專(zhuān)利名稱(chēng)：作為抗凝劑的新的靶向組織因子的血栓調(diào)節(jié)蛋白融合蛋白的制作方法
背景技術(shù)：
保持血管內(nèi)促凝和抗凝活性之間的適當(dāng)平衡對(duì)于正常止血是必要的(Davie，E.W.et al.(1991)Biochemistry，30(43)10363-10370)。擾亂該平衡使之偏向于凝血將造成血栓形成，這會(huì)引起心臟病發(fā)作、卒中、肺栓塞和靜脈血栓形成。需要更有效和更安全的抗凝劑來(lái)治療特殊的血栓性疾病。
組織因子(“TF”)是一種跨膜糖蛋白，它是凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的主要起始物(Nemerson，Y.(1995)Thromb.Haemost.74(1)180-184)。在正常的生理?xiàng)l件下，活性TF不和血液接觸。在血管受損期間，暴露于血液的內(nèi)皮下TF和膠原導(dǎo)致凝血因子和血小板的活化并隨后形成止血栓子。在多種臨床情況中，對(duì)TF表達(dá)的不正確的誘導(dǎo)將造成威脅生命的血栓形成和/或引起病理性并發(fā)癥。相信斑塊(plaque)破裂后的TF暴露是造成引起急性心肌梗死和卒中的血栓性阻塞的原因。在這些情況中，凝血因子所激活的促炎癥信號(hào)途徑也引起水腫形成以及增加梗死面積。與血管成形術(shù)相關(guān)的血管損傷造成了SMC上TF的上調(diào)，相信這誘導(dǎo)了與再狹窄所相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)途徑。在癌癥和革蘭氏陰性細(xì)菌膿毒癥中TF的過(guò)表達(dá)造成了威脅生命的血栓形成以及炎癥途徑的激活。
因子VIIa(“FVIIa”)/TF復(fù)合物涉及多種血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制，TF的循環(huán)水平是某些患者的危險(xiǎn)因素。FVIIa和TF在血管損傷中保持止血以及觸發(fā)血栓形成上發(fā)揮著獨(dú)特的作用。TF正常地表達(dá)于外膜，但在血管疾病中TF于中膜和新生內(nèi)膜被上調(diào)并被不適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)。TF在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)增加，并且被一薄層纖維帽(fibrouscap)將其與血液分隔，該纖維帽可以破裂并暴露TF。例如球囊血管成形術(shù)、支架植入或動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)的外科手術(shù)破壞血管壁并暴露出其下的TF。在動(dòng)脈粥樣硬化的、富脂的、薄壁的斑塊中，自發(fā)性破裂或內(nèi)皮侵蝕造成TF的暴露和血栓形成，引起不穩(wěn)定的絞痛和心肌梗死。TF可以在細(xì)胞來(lái)源的微粒中循環(huán)，在不穩(wěn)定絞痛中循環(huán)TF的水平是增高的，說(shuō)明這種循環(huán)TF可以引起血栓形成(Soejima，H.et al.(1999)Circulation 99(22)2908-2913)。癌癥通常與高凝狀態(tài)相關(guān)，這是因?yàn)門(mén)F在腫瘤細(xì)胞上的過(guò)表達(dá)。這使得患者容易發(fā)生深靜脈血栓形成，肺栓塞和低度彌漫性血管內(nèi)凝血(“DIC”)。DIC造成了引起多器官衰竭的微血管內(nèi)纖維素的沉積。來(lái)自血栓形成的急性動(dòng)脈損傷模型的結(jié)果表明基于蛋白質(zhì)的FVIIa/TF抑制劑，如活性位點(diǎn)抑制因子VIIa(“FVIIai”)以及組織因子途徑抑制物(“TFPI”)是有效的抗凝劑，而且與凝血酶和因子X(jué)a(“FXa”)抑制物比較，它的出血更少。另外，F(xiàn)VIIa/TF抑制在預(yù)防球囊損傷后的新生內(nèi)膜增厚以及血管狹窄上優(yōu)于其它的抗凝劑(例如肝素，F(xiàn)Xa抑制物)。
血栓調(diào)節(jié)蛋白(“TM”)是一種跨膜糖蛋白，它具有抗凝性質(zhì)并且主要表達(dá)于血管的內(nèi)皮細(xì)胞的管腔面(lumenal surface)(Esmon，N.L.et al.(1982)J.Biol.Chem.257(2)859-864；Salem，H.H.et al.(1983)J.Biol.Chem.259(19)12246-12251)。成熟的全長(zhǎng)TM是一種557個(gè)氨基酸殘基的調(diào)節(jié)蛋白，它由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成一個(gè)N末端疏水性區(qū)域(殘基1-226)；一個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域(殘基226-462)；一個(gè)O-糖基化的富含絲氨酸/蘇氨酸區(qū)域(殘基463-497)；一個(gè)疏水的跨膜區(qū)域(殘基498-521)；以及一個(gè)C末端的胞質(zhì)尾區(qū)(殘基522-557)。
