale、血紅蛋白F(胎兒性血紅蛋白)、血紅蛋白A2進(jìn)行測定。另外，可以對通常被稱為異常血紅蛋白的血紅蛋白類的一部分進(jìn)行測定。作為異常血紅蛋白類，可以列舉例如:血紅蛋白S、血紅蛋白C、血紅蛋白D、血紅蛋白E等。
[0095]需要說明的是，在本說明書中，“可以對上述血紅蛋白類進(jìn)行測定”是指:與公知的血紅蛋白類的測定方法同樣地，可以以百分率表示相對于在色譜圖中出現(xiàn)的全部峰面積的合計或一部分峰面積的合計而言的各血紅蛋白的峰面積，從而示出其含有率的情形。
[0096]根據(jù)本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法，可以對作為糖尿病的指標(biāo)的血紅蛋白Alc進(jìn)行測定。使用本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法的、借助液相色譜的血紅蛋白Alc的測定方法也是本發(fā)明之一。
[0097]根據(jù)本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法，也可以同時對血紅蛋白Alc和其他血紅蛋白類進(jìn)行測定。在此所稱的“同時”是指:能夠在一次測定中將血紅蛋白Alc和其他血紅蛋白類的峰表現(xiàn)在色譜圖上，從而示出測定對象的各血紅蛋白類的含有率的情形。
[0098]例如，通過將血紅蛋白F在血紅蛋白Alc之前洗脫出來，可以同時對血紅蛋白F和血紅蛋白Alc進(jìn)行測定。使用本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法的、借助液相色譜的血紅蛋白Alc與血紅蛋白F的同時測定方法也是本發(fā)明之一。
[0099]另外，通過將血紅蛋白A2在血紅蛋白Alc之后洗脫出來，可以同時對血紅蛋白Alc和血紅蛋白A2進(jìn)行測定。使用本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法的、借助液相色譜的血紅蛋白Alc與血紅蛋白A2的同時測定方法也是本發(fā)明之一。
[0100]另外，通過將異常血紅蛋白類在血紅蛋白Alc的前后洗脫出來，可以同時對血紅蛋白Alc與異常血紅蛋白類進(jìn)行測定。使用本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法的、借助液相色譜的血紅蛋白Alc與異常血紅蛋白類的同時測定方法也是本發(fā)明之一。
[0101]發(fā)明效果
[0102]本發(fā)明是一種借助液相色譜的血紅蛋白類的測定方法，其中，填充陽離子交換性粒子作為柱填充劑，所述陽離子交換性粒子包含在交聯(lián)聚合物粒子的表面含有陽離子交換基的聚合物，并且使用以l.0mL /分鐘輸送測定中所使用的洗脫液時的壓力值為
9.8 X IO3Pa以上且29.4X IO5Pa以下的柱。通過使用符合上述條件的柱，可以解決在現(xiàn)有的高壓條件下的測定的缺點，進(jìn)而可以在短時間內(nèi)以高精度對血紅蛋白類進(jìn)行測定。另外，可以同時對血紅蛋白Alc與其他血紅蛋白類進(jìn)行測定。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0103]圖1是本發(fā)明的血紅蛋白類的測定方法中的液相色譜的構(gòu)成的一例。
[0104]圖2是使用實施例1的柱及測定條件進(jìn)行正常人血液的血紅蛋白Alc的測定時得到的色譜圖。
[0105]圖3是使用實施例1的柱及測定條件進(jìn)行異常血紅蛋白類的測定時得到的色譜圖。
[0106]圖4是使用實施例1的柱及測定條件進(jìn)行血紅蛋白A2的測定時得到的色譜圖。
[0107]圖5是使用比較例I的柱及測定條件進(jìn)行正常人血液的血紅蛋白Alc的測定時得到的色譜圖。
[0108]圖6是使用比較例2的柱及測定條件進(jìn)行異常血紅蛋白類的測定時得到的色譜圖。
[0109]圖7是使用比較例2的柱及測定條件進(jìn)行血紅蛋白A2的測定時得到的色譜圖。
[0110]圖8是示出使用實施例1及比較例4的柱的情況下的、測定時的壓力值與同時重現(xiàn)性試驗中的CV值的關(guān)系的圖表。
[0111]圖9是示出使用實施例1及比較例2的柱的情況下的、測定時的壓力值與同時重現(xiàn)性試驗中的CV值的關(guān)系的圖表。
[0112]圖10是示出使用實施例1及比較例3的柱的情況下的、測定時的壓力值與同時重現(xiàn)性試驗中的CV值的關(guān)系的圖表。
[0113]圖11是示出使用測定例I?7重復(fù)測定正常人血液的情況下的血紅蛋白Alc值的推移的圖表。[0114]圖12是示出使用測定例I~7重復(fù)測定正常人血液的情況下的同時重現(xiàn)性試驗時的CV值的推移的圖表。
【具體實施方式】
[0115]以下示出實施例對本發(fā)明進(jìn)一步地詳細(xì)地進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不僅限定于這些實施例。
[0116]在實施例1~4中，制備包含在交聯(lián)聚合物粒子的表面含有陽離子交換基的聚合物的柱填充劑，制備符合本發(fā)明的“柱的壓力規(guī)定值”的柱。另外，示出使用該柱填充劑在符合本發(fā)明的“測定時的壓力規(guī)定值”的條件下進(jìn)行測定的例子。
[0117](實施例1)
