專利名稱：含有血紅蛋白的試樣中的底物的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用酶反應(yīng)測(cè)定試樣中的底物的方法，特別涉及可減弱試樣中共存的血紅蛋白對(duì)測(cè)定體系的干擾、以高精度測(cè)定試樣中的底物的方法及其測(cè)定用試劑。
背景技術(shù)：
隨著對(duì)存在于血液、尿等生物體試樣中的特定成分的量和疾病的關(guān)系的明確，在進(jìn)行疾病的診斷、病癥的確定、治療效果的判斷等時(shí)必須對(duì)該特定成分進(jìn)行測(cè)定。目前，作為生物體試樣(例如血清)中的特定成分的測(cè)定方法，一般有采用與作為目的物的特定成分或來自該特定成分的成分(以下總稱為“底物”)進(jìn)行特異性反應(yīng)的酶進(jìn)行酶反應(yīng)，通過對(duì)生成物的測(cè)定進(jìn)行定量的酶法。該酶法中，廣泛普及的是使氧化酶這樣的過氧化氫生成酶(以下有時(shí)稱為“氧化酶”)與底物作用，用過氧化物酶及被氧化性顯色試劑將生成的過氧化氫導(dǎo)入顯色系中，對(duì)該顯色進(jìn)行比色定量的方法。
作為前述利用氧化酶的底物的測(cè)定方法中的底物，例如可例舉葡萄糖、膽固醇、中性脂肪、磷脂、游離脂肪酸、尿酸、肌酸內(nèi)酰胺、唾液酸、多胺、糖化血紅蛋白等，它們?cè)谂R床檢查的領(lǐng)域可被實(shí)際測(cè)定。
但是，由于該測(cè)定方法是以氧化酶的氧化反應(yīng)為基礎(chǔ)原理而確立的，所以存在易受到試樣中共存的抗壞血酸、膽紅素、血紅蛋白等生物體內(nèi)還原物質(zhì)的干擾，測(cè)定值出現(xiàn)負(fù)誤差的問題。此外，已知膽紅素或血紅蛋白本身在可見光區(qū)域具有吸收，所以會(huì)與比色定量時(shí)的測(cè)定波長(zhǎng)重疊，導(dǎo)致誤差，或者膽紅素和血紅蛋白本身的吸光會(huì)因來自外部的光或測(cè)定試劑中的成分而發(fā)生經(jīng)時(shí)地變化，對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。除此以外，已知還易受到脂質(zhì)等造成的混濁的干擾。
上述物質(zhì)中，血紅蛋白混入生物體試樣(血清、血漿、尿、唾液、脊髓液等)中的量通常是極微量的，但伴隨溶血的疾病等情況除外，因采血等測(cè)定用試樣的采集條件、血液試樣的調(diào)制、保存條件的不同有時(shí)血紅蛋白會(huì)再次地漏到試樣中。此外，以全血、血細(xì)胞或?qū)λ鼈冞M(jìn)行處理而獲得的溶血液為試樣的情況下，自然而然地會(huì)混入血紅蛋白。因此，利用氧化酶測(cè)定底物的方法中，減弱血紅蛋白的干擾成為了重要的課題。
作為減弱使用氧化酶對(duì)試樣中的底物進(jìn)行定量時(shí)的血紅蛋白的干擾的方法，已知的有在回避了血紅蛋白本身的吸收波長(zhǎng)的特定波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定的方法(例如，參照專利文獻(xiàn)1)，以及使用陽離子系或兩性表面活性劑的方法(例如，參照專利文獻(xiàn)2)。
但是，避開了血紅蛋白本身的吸收波長(zhǎng)、以特定的檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定的方法中，不僅對(duì)比色定量時(shí)的檢測(cè)波長(zhǎng)有所限定，且對(duì)測(cè)定裝置也有限制。此外，使用陽離子系或兩性表面活性劑的方法中，與試樣混合時(shí)會(huì)產(chǎn)生混濁，有時(shí)會(huì)對(duì)酶活性造成影響。
除此之外，已知組合使用2種陰離子型表面活性劑的方法(參照專利文獻(xiàn)3)，但該方法中，為了避免陰離子型表面活性劑造成的酶蛋白的變性，必須同時(shí)使用特定量的烷基磺酸鹽及烷基萘磺酸鹽。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開平9-119932號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本專利特開平3-10696號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3日本專利特開平8-89288號(hào)公報(bào)發(fā)明的揭示本發(fā)明涉及利用酶反應(yīng)測(cè)定試樣中的底物的方法，即提供可減弱共存于試樣的血紅蛋白對(duì)測(cè)定體系的干擾、適用于各種自動(dòng)分析裝置的簡(jiǎn)便有效地測(cè)定試樣中的底物的方法及其測(cè)定用試劑。
本發(fā)明者鑒于目前的情況，對(duì)利用酶反應(yīng)測(cè)定試樣中的底物的方法中的減弱共存于試樣的血紅蛋白對(duì)測(cè)定體系的干擾的方法進(jìn)行認(rèn)真研究后發(fā)現(xiàn)，通過用特定的陰離子型表面活性劑對(duì)試樣進(jìn)行處理能夠減弱血紅蛋白對(duì)測(cè)定體系的干擾，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供含有血紅蛋白的試樣中的底物的測(cè)定方法，該方法是使對(duì)應(yīng)于底物的氧化酶作用，用過氧化物酶及被氧化性顯色試劑光學(xué)測(cè)定生成的過氧化氫，籍此測(cè)定試樣中的底物，該方法的特征是，用選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基磺基琥珀酸類、聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸鹽類的陰離子型表面活性劑對(duì)含有血紅蛋白的試樣進(jìn)行處理。
本發(fā)明還提供含有血紅蛋白的試樣中的底物的測(cè)定用試劑，該試劑包含(A)選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基磺基琥珀酸類、聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸鹽類的陰離子型表面活性劑，(B)作用于底物生成過氧化氫的氧化酶，以及(C)過氧化物酶及被氧化性顯色試劑。
本發(fā)明還提供糖化蛋白質(zhì)、糖化肽或糖化氨基酸的濃度或它們的濃度比的測(cè)定方法，該方法的特征在于，至少包含(1)表面活性劑，(2)對(duì)糖化蛋白質(zhì)作用生成果糖基肽的蛋白酶，以及(3)對(duì)果糖基肽作用產(chǎn)生過氧化氫的酶。
