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一種測定血紅蛋白α與β珠蛋白鏈比率的方法及應(yīng)用

文檔序號:9470215閱讀:1426來源:國知局
一種測定血紅蛋白α與β珠蛋白鏈比率的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)檢測領(lǐng)域,具體涉及一種測定血紅蛋白Ct與珠蛋白鏈比 率的方法及其在檢測P地中海貧血中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]血紅蛋白(Hemoglobin,Hb)由一個珠蛋白和四個血紅素(又稱亞鐵原P卜啉)組 成,每個血紅素又由四個吡咯類亞基組成一個環(huán),環(huán)中心為一個亞鐵離子。每個珠蛋白則有 四條多肽鏈組成,珠蛋白的四條肽鏈各不相同。成年人可由2條a鏈和2條P鏈構(gòu)成,稱 HbA,胎兒由2條a鏈和2條y鏈構(gòu)成,稱HbF,出生后不久由HbA取代。珠蛋白的每條多 肽鏈與一個血紅素連接,構(gòu)成血紅蛋白的一個單體,或者說亞單位(即亞基)。
[0003]地中海貧血,又稱珠蛋白生成障礙性貧血,是我國兒童的常見疾病,約占所有貧血 的30-40%,廣泛分布于世界多個地區(qū),在我國,尤其以重慶、四川、廣東、廣西等省市多見, 是非常值得關(guān)注的重要社會問題。本病是由于遺傳缺陷導(dǎo)致血紅蛋白a珠蛋白鏈合成 缺失或不足,a、P珠蛋白鏈比例失衡,進(jìn)而造成紅細(xì)胞壽命縮短或功能異常的一種先天性 貧血。地中海貧血根據(jù)異常表達(dá)的珠蛋白鏈的不同,主要分為a地中海貧血和0地中海 貧血兩大類。目前作為發(fā)病后的診斷,一般通過血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)為低色素性小細(xì)胞貧血且 排除缺鐵性貧血時,結(jié)合血紅蛋白電泳與基因診斷技術(shù)對疑似珠蛋白生成障礙性貧血的病 人進(jìn)行確診,試驗操作復(fù)雜,費用昂貴,且不利于篩查普及。目前,對地中海貧血尚缺乏快速 且高通量的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]地中海貧血是由于遺傳缺陷導(dǎo)致血紅蛋白a、0珠蛋白鏈合成缺失或不足,a、 0珠蛋白鏈比例失衡,進(jìn)而造成紅細(xì)胞壽命縮短或功能異常的一種先天性貧血。本申請的 發(fā)明人認(rèn)為,既然地中海貧血是由a、0珠蛋白鏈比例失衡造成,那我們是否可以根據(jù)定 量分析血紅蛋白中a、0珠蛋白鏈的比率來實現(xiàn)早期識別不同類型0地中海貧血呢?如 何定量分析血紅蛋白中a、0珠蛋白鏈的比率?進(jìn)一步又如何實現(xiàn)高通量檢測呢?本申 請的發(fā)明人正是在解決上述問題的過程中從而實現(xiàn)了本發(fā)明。
[0005]有鑒于此,本發(fā)明的目的在于提供一種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與P珠蛋白 鏈比率的方法,由于采用血紅蛋白的裂解片段作為標(biāo)志肽段進(jìn)行測試,故不要求血紅蛋白 的構(gòu)象完整,能測定微量且經(jīng)較長時間保存的血液標(biāo)本的血紅蛋白濃度,且該方法操作簡 單,所需試劑成本低。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0007] -種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與0珠蛋白鏈比率的方法,包括如下進(jìn)行的步 驟:
[0008] (1)取血紅蛋白樣品進(jìn)行裂解,得珠蛋白多肽鏈的裂解片段;所述珠蛋白多肽鏈 的裂解片段包括a珠蛋白鏈的裂解片段和珠蛋白鏈的裂解片段;
[0009] (2)以a珠蛋白鏈裂解片段中的任一條裂解片段作為a珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段,以 0珠蛋白鏈裂解片段中的任一條裂解片段作為0珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段,利用質(zhì)譜測定a 珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段的濃度和0珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段的濃度,a珠蛋白鏈與0珠蛋白鏈 的比率即由a珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段濃度與0珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段的濃度比表示;所述a 珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段的濃度由a珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段質(zhì)譜儀響應(yīng)強(qiáng)度的峰面積積分來表 示,所述0珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段的濃度由0珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段質(zhì)譜儀響應(yīng)強(qiáng)度的峰面 積積分來表示。