[0118]在四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)工業(yè)公司制)200g、二乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學(xué)工業(yè)公司制)50g、及四羥甲基甲烷三丙烯酸酯(新中村化學(xué)工業(yè)公司制)100g中溶解過氧化苯甲酰(NACALAI TESQUE, INC.制)1.0g。使所得到的混合物分散于5重量％的聚乙烯醇(日本合成化學(xué)工業(yè)公司制、“Gohsenol GH-20”)水溶液2L中，一邊使用旋轉(zhuǎn)槳在轉(zhuǎn)速300rpm下進(jìn)行攪拌，一邊在氮氣氛下加熱至80°C而進(jìn)行I小時聚合反應(yīng)。I小時后，在反應(yīng)體系中添`加溶解有丙烯酰胺-叔丁基磺酸(東亞合成公司制)80g的水溶液200mL，進(jìn)一步在80°C下進(jìn)行I小時聚合反應(yīng)，得到包含在交聯(lián)聚合物粒子的表面含有陽離子交換基的聚合物的陽離子交換性粒子(柱填充劑)。
[0119]將所得到的柱填充劑進(jìn)行洗滌后，利用粒度分布測定裝置(Nicomp公司制、“AccuSizer780” )來測定粒徑，結(jié)果，體積平均粒徑為9.3 y m。
[0120]將柱填充劑0.8g添加到50mmol / L磷酸緩沖液(pH6.0) 30mL中，攪拌后，進(jìn)行5分鐘超聲波處理，制備漿料。將全部漿料注入到連接有不銹鋼制空柱(柱主體的內(nèi)徑
4.6mm、長度35mm)類的柱填充用儲料器(容量30mL、AS ONE Corporation制)中。將柱填充用儲料器與輸送泵(Science公司制、“TO-614GL”)連接，在20MPa的壓力下進(jìn)行填充，得到血紅蛋白類測定用的柱。
[0121]將所得到的血紅蛋白類測定用的柱(分離用柱7)與圖1所示的構(gòu)成的液相色譜I連接。在輸送泵3與注射閥5之間連接壓力計4(NAGANO KEIKI C0.,LTD.制、“數(shù)字壓力計GC61”)來測定壓力值。測定條件如下所示。以流速l.0mL /分鐘輸送洗脫液A時的柱壓力值為1300X 103Pa。
[0122]測定條件
[0123]?系統(tǒng):LC_20A系統(tǒng)(島津制作所公司制)
[0124]?洗脫液:洗脫液A:200mmol / L磷酸緩沖液(pH5.8)
[0125]洗脫液B:400mmol / L磷酸緩沖液(pH7.8)
[0126]?洗脫條件:0.0分鐘~1.0分鐘:洗脫液A100 %
[0127]1.0分鐘~1.1分鐘:洗脫液B100 %
[0128]1.1分鐘~2.0分鐘:洗脫液A100 %
[0129]?流速:1.0mL/分鐘
[0130]?檢測波長:415nm
[0131]?試樣注入量:10 u L[0132]使用上述的柱及測定條件，進(jìn)行正常人血液中的血紅蛋白Alc的測定。
[0133]測定試樣使用的是:利用含有0.05%的TritonX-100 (Sigma-Aldrich公司制)的磷酸緩沖液(PH6.8)將氟化鈉采血而得的人體的正常人血液加以溶血稀釋至200倍而得的試樣。
[0134]在上述測定條件下進(jìn)行測定，結(jié)果，所得到的色譜圖如圖2所示。圖2中，峰21表示血紅蛋白Ale、峰22表示血紅蛋白A0、峰23表示血紅蛋白F。血紅蛋白Alc與其他血紅蛋白類可以在短時間內(nèi)良好地進(jìn)行分離。另外，連續(xù)進(jìn)行20次使用相同試樣的測定，從而進(jìn)行同時重現(xiàn)性試驗。如表I所示，血紅蛋白Alc值(HbAlc)與血紅蛋白F值(HbF)的重現(xiàn)性良好。
[0135][表 I]
【權(quán)利要求】
1.一種借助液相色譜的血紅蛋白類的測定方法，其中， 填充陽離子交換性粒子作為柱填充劑，所述陽離子交換性粒子包含在交聯(lián)聚合物粒子的表面含有陽離子交換基的聚合物，并且 使用以1.0mL /分鐘輸送測定中所使用的洗脫液時的壓力值為9.8X IO3Pa以上且29.4X IO5Pa以下的柱。
2.如權(quán)利要求1所述的血紅蛋白類的測定方法，其中， 含有陽離子交換基的聚合物是使含有陽離子交換基的單體在交聯(lián)聚合物粒子的表面進(jìn)行聚合而得到的。
3.如權(quán)利要求1所述的血紅蛋白類的測定方法，其中， 含有陽離子交換基的聚合物是使含有能夠轉(zhuǎn)換為陽離子交換基的官能團的單體在交聯(lián)聚合物粒子的表面進(jìn)行聚合而得到的。
4.如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的血紅蛋白類的測定方法，其中，將測定體系中產(chǎn)生的壓力值設(shè)定為9.8X IO3Pa以上且19.6X IO5Pa以下。
5.一種借助液相色譜的血紅蛋白Alc的測定方法，其使用權(quán)利要求1、2、3或4中任一項所述的血紅蛋白類的測定方法。
6.一種借助液相色譜的血紅蛋白Alc與血紅蛋白F的同時測定方法，其使用權(quán)利要求1、2、3或4中任一項所述的血紅蛋白類的測定方法。
7.一種借助液相色譜的血紅蛋白Alc與血紅蛋白A2的同時測定方法，其使用權(quán)利要求1、2、3或4中任一項所述的血紅蛋白類的測定方法。
8.一種借助液相色譜的血紅蛋白Alc與異常血紅蛋白類的同時測定方法，其使用權(quán)利要求1、2、3或4中任一項所述的血紅蛋白類的測定方法。
【文檔編號】G01N30/88GK103649745SQ201280033002
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月8日
【發(fā)明者】大石和之 申請人:積水醫(yī)療株式會社