本發(fā)明還提供血紅蛋白濃度、血紅蛋白Alc濃度及血紅蛋白Alc濃度比的測(cè)定方法，該方法的特征是，對(duì)至少用表面活性劑進(jìn)行了前處理的含有血紅蛋白的試樣中的血紅蛋白進(jìn)行測(cè)定，再使生成果糖基纈氨酰基組氨酸的蛋白酶作用于血紅蛋白測(cè)定用反應(yīng)液，進(jìn)行血紅蛋白Alc濃度測(cè)定。
本發(fā)明還提供血紅蛋白濃度、血紅蛋白Alc濃度及血紅蛋白Alc濃度比的測(cè)定方法，該方法包括混合含血細(xì)胞的試樣和含表面活性劑的反應(yīng)液，使血紅蛋白從血細(xì)胞溶出的步驟；稀釋該反應(yīng)液，利用光學(xué)方法求出血紅蛋白濃度的步驟；使蛋白酶作用于血紅蛋白，至少產(chǎn)生果糖基纈氨?；M氨酸的步驟；至少以果糖基纈氨酰基組氨酸為底物，使產(chǎn)生過氧化氫的酶作用于該底物的步驟；使過氧化氫和過氧化物酶及被氧化性顯色試劑作用的步驟；測(cè)定因顯色化合物的生成而造成的吸光度變化，求出血紅蛋白Alc濃度的步驟；以及由血紅蛋白濃度和血紅蛋白Alc濃度求出血紅蛋白Alc濃度比的步驟。
本發(fā)明還提供血紅蛋白濃度、血紅蛋白Alc濃度及血紅蛋白Alc濃度比的測(cè)定中的試樣的前處理方法，該方法的特征是，使用選自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸酯類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸類的非離子型表面活性劑及/或陰離子型表面活性劑。
本發(fā)明還提供血紅蛋白濃度測(cè)定方法，該方法的特征是，在包括使血紅蛋白從血細(xì)胞溶出的步驟和求出血紅蛋白濃度的步驟的血紅蛋白的濃度測(cè)定中，至少使用選自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸酯類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸類的非離子型表面活性劑及/或陰離子型表面活性劑。
本發(fā)明還提供采用生化學(xué)自動(dòng)分析裝置測(cè)定血紅蛋白Alc濃度比的方法，該方法的特征是，以采用生化學(xué)自動(dòng)分析裝置測(cè)定血紅蛋白Alc濃度比為目的，在設(shè)定生化學(xué)自動(dòng)分析裝置的操作條件時(shí)，(1)分別設(shè)定血紅蛋白濃度測(cè)定和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定的操作條件，(2)可將血紅蛋白濃度測(cè)定試劑作為血紅蛋白Alc濃度測(cè)定用構(gòu)成試劑共用，(3)可共用血紅蛋白濃度測(cè)定用試樣和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定用試樣，(4)可使血紅蛋白濃度測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)相同。
利用本發(fā)明的底物的測(cè)定方法，能夠減弱試樣中共存的血紅蛋白的干擾，可以高精度測(cè)定底物。此外，本發(fā)明的底物的測(cè)定方法可以簡(jiǎn)便的操作進(jìn)行測(cè)定，所以適用于各種分析方法，在臨床檢查的領(lǐng)域極其有用。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的底物的測(cè)定方法以減弱共存于試樣中的血紅蛋白的干擾為目的，除了用特定的陰離子型表面活性劑對(duì)試樣進(jìn)行處理之外，可按照公知的酶法實(shí)施。
作為本發(fā)明可適用的試樣，只要是含血紅蛋白的試樣即可，無特別限定。作為生物體試樣，可例舉全血、血細(xì)胞、血清、血漿、脊髓液、汗液、尿液、淚液、唾液、皮膚、粘膜和毛發(fā)等。其中，較好的是全血、血細(xì)胞、血清或血漿。這些試樣當(dāng)然可直接供測(cè)定，也可以在經(jīng)過過濾或透析處理后供測(cè)定，此外，還可根據(jù)需要進(jìn)行試樣(底物)的濃縮、萃取和稀釋等。
前述稀釋可用水或緩沖液進(jìn)行。對(duì)這種情況下的緩沖液的種類、濃度無特別限定，可以0.00001～2mol/L，較好是0.001～1mol/L的濃度使用磷酸、鄰苯二甲酸、檸檬酸、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、馬來酸、琥珀酸、草酸、酒石酸、乙酸、グツド(MES、PIPES、ADA等)緩沖液等。
可用于本發(fā)明的底物的測(cè)定方法的特定的陰離子型表面活性劑為選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基磺基琥珀酸類、聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸鹽類的陰離子型表面活性劑，較好的是聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽、聚氧乙烯烷基醚磷酸類或烷基磺基琥珀酸類，特好的是聚氧乙烯烷基醚磷酸、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽或烷基磺基琥珀酸類，最好的是聚氧乙烯烷基醚磷酸。這些特定的陰離子型表面活性劑可作為市售品獲得。
作為聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類，可例舉ニツコ-ルSBL-4N、ニツコ-ルSBL-2T-36(以上由日本油脂株式會(huì)社制)，エマ-ル20T、エマ-ル327、エマ-ル20C(以上由花王株式會(huì)社制)，ハイテノ-ル225L、ハイテノ-ル325D、ハイテノ-ルNF13、ハイテノ-ルNF15(以上由第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)，サンノ-ルLMT-1430、サンノ-ルDM1470(以上由獅王株式會(huì)社制)等。作為聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽類，可例舉ニツコ-ルSNP-4N(日本油脂株式會(huì)社制)，エマ-ルNC35(花王株式會(huì)社制)等。聚氧乙烯烷基醚磷酸類可以是磷酸單酯、磷酸二酯或其混合物，作為聚氧乙烯烷基醚磷酸類，可例舉プライサ-フA208B、プライサ-フA219B、プライサ-フA208S、プライサ-フA212C、プライサ-フA212E、プライサ-フA215C(以上由第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)等。這些聚氧乙烯烷基醚磷酸中，較好的是プライサ-フA208B。作為聚氧乙烯烷基磺基琥珀酸類，可例舉ネオハイテノ-ルS-70、ネオハイテノ-ルL-30、ネオハイテノ-ルLM-20(以上由第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)等。作為聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類，可例舉カオ-アキポRLM-100NV(花王株式會(huì)社制)，ネオハイテノ-ルECL-30(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)，エヌジエコブ2PS30、エヌジエコブ2PS45(以上由新日本理化株式會(huì)社制)等。作為聚氧乙烯烷基醚磺酸類，可例舉リオノ-ルOAI-N、リオノ-ルOBI(以上由獅王株式會(huì)社制)等。