[0010] 所述步驟(1)中,對血紅蛋白樣品進(jìn)行裂解可采用酶選擇性的進(jìn)行切割裂解,如 胰蛋白酶能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷,特異性的獲得賴氨酸或精氨 酸結(jié)尾的肽鏈片段。對裂解片段的分離,可采用色譜分離技術(shù)進(jìn)行,如液相色譜、薄層色譜 等,或者采用電泳技術(shù)進(jìn)行分離。分離后,選取珠蛋白多肽鏈裂解后產(chǎn)生的任一條或多條特 征性多肽片段可作為標(biāo)志肽段。
[0011] 進(jìn)一步,所述的一種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與珠蛋白鏈比率的方法,所 述步驟(1)中,血紅蛋白樣品優(yōu)選的采用胰蛋白酶進(jìn)行裂解,a珠蛋白鏈的裂解片段有14 條,其序列如SEQIDN0:l-14所示;0珠蛋白鏈的裂解片段有15條,其序列如SEQIDNO: 15-29所示。
[0012] 進(jìn)一步,所述的一種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與0珠蛋白鏈比率的方法,所述 步驟(2)中,以a珠蛋白鏈裂解片段中質(zhì)譜檢測時響應(yīng)值高的裂解片段作為a珠蛋白鏈 的標(biāo)志肽段,以P珠蛋白鏈裂解片段中質(zhì)譜檢測時響應(yīng)值高的裂解片段作為P珠蛋白鏈 的標(biāo)志肽段。
[0013] 進(jìn)一步,所述的一種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與0珠蛋白鏈比率的方法,a珠 蛋白鏈的標(biāo)志肽段的序列如SEQIDNO:1所示,P珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段的序列如SEQID NO: 15所示。
[0014] 進(jìn)一步,所述的一種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與珠蛋白鏈比率的方法,所述 質(zhì)譜測定采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定,具體是通過液相色譜流動進(jìn)樣方式快速進(jìn)樣, 再通過串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行快速定量檢測,實現(xiàn)高通量檢測。
[0015] 進(jìn)一步,所述的一種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與P珠蛋白鏈比率的方法,通過 質(zhì)譜儀MRM模式快速定量檢測時,a珠蛋白鏈與P珠蛋白鏈的每個特征肽段都由其穩(wěn)定 同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正和定量,消除系統(tǒng)誤差及基質(zhì)效應(yīng)。
[0016] 進(jìn)一步,所述的一種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與0珠蛋白鏈比率的方法,在通 過質(zhì)譜儀MRM模式快速定量檢測時,a珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段的不同的碎片離子對組合及0 珠蛋白鏈的標(biāo)志肽段不同的碎片離子對組合(母離子/子離子組合)均可用于檢測。
[0017] 進(jìn)一步,由于本發(fā)明方法的實施不依賴血紅蛋白的完整構(gòu)象,故對采集的樣本保 存要求不高,可直接取全血標(biāo)本進(jìn)行分析,也可將血液制成干血濾紙片標(biāo)本作為血紅蛋白 樣本的保存形式,便于長期保存和遠(yuǎn)距離運輸,且成本低。
[0018] 本發(fā)明還提供了基于所述的一種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與0珠蛋白鏈比率 的方法在檢測P地中海貧血中的應(yīng)用。
[0019] 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0020] 測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與0珠蛋白鏈比率的方法在檢測0地中海貧血中 的應(yīng)用,所述的應(yīng)用具體為:根據(jù)所述的一種測定血紅蛋白的a珠蛋白鏈與珠蛋白鏈比 率的方法分別測定已知的正常人、已知的不同類型P地中海貧血者及未知樣品的a珠蛋 白鏈與0珠蛋白鏈比率a/0參考值,根據(jù)a/0參考值進(jìn)行判斷。
[0021]本發(fā)明通過定量分析a、0珠蛋白鏈比率,可早期識別不同類型0地中海貧血, 能夠?qū)χ囟取⒅卸燃拜p度P地中海貧血進(jìn)行識別。本發(fā)明篩查出的患者,至少可以從以下 幾個方面受益:對于將發(fā)展為重型P地中海貧血的患兒,及早預(yù)防并發(fā)癥和輸血治療可能 帶來的感染,可以改善患兒的生存環(huán)境;對于輕型0地中海貧血的患兒,指導(dǎo)其避免長時 間接觸低壓、缺氧的環(huán)境,可避免貧血癥狀的出現(xiàn);孕前、產(chǎn)前親代P地中海貧血的檢出, 有助于遺傳咨詢及生育決策,減少或避免重型0地中海貧血患兒的出生,達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的 目的。本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的社會效益。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種檢測P地中海貧血的試劑盒,該試劑盒能夠方便快捷的實 現(xiàn)血紅蛋白的提取、變性及裂解,利于商業(yè)化應(yīng)用。
[0023] 為實現(xiàn)上
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