作為月桂基硫酸三乙醇胺，可例舉エマ-ルTD(花王株式會(huì)社制)。作為烷基磺基琥珀酸類，可例舉ペレツクスCS(花王株式會(huì)社制)。作為烷基苯基醚磺酸鹽類，可例舉ペレツクスSS-H(花王株式會(huì)社制)。
含有血紅蛋白的試樣的處理可通過混合該特定的陰離子型表面活性劑和試樣來進(jìn)行。特定的陰離子型表面活性劑的用量以與前述全血、血細(xì)胞、血清等試樣混合后的濃度計(jì)為0.0001～10％，較好為0.001～3％。對(duì)含有血紅蛋白的試樣的處理時(shí)間和處理溫度無特別限定，例如，用于自動(dòng)分析裝置時(shí)，較好的是處理時(shí)間5分鐘，處理溫度37℃等。另外也可以在用于自動(dòng)分析裝置前進(jìn)行其它處理。這些處理?xiàng)l件都可通過實(shí)驗(yàn)適當(dāng)選擇。只要利用特定的陰離子型表面活性劑對(duì)試樣進(jìn)行處理時(shí)的pH和添加物等對(duì)利用酶反應(yīng)測(cè)定底物時(shí)無不良影響，同樣對(duì)它們沒有特別限定。
可利用本發(fā)明的底物的測(cè)定方法測(cè)定的底物只要是可通過使用氧化酶的酶法進(jìn)行測(cè)定的底物即可，無特別限定。因此，本發(fā)明的底物包括其本身是可成為氧化酶的底物的物質(zhì)的情況，以及通過酶反應(yīng)或某些處理獲得的生成物可成為氧化酶的底物的情況(相當(dāng)于來自前述特定成分的成分)。這些底物可例示葡萄糖、甘露糖、半乳糖等糖類，膽甾醇、中性脂肪、磷脂、游離脂肪酸等脂質(zhì)類，糖化白蛋白、糖化血紅蛋白等糖化蛋白質(zhì)類，尿酸、尿素、肌酸內(nèi)酰胺、唾液酸、多胺等。
其中，葡萄糖、尿酸等屬于其本身是可成為氧化酶的底物的物質(zhì)的情況，用水解酶對(duì)血清中的酯型膽甾醇進(jìn)行處理而得的膽甾醇或用蛋白酶對(duì)血清中的糖化蛋白質(zhì)進(jìn)行處理而得的糖化肽及糖化氨基酸等屬于通過酶反應(yīng)或某些處理而獲得的生成物可成為氧化酶的底物的情況。
通過酶反應(yīng)或某些處理而獲得的生成物可成為氧化酶的底物的情況中，進(jìn)一步舉例說明用蛋白酶對(duì)糖化蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，獲得成為氧化酶的底物的糖化肽及糖化氨基酸的情況。
這種情況下的蛋白酶只要具備蛋白分解活性和肽分解活性即可，可來源于微生物、動(dòng)物、植物等各種途徑，對(duì)其無特別限定。使用可在短時(shí)間內(nèi)有效地從作為目的物的糖化蛋白質(zhì)(例如，血紅蛋白Alc)游離糖化肽或糖化氨基酸，較好為果糖基肽或果糖基氨基酸，特好為果糖基纈氨?；M氨酸或果糖基纈氨酸的蛋白酶。具體來講可例舉蛋白酶K、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、羧肽酶、木瓜酶、胃蛋白酶、氨肽酶等作為研究用試劑被廣泛銷售的蛋白酶；中性蛋白酶、トヨチ-ムNEP(以上由東洋紡株式會(huì)社制)，酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、耐酸性蛋白酶、AO蛋白酶、肽酶(以上由キツコ-マン株式會(huì)社制)，スミチ-ムCP、スミチ-ムTP、スミチ-ムLP50D(以上由新日本化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制)，サモア-ゼPC10F、プロチンPC、プロチンPC10F、プロチンPS10、プロチンNY10、プロチンNL10、プロチンNC25(以上由大和化成株式會(huì)社制)，アクチナ-ゼAS(科研制藥株式會(huì)社制)，プロナ-ゼE(ロシユ株式會(huì)社制)，ウマミザイム、蛋白酶S“アマノ”G、蛋白酶A“アマノ”G、蛋白酶P“アマノ”3G(以上由アマノ酶株式會(huì)社制)等市售的工業(yè)用酶。使這些蛋白酶與作為目的物的糖化蛋白質(zhì)、果糖基肽作用，利用毛細(xì)電泳對(duì)作用前后的試樣進(jìn)行分析，通過比較可確認(rèn)效果。上述蛋白酶可單獨(dú)使用，也可2種以上組合使用。其中，較好的是來自桿菌屬、曲霉屬或鏈霉菌屬的微生物或由其基因產(chǎn)生的酶，或?qū)儆诮饘俚鞍酌?、中性蛋白酶、酸性蛋白酶或堿性蛋白酶的酶。
蛋白酶的濃度只要是能夠?qū)⒛康牡孜镉行У赜坞x的濃度即可，無特別限定?？煽紤]所用酶的活性率等，根據(jù)實(shí)際的經(jīng)驗(yàn)適當(dāng)設(shè)定使用濃度。用蛋白酶進(jìn)行處理時(shí)的pH無需特別的調(diào)整，但為了形成適應(yīng)于所用酶的作用的pH，可利用適當(dāng)?shù)膒H調(diào)節(jié)劑，例如利用緩沖液將品pH調(diào)整為3～11。處理溫度較好為10～40℃。
可在本發(fā)明的底物的測(cè)定方法中使用的氧化酶是具備氧化需測(cè)定的底物生成過氧化氫的能力的酶，可使用公知的氧化酶。例如可例舉葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶、尿酸酶、膽甾醇氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶(日本專利特開2003-79386號(hào)公報(bào)及國(guó)際公開第97/20039號(hào)小冊(cè)子)、酮胺氧化酶(日本專利特開平5-19219號(hào)公報(bào))、果糖基肽氧化酶(日本專利特開2001-95598號(hào)公報(bào)及特開2003-235585號(hào)公報(bào))等。這些酶可以來源于微生物、動(dòng)物、植物等各種途徑，也可以是通過基因方法獲得的酶。另外，也不介意是否進(jìn)行了化學(xué)修飾。這些酶可以是溶液狀態(tài)也可以是干燥狀態(tài)，可保持或結(jié)合于不溶性載體，可以單獨(dú)使用也可以2種以上組合使用。
這些酶的用量根據(jù)酶的種類的不同而不同，可考慮所用酶的活性率，根據(jù)實(shí)際的經(jīng)驗(yàn)適當(dāng)設(shè)定使用濃度，無特別限定。較好的是0.001～1000單位/mL，特好為0.01～1000單位/mL?？紤]所用酶的最適pH，采用緩沖液調(diào)整使其作用時(shí)的pH值。使其發(fā)揮作用時(shí)的溫度例如為10～40℃，可適當(dāng)選擇被用于通常的酶反應(yīng)的溫度。
上述氧化酶可根據(jù)需要與其它的酶、輔酶、被氧化性顯色試劑等組合使用。其它的酶可例舉過氧化物酶、心肌黃酶或不以果糖基纈氨酸為底物的氨基酸代謝酶等。此外，以對(duì)血紅蛋白以外的生物體內(nèi)的干擾物質(zhì)進(jìn)行處理為目的，也可使用抗壞血酸氧化酶、膽紅素氧化酶等酶。作為輔酶，可例舉煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型磷酸(NADPH)、硫代NAD、硫代NADP等。
作為被氧化性顯色試劑，只要是與過氧化氫反應(yīng)進(jìn)行顯色的試劑即可。例如可例舉4-氨基安替比林和酚系、納夫妥系或苯胺系化合物的組合，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙和苯胺系化合物的組合等。作為可與4-氨基安替比林組合的酚系化合物，可例舉苯酚、對(duì)氯苯酚、2，4-二氯苯酚、2，4-二溴苯酚、2，4，6-三氯苯酚等，作為苯胺系化合物，可例舉N，N-二甲基苯胺、N，N-二乙基苯胺、N，N-二甲基-間甲苯胺、N，N-二乙基-間甲苯胺、N-乙基-N-磺基丙基-間甲苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-間甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺、3-甲基-N-乙基-N-(羥基乙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)苯胺(ALOS)、N-乙基-N-(3-磺基丙基)苯胺(ALPS)、N，N-二甲基-間茴香胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-間茴香胺(ADOS)等。另外，可例舉N-(羧基甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲基氨基)-二苯基胺·鈉鹽(DA-64)、10-(羧基甲基氨基羰基)-3，7-雙(二甲基氨基)-吩噻嗪·鈉鹽(DA-67)、10-N-甲基氨基甲?；?3，7-二甲基氨基-10H-吩噻嗪(MCDP)、N，N，N’，N’，N”，N”-六-3-磺基丙基-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷(TPM-PS)、二氨基聯(lián)苯胺、羥基苯基丙酸、四甲基聯(lián)苯胺、鄰苯二胺等。
本發(fā)明的底物的測(cè)定方法可以是用前述陰離子型表面活性劑對(duì)試樣進(jìn)行處理、減弱試樣中的血紅蛋白的干擾的步驟和使氧化酶作用、測(cè)定生成的過氧化氫的步驟分別進(jìn)行來測(cè)定底物，也可以是上述步驟連續(xù)地以一步進(jìn)行來測(cè)定底物，反應(yīng)溫度在上述2個(gè)步驟中可以相同也可以不同，本發(fā)明的底物測(cè)定用試劑為溶液狀態(tài)的溫度例如較好為10～40℃。
本發(fā)明的底物的測(cè)定方法可減弱通過氧化酶反應(yīng)測(cè)定底物時(shí)的血紅蛋白的干擾，另一方面，如果在用本發(fā)明涉及的陰離子型表面活性劑對(duì)試樣進(jìn)行了處理的階段測(cè)定血紅蛋白所具有的吸收波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的吸光度，則可測(cè)定試樣中的血紅蛋白。由于籍此能夠測(cè)定糖化血紅蛋白(較好為血紅蛋白Alc)，所以對(duì)利用本發(fā)明的底物的測(cè)定方法測(cè)定血紅蛋白Alc的情況進(jìn)行說明。
血紅蛋白Alc是由包含在紅細(xì)胞中的血紅蛋白非酶糖化而形成的，由于反映過去一定時(shí)間內(nèi)的平均血糖值，所以被視為重要的臨床檢查指標(biāo)。由于血紅蛋白Alc以對(duì)應(yīng)于總血紅蛋白存在量的比例(％)表示，所以其測(cè)定必須包括(i)使紅細(xì)胞溶血，使血紅蛋白釋放至紅細(xì)胞外，形成可進(jìn)行測(cè)定的狀態(tài)的步驟；(ii)測(cè)定血紅蛋白的存在量的步驟；(iii)測(cè)定血紅蛋白Alc的存在量的步驟(采用酶法時(shí)，包括利用蛋白酶使特異性糖化肽或糖化氨基酸從血紅蛋白Alc游離的步驟，以及使用特異性氧化酶測(cè)定該游離的糖化肽或糖化氨基酸的步驟)；(iv)用血紅蛋白Alc存在量除以總血紅蛋白存在量求出比例的步驟(演算步驟)。如前所述，本說明書中的“底物的測(cè)定”一詞除了是指試樣中的底物的存在量(例如濃度)的測(cè)定之外，還包括特定的底物物質(zhì)中所占的存在比例(例如濃度比)的測(cè)定。
本發(fā)明涉及的陰離子型表面活性劑由于具有血紅蛋白的高鐵(メト)化處理能力，所以可測(cè)定血紅蛋白的吸收波長(zhǎng)區(qū)域的吸光度，毫無問題地實(shí)施(ii)的步驟。
(i)的步驟中可使用以往公知的各種表面活性劑(例如，非離子型表面活性劑Triton X-100等)，本發(fā)明涉及的陰離子型表面活性劑，特別是選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸酯類或月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類、烷基苯基醚磺酸類的陰離子型表面活性劑可用于(i)的步驟，可單獨(dú)使用也可與以往公知的各種表面活性劑并用。此外，(i)的步驟中，作為可單獨(dú)或與本發(fā)明的陰離子型表面活性劑并用的非離子型表面活性劑，除了以往公知的表面活性劑之外，可使用作為聚氧乙烯衍生物的エマルゲン類(花王株式會(huì)社制，エマルゲン709、エマルゲン108、エマルゲンA90、エマルゲンB66等)，ニツコ-ル類(ニツコ-ケミカルズ株式會(huì)社制，ニツコ-ルBC20TX、ニツコ-ルOP-10、ニツコ-ルBT9等)，リポノツクス類(獅王株式會(huì)社制，リポノツクスNC80、リポノツクスOC100等)，レオコ-ル類(獅王株式會(huì)社制，レオコ-ルTD90、レオコ-ルSC120等)，ノイゲン類(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制，ノイゲンEA120、ノイゲンET147等)，エパン類(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制，エパン485、エパンU103等)，プルロニツク類(旭電化株式會(huì)社制，プルロニツクF、プルロニツクTR704等)，アデカト-ル類(旭電化株式會(huì)社制，アデカト-ルSO120等)。
(iii)的步驟是利用蛋白酶使來自血紅蛋白Alc的糖化肽或糖化氨基酸從血紅蛋白Alc游離，再使用果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶來實(shí)施的。(iii)的步驟如前所述，進(jìn)一步詳細(xì)地對(duì)其說明。血紅蛋白Alc的測(cè)定中，血紅蛋白β-亞單位的氨基末端的纈氨酸被糖化而得的果糖基纈氨酸或果糖基纈氨?；M氨酸和ε-果糖基賴氨酸對(duì)氧化酶的反應(yīng)性的不同決定了特異性，但血紅蛋白分子中存在44個(gè)賴氨酸殘基，即使對(duì)ε-果糖基賴氨酸的反應(yīng)性較低，其影響力也不能夠忽視。另外，血紅蛋白的α鏈N末端的纈氨酸通過糖化可轉(zhuǎn)變?yōu)楣腔i氨酸，但由于與纈氨酸相鄰結(jié)合的氨基酸不是組氨酸，所以未生成果糖基纈氨酰基組氨酸。因此，為確保利用酶法的血紅蛋白Alc測(cè)定的特異性，當(dāng)然需要盡可能排除將果糖基賴氨酸也測(cè)定在內(nèi)的情況，測(cè)定果糖基纈氨酰基組氨?；谋葍H測(cè)定果糖基纈氨酸要更理想。因此，從特異性提高的觀點(diǎn)考慮，最理想的是通過用蛋白酶使果糖基纈氨酰基組氨?；?、較好是果糖基纈氨?；M氨酸游離，以及使果糖基肽氧化酶作用于果糖基纈氨?；M氨酸。
作為上述蛋白酶，較好的是來自桿菌屬、曲霉屬或鏈霉菌屬的微生物或由其基因重組產(chǎn)生的酶。來自桿菌屬的酶可例舉プロチンPC10F、プロチンNC25(大和化成株式會(huì)社制)，トヨチ-ムNEP(東洋紡株式會(huì)社制)等；來自曲霉屬的酶可例舉耐酸性蛋白酶(キツコ-マン株式會(huì)社制)；來自鏈霉菌屬的酶可例舉アクチナ-ゼAS、アクチナ-ゼAF、アクチナ-ゼE(科研制藥)，蛋白酶Type-XIV(Siga公司制)等。它們可單獨(dú)使用，也可將トヨチ-ムNEP等和蛋白酶K混合并用。這些酶較好為屬于金屬蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶或堿性蛋白酶的酶。使用濃度或使用條件如前所述。
作為上述果糖基肽氧化酶，可例舉改變了由棒狀桿菌屬的菌產(chǎn)生的果糖基氨基酸氧化酶的酶(日本專利特開2001-95598號(hào)公報(bào))、來自絲狀菌的果糖基肽氧化酶(日本專利特開2003-235585號(hào)公報(bào))等。特好的是FPOX-CE或FPOX-EE(都由キツコ-マン株式會(huì)社制)。
可依次實(shí)施(i)的步驟至(iv)的步驟，也可同時(shí)實(shí)施多個(gè)步驟。例如，如果用同時(shí)包含Triton X-100等以溶血為目的的表面活性劑和プライサ-フA208B等本發(fā)明的陰離子型表面活性劑的試劑對(duì)全血或血細(xì)胞進(jìn)行處理，則可同時(shí)實(shí)施(i)、(ii)的步驟，如果再有蛋白酶K或アクチナ-ゼAS等蛋白酶共存，還可同時(shí)實(shí)施(iii)的步驟的一部分。
此外，利用本發(fā)明的血紅蛋白Alc的測(cè)定方法，采用日立7150型自動(dòng)分析裝置等臨床檢查(特別是生化學(xué)檢查)領(lǐng)域常用的自動(dòng)分析裝置(以下有時(shí)稱為“生化學(xué)自動(dòng)分析裝置”)，測(cè)定血紅蛋白Alc濃度比(％)(以下有時(shí)稱為“血紅蛋白Alc(％)”)的情況下，設(shè)定生化學(xué)自動(dòng)分析裝置的操作條件時(shí)，(1)分別設(shè)定血紅蛋白濃度測(cè)定和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定的操作條件，(2)可將血紅蛋白濃度測(cè)定試劑作為血紅蛋白Alc濃度測(cè)定用構(gòu)成試劑共用，(3)可共用血紅蛋白濃度測(cè)定用試樣和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定用試樣，(4)可使血紅蛋白濃度測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)相同。本發(fā)明還提供以該(1)～(4)項(xiàng)為特征的采用生化學(xué)自動(dòng)分析裝置測(cè)定血紅蛋白Alc值(％)的方法。
本發(fā)明的試劑在測(cè)定血紅蛋白Alc濃度比時(shí)，不論是使用1個(gè)反應(yīng)容器測(cè)定血紅蛋白濃度和血紅蛋白Alc濃度，或者是用生化學(xué)自動(dòng)分析裝置進(jìn)行測(cè)定時(shí)，都可以是采用連續(xù)添加構(gòu)成試劑的所謂的單通道法，但設(shè)定生化學(xué)自動(dòng)分析裝置的操作條件時(shí)，最好分別設(shè)定血紅蛋白濃度測(cè)定和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定的試劑用量等操作條件。本發(fā)明的試劑中可將血紅蛋白濃度測(cè)定用試劑共用作血紅蛋白Alc濃度測(cè)定用構(gòu)成試劑，試樣也可以共用。測(cè)定條件中，可使血紅蛋白濃度測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)相同。
本發(fā)明的底物測(cè)定用試劑包含(A)選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基磺基琥珀酸類、聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸鹽類的陰離子型表面活性劑，(B)作用于底物或作用于通過酶反應(yīng)產(chǎn)生的底物生成過氧化氫的氧化酶，以及(C)過氧化物酶及被氧化性顯色試劑。
此外，也可以由使前述(B)記載的氧化酶作用獲得的生成物再產(chǎn)生過氧化氫來提高靈敏度。例如，可使由血紅蛋白Alc游離的糖化肽或糖化氨基酸和果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶作用時(shí)生成的葡糖酮醛中含有糖氧化分解酶(日本專利特開2000-333696號(hào)公報(bào))。作為這種情況下的糖氧化分解酶，較好的是選自葡糖氧化酶、β-半乳糖氧化酶、吡喃糖氧化酶的至少1種氧化酶。另外，如前所述，可使用將血紅蛋白從紅細(xì)胞提取供于反應(yīng)的前處理劑。此外，還可添加對(duì)血液中的夾雜成分進(jìn)行處理的酶，氯化鈉、氯化鉀、亞鐵氰化鈉等鹽，反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，用于消除還原性物質(zhì)的影響的四唑鹽，作為防腐劑的抗生素和疊氮化鈉等。
本發(fā)明的底物測(cè)定用試劑不僅可以溶液狀態(tài)提供，也可以干燥狀態(tài)或凝膠狀態(tài)提供。此外，能夠以將其填充于玻璃瓶、塑料容器等中，或者將其涂布、含浸于不溶性載體等的形態(tài)提供。作為不溶性載體，可例舉膠乳、玻璃、膠體等粒子·球狀載體，半導(dǎo)體或玻璃等平板狀載體，紙或硝基纖維素等膜狀載體，纖維狀載體。
實(shí)施例以下，例舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說明，但本發(fā)明并不僅限于此。
尿酸的測(cè)定
(1)試樣的調(diào)制在9體積的血清中加入1體積的生理食鹽水或人血紅蛋白溶液，調(diào)制血紅蛋白濃度分別為0、100、300及500mg/dL的含有血紅蛋白的試樣。
(2)試樣的測(cè)定采用日本7150型自動(dòng)分析裝置，通過以下操作測(cè)定各試樣。
(第一試劑)陰離子型表面活性劑實(shí)施例10.5％エマ-ル20C(花王株式會(huì)社制)實(shí)施例20.5％ハイテノ-ルNF13(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)實(shí)施例30.05％ハイテノ-ルNF15(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)實(shí)施例40.5％プライサ-フA208B(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)實(shí)施例50.05％ペレツクスCS(花王株式會(huì)社制)實(shí)施例60.1％ペレツクスSS-H(花王株式會(huì)社制)比較例1不含陰離子型表面活性劑比較例20.05％ラテムルPS+0.05％ペレツクスNBL比較例30.1％ラテムルPS+0.1％ペレツクスNBL500μmol/L TOOS(同仁化學(xué)株式會(huì)社制)50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)將在組合陰離子型表面活性劑、避免血紅蛋白的干擾的以往公知(日本專利特開平8-89288號(hào)公報(bào))的方法中記載的烷基磺酸鈉鹽(商品名ラテムルPS花王株式會(huì)社制)及烷基萘磺酸鈉鹽(商品名ペレツクスNB-L花王株式會(huì)社制)的組合作為比較例2和3。
(第二試劑)2單位/mL尿酸酶(東洋紡株式會(huì)社制)10單位/mL過氧化物酶(III)(東洋紡株式會(huì)社制)1mmol/L 4-氨基安替比林50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)在7μL各試樣中加入第一試劑260μL，測(cè)定于37℃加溫5分鐘后的吸光度(吸光度I)。然后，加入第二試劑130μL，測(cè)定于37℃加溫5分鐘后的吸光度(吸光度II)。吸光度的測(cè)定在主波長(zhǎng)546nm(副波長(zhǎng)800nm)下進(jìn)行，用生理食鹽水替代試樣進(jìn)行同樣地操作(試劑空白)作為對(duì)照。由各試樣的吸光度I及吸光度II，用式A算出各試樣的吸光度變化量，將濃度已知的尿酸溶液(20mg/dL)作為試樣，與上述同樣操作，將其吸光度變化量與上述吸光度變化量進(jìn)行比較，算出尿酸濃度。
式A試樣的吸光度＝吸光度II-(吸光度I×(7+260)/(7+260+130))對(duì)于所得尿酸的測(cè)定值，以血紅蛋白濃度為0mg/dL時(shí)的測(cè)定值作為100％進(jìn)行比較，結(jié)果示于表1。
表1

(％)(％) (％) (％)從表1可明顯看出，以往公知的陰離子型表面活性劑的組合(比較例2和3)與未添加表面活性劑的比較例1相比，血紅蛋白的干擾反而增加。對(duì)應(yīng)于此，使用了本發(fā)明的陰離子型表面活性劑的情況(實(shí)施例1～6)中的任一項(xiàng)與未添加表面活性劑的比較例1相比，血紅蛋白的干擾得到減弱。因此，可以認(rèn)為本發(fā)明的底物的測(cè)定方法在用以往公知的方法無效的情況下也是有效的。
果糖基氨基酸的測(cè)定(1)試樣的調(diào)制使用為使542nm下的吸光度達(dá)到5OD而調(diào)制的血紅蛋白—生理食鹽水稀釋液，調(diào)制果糖基纈氨酸(fV)濃度為5μmol/L、10μmol/L的含有血紅蛋白的試樣。作為對(duì)照，用生理食鹽水替代血紅蛋白—生理食鹽水稀釋液。fV使用バイオクエスト株式會(huì)社的產(chǎn)品。
(2)試樣的測(cè)定采用日本7150型自動(dòng)分析裝置，通過以下操作測(cè)定各試樣。
(第一試劑)
陰離子型表面活性劑實(shí)施例70.2％プライサ-フA208B(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)比較例4不含陰離子型表面活性劑20mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)(第二試劑)15單位/mL果糖基氨基酸氧化酶(キツコ-マン株式會(huì)社制)20單位/mL過氧化物酶(III)(東洋紡株式會(huì)社制)80μmol/L TPM-PS(同仁化學(xué)株式會(huì)社制)200mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)在20μL各試樣中加入第一試劑240μL，測(cè)定于37℃加溫5分鐘后的吸光度(吸光度I)。然后，加入第二試劑80μL，測(cè)定于37℃加溫5分鐘后的吸光度(吸光度II)。吸光度的測(cè)定及試樣的吸光度變化量的計(jì)算按照實(shí)施例1～6的方法進(jìn)行。結(jié)果示于表2。
表2

(μmol/L) (mOD/mL)(mOD/mL)(％)a對(duì)照組的吸光度變化量，b含有血紅蛋白的試樣的吸光度變化量從表2可明顯看出，使用了本發(fā)明的陰離子型表面活性劑的情況下，血紅蛋白的干擾被減弱。
果糖基氨基酸的測(cè)定(1)試樣的調(diào)制與實(shí)施例7同樣調(diào)制含有血紅蛋白的試樣及對(duì)照試樣。
(2)試樣的測(cè)定使用日立7150型自動(dòng)分析裝置，除了所用第二試劑如下所示之外，其它操作步驟與實(shí)施例7同樣，對(duì)各試樣進(jìn)行測(cè)定。
(第二試劑)4單位/mL果糖基肽氧化酶(キツコ-マン株式會(huì)社制)20單位/mL過氧化物酶(III)(東洋紡株式會(huì)社制)80μmol/L TPM-PS(同仁化學(xué)株式會(huì)社制)200mmol/L磷酸緩沖液(pH5.5)表3

(μmol/L)(mOD/mL) (mOD/mL)(％)a對(duì)照組的吸光度變化量，b含有血紅蛋白的試樣的吸光度變化量從表3可明顯看出，使用了本發(fā)明的陰離子型表面活性劑的情況下，血紅蛋白的干擾被減弱。
血紅蛋白Alc的測(cè)定(1)試樣的調(diào)制采用含有EDTA作為抗凝劑的采血管，按照常規(guī)方法從10個(gè)被檢者采集全血，將該全血在冷藏室內(nèi)靜置一晚，使紅細(xì)胞沉降。從沉降的各紅細(xì)胞層中分別提取10μL，在其中添加混合0.1％的Triton X-100水溶液，調(diào)制出血細(xì)胞溶血試樣。
(2)試樣的測(cè)定采用日立7150型自動(dòng)分析裝置，通過以下操作測(cè)定各試樣。
(第一試劑)陰離子型表面活性劑實(shí)施例90.5％プライサ-フA212E(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)實(shí)施例100.5％プライサ-フA215C(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)實(shí)施例110.2％プライサ-フA208B(第一工業(yè)制藥株式會(huì)社制)實(shí)施例120.5％ニツコ-ルSBL-4N(日本油脂株式會(huì)社制)實(shí)施例133.0％エマ-ルNC35(花王株式會(huì)社制)比較例6不含陰離子型表面活性劑1單位/mL蛋白酶K0.02mol/L磷酸緩沖液(pH8.0)
(第二試劑)4單位/mL果糖基肽氧化酶(FPOX-CE，キツコ-マン株式會(huì)社制)20單位/mL過氧化物酶(III)(東洋紡株式會(huì)社制)80μmol/L TPM-PS(同仁化學(xué)株式會(huì)社制)7500單位/mLトヨチ-ムNEP(東洋紡株式會(huì)社制)*37.5mmol/L NaCl0.2mol/L磷酸緩沖液(pH5.5)*于4℃，10萬單位/mL的濃稠液對(duì)含500mmol/L的NaCl的20mmol/L的磷酸緩沖液(pH5.5)進(jìn)行4小時(shí)的透析后使用トヨチ-ムNEP。
在20μL各試樣中加入第一試劑240μL，測(cè)定于37℃加溫5分鐘后的吸光度(吸光度III)。然后，加入第二試劑80μL，測(cè)定于37℃加溫5分鐘后的吸光度(吸光度IV)。吸光度的測(cè)定在波長(zhǎng)600nm下進(jìn)行，用生理食鹽水替代試樣進(jìn)行同樣的操作(試劑空白)作為對(duì)照。
由各試樣的吸光度III及吸光度IV，用式B算出各試樣中的基于果糖基肽量的吸光度變化量(吸光度V)。
式B吸光度V＝吸光度IV-(吸光度III×(20+240)/(20+240+80))由于與試樣中的總血紅蛋白濃度成比例，所以將上述吸光度III與對(duì)血紅蛋白Alc值(％)已知的血細(xì)胞溶血液(血紅蛋白Alc值8.6％)進(jìn)行和上述同樣的操作時(shí)的吸光度III及吸光度V進(jìn)行比較，算出各試樣的血紅蛋白Alc值(％)。
分別將通過實(shí)施例9～13及比較例6求出的血紅蛋白Alc值(％)與利用市售的試劑盒“ラピデイアAlc”(富士レビオ株式會(huì)社制)測(cè)定的各試樣的血紅蛋白Alc值(％)(參考例)進(jìn)行比較。結(jié)果示于表4。
表4

除相關(guān)系數(shù)以外的值為(％)從表4可明顯看出，不含本發(fā)明的陰離子型表面活性劑的比較例6有時(shí)出乎意料地出現(xiàn)了負(fù)值，完全無法進(jìn)行血紅蛋白Alc值(％)的測(cè)定。對(duì)應(yīng)于此，利用本發(fā)明的底物的測(cè)定方法獲得的血紅蛋白Alc值(％)與參考例的結(jié)果顯現(xiàn)出良好的相關(guān)性。利用本發(fā)明的底物的測(cè)定方法，能夠避免含有血紅蛋白的試樣中的血紅蛋白的干擾，測(cè)定試樣中的血紅蛋白Alc和總血紅蛋白。
權(quán)利要求
1.含有血紅蛋白的試樣中的底物的測(cè)定方法，該方法通過使對(duì)應(yīng)于底物的氧化酶作用，用過氧化物酶及被氧化性顯色試劑光學(xué)測(cè)定生成的過氧化氫來測(cè)定試樣中的底物，其特征在于，用選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基磺基琥珀酸類、聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸鹽類的陰離子型表面活性劑對(duì)含有血紅蛋白的試樣進(jìn)行處理。
2.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征還在于，上述陰離子型表面活性劑為聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類或烷基磺基琥珀酸類。
3.如權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定方法，其特征還在于，試樣中的底物為尿酸，氧化酶為尿酸酶。
4.如權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定方法，其特征還在于，試樣中的底物為果糖基氨基酸或果糖基肽，氧化酶為果糖基氨基酸氧化酶或果糖基肽氧化酶。
5.含有血紅蛋白的試樣中的底物的測(cè)定用試劑，其特征在于，包含(A)選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基磺基琥珀酸類、聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸鹽類的陰離子型表面活性劑，(B)作用于底物生成過氧化氫的氧化酶，以及(C)過氧化物酶及被氧化性顯色試劑。
6.糖化蛋白質(zhì)、糖化肽或糖化氨基酸的濃度或它們的濃度比的測(cè)定方法，其特征在于，至少包含(1)表面活性劑，(2)對(duì)糖化蛋白質(zhì)作用生成果糖基肽的蛋白酶，以及(3)對(duì)果糖基肽作用產(chǎn)生過氧化氫的酶。
7.如權(quán)利要求6所述的糖化蛋白質(zhì)、糖化肽或糖化氨基酸的濃度或它們的濃度比的測(cè)定方法，其特征還在于，表面活性劑為非離子型表面活性劑及/或陰離子型表面活性劑，選自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸酯類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸類。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征還在于，磷酸酯為聚氧乙烯烷基醚磷酸的單酯、二酯或它們的混合物。
9.如權(quán)利要求6～8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征還在于，蛋白酶作用于糖化蛋白質(zhì)或糖化肽而生成的果糖基肽為果糖基纈氨酰基組氨酸。
10.如權(quán)利要求6～9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征還在于，蛋白酶是來自桿菌屬、曲霉屬或鏈霉菌屬的酶或通過它們的基因重組產(chǎn)生的酶，該蛋白酶單獨(dú)或多種作用于糖化蛋白質(zhì)時(shí)，至少產(chǎn)生果糖基纈氨?；M氨酸。
11.如權(quán)利要求6～10中任一項(xiàng)所述的方法，其特征還在于，作用于果糖基肽產(chǎn)生過氧化氫的酶至少以果糖基纈氨?；M氨酸為底物。
12.如權(quán)利要求6～11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征還在于，糖化蛋白質(zhì)為血紅蛋白Alc。
13.血紅蛋白濃度、血紅蛋白Alc濃度及血紅蛋白Alc濃度比的測(cè)定方法，其特征在于，對(duì)至少用表面活性劑進(jìn)行了前處理的含有血紅蛋白的試樣中的血紅蛋白進(jìn)行測(cè)定，再使生成果糖基纈氨?；M氨酸的蛋白酶作用于血紅蛋白測(cè)定用反應(yīng)液，進(jìn)行血紅蛋白Alc濃度測(cè)定。
14.血紅蛋白濃度、血紅蛋白Alc濃度及血紅蛋白Alc濃度比的測(cè)定方法，其特征在于，包括混合含血細(xì)胞的試樣和含表面活性劑的反應(yīng)液，使血紅蛋白從血細(xì)胞溶出的步驟；稀釋該反應(yīng)液，利用光學(xué)方法求出血紅蛋白濃度的步驟；使蛋白酶作用于血紅蛋白，至少產(chǎn)生果糖基纈氨?；M氨酸的步驟；至少以果糖基纈氨?；M氨酸為底物，使產(chǎn)生過氧化氫的酶作用于該底物的步驟；使過氧化氫和過氧化物酶及被氧化性顯色試劑作用的步驟；測(cè)定因顯色化合物的生成而造成的吸光度變化，求出血紅蛋白Alc濃度的步驟；以及由血紅蛋白濃度和血紅蛋白Alc濃度求出血紅蛋白Alc濃度比的步驟。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征還在于，試樣中的底物是果糖基纈氨?；M氨酸或利用來自被添加于反應(yīng)液的試樣以外的蛋白酶產(chǎn)生底物的生物體成分，產(chǎn)生過氧化氫的酶為果糖基肽氧化酶。
16.血紅蛋白濃度、血紅蛋白Alc濃度及血紅蛋白Alc濃度比的測(cè)定中的試樣的前處理方法，其特征在于，使用選自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸酯類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸類的非離子型表面活性劑及/或陰離子型表面活性劑。
17.血紅蛋白濃度測(cè)定方法，其特征在于，在包括使血紅蛋白從血細(xì)胞溶出的步驟和求出血紅蛋白濃度的步驟的血紅蛋白的濃度測(cè)定中，至少使用選自聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸酯類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸類的非離子型表面活性劑及/或陰離子型表面活性劑。
18.采用生化學(xué)自動(dòng)分析裝置測(cè)定血紅蛋白Alc濃度比的方法，其特征在于，以采用生化學(xué)自動(dòng)分析裝置測(cè)定血紅蛋白Alc濃度比為目的，在設(shè)定生化學(xué)自動(dòng)分析裝置的操作條件時(shí)，(1)分別設(shè)定血紅蛋白濃度測(cè)定和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定的操作條件，(2)可將血紅蛋白濃度測(cè)定試劑作為血紅蛋白Alc濃度測(cè)定用構(gòu)成試劑共用，(3)可共用血紅蛋白濃度測(cè)定用試樣和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定用試樣，(4)可使血紅蛋白濃度測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)和血紅蛋白Alc濃度測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)相同。
全文摘要
本發(fā)明提供可減弱試樣中的血紅蛋白的干擾、適用于各種自動(dòng)分析裝置的簡(jiǎn)便且有效的測(cè)定試樣中的底物的方法及其測(cè)定用試劑。含有血紅蛋白的試樣中的底物的測(cè)定方法是通過使對(duì)應(yīng)于底物的氧化酶作用，用過氧化物酶及被氧化性顯色試劑光學(xué)測(cè)定生成的過氧化氫來測(cè)定試樣中的底物的方法，該方法的特征在于，用選自聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磷酸類、聚氧乙烯烷基磺基琥珀酸類、聚氧乙烯烷基醚羧酸鹽類、聚氧乙烯烷基醚磺酸鹽類、月桂基硫酸三乙醇胺、烷基磺基琥珀酸類及烷基苯基醚磺酸鹽類的陰離子型表面活性劑對(duì)含有血紅蛋白的試樣進(jìn)行處理。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1882696SQ200480033978
公開日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者谷口由利子, 齋藤和典 申請(qǐng)人:第一化學(xué)藥品株式會(huì)社