富含半胱氨酸區(qū)域包括6個(gè)與表皮生長(zhǎng)因子(“EGF”)前體同源的被稱(chēng)為EGF樣、EGF同源或EGF結(jié)構(gòu)域的重復(fù)結(jié)構(gòu)。富含半胱氨酸區(qū)域可以被進(jìn)一步地分成3個(gè)結(jié)構(gòu)域EGF樣重復(fù)1，2和3(“EGF123”，殘基226-344)，EGF3和EGF4之間的域間環(huán)(interdomain loop)(殘基345-349)以及EGF樣結(jié)構(gòu)域4，5和6(“EGF456”，殘基350-462)。EGF456的功能是介導(dǎo)凝血酶結(jié)合以及蛋白C的活化。一個(gè)研究已經(jīng)表明第5和第6個(gè)EGF樣重復(fù)(分別為“EGF5”，殘基390-407以及“EGF6”，殘基427-462)具有結(jié)合凝血酶的能力(Kurosawa，S.et al.(1988)J.Biol.Chem.263(13)5993-5996)；另一個(gè)研究說(shuō)明EGF456結(jié)構(gòu)域能有效地作為凝血酶介導(dǎo)的蛋白C活化活性的輔因子(Zushi，M.et al.(1989)J.Biol.Chem.264(18)10351-10353)。富含Ser/Thr結(jié)構(gòu)域增強(qiáng)了EGF456介導(dǎo)的凝血酶的結(jié)合。第三個(gè)EGF樣重復(fù)(“EGF3”，殘基311-344)對(duì)于凝血酶激活的纖維蛋白溶解抑制物(“TAFI”)的活化是必需的。已經(jīng)描述了一些EGF3的點(diǎn)突變影響了TAFI的激活(Wang，W.et al.(2000)J.Biol.Chem.275(30)22942-22947)。凝血酶/TM復(fù)合物將蛋白C轉(zhuǎn)化成活化蛋白C(“APC”)，其依次降解因子Va和VIIIa，從而阻止進(jìn)一步生成凝血酶。因此，TM作為一種將凝血酶從前凝血?jiǎng)?procoagulant)轉(zhuǎn)化為抗凝劑的分子開(kāi)關(guān)。
當(dāng)TM定位于膜表面時(shí)，蛋白C對(duì)凝血酶/TM復(fù)合物的Km減少10倍(Esmon，C.T.(1995)FASEB J.9(10)946-955)。血液中的蛋白C的濃度(0.065μM)顯著地低于所報(bào)道的對(duì)可溶性TM/凝血酶復(fù)合物的Km(5μM)，因此證實(shí)促凝膜表面的TM將造成蛋白C生成速率的顯著的局部增強(qiáng)。
TM通過(guò)不同于肝素或其衍生物的機(jī)制抑制血栓形成。肝素是一種抗凝血酶III的輔因子并通過(guò)抗凝血酶III依賴(lài)性機(jī)制抑制FXa和凝血酶。血栓部位的凝血酶(thrombus-bound thrombin)不受抗凝血酶III的影響，這限制了肝素或低分子量肝素(“LMWH”)對(duì)已存在的血凝塊的抗血栓作用。這解釋了在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的研究中肝素或LMWH抑制血凝塊部位的凝血酶或凝血酶原酶所觸發(fā)的血栓生長(zhǎng)的失敗。相反，重組TM以劑量依賴(lài)性方式減少了血凝塊誘導(dǎo)的凝血酶的生成以及纖維蛋白的形成(Mohri，M.et al.(1998)Thromb.Haemost.80(6)925-929)?？沟鞍證抗體消除了TM的抑制作用。抑制血凝塊部位的促凝活性是臨床相關(guān)的，因?yàn)檠龎K部位的促凝活性造成更快速的血栓生長(zhǎng)并最后造成血管阻塞或血栓栓塞并發(fā)癥。血栓生長(zhǎng)的抑制使得內(nèi)源性纖溶系統(tǒng)可以更快速更完全地清除血凝塊。另外，在例如DIC的血漿抗凝血酶被耗竭的病理狀態(tài)中，也預(yù)計(jì)TM比肝素更為有效。雖然TM和肝素在試驗(yàn)性DIC中都抑制了血小板和纖維蛋白原的消耗，但當(dāng)抗凝血酶III水平被耗竭時(shí)，只有TM是有效的。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了作為抗凝劑的新的融合蛋白，它包含一種與組織因子(“TF”)或與因子VIIa/組織因子(“FVIIa/TF”)復(fù)合物相互作用的靶向蛋白，其可操縱地連接到單獨(dú)的或組合有至少一種其它的TM結(jié)構(gòu)域的血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)EGF456結(jié)構(gòu)域上，其它的TM結(jié)構(gòu)域選自由N末端疏水性區(qū)域結(jié)構(gòu)域、EGF123結(jié)構(gòu)域、EGF3和EGF4之間的域間環(huán)、O-糖基化的富含絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，或其類(lèi)似物、片段、衍生物或變體組成的組中。
本發(fā)明的抗凝血融合蛋白在損傷部位靶向并結(jié)合TF或FVIIa/TF復(fù)合物，將TM定位于損傷部位，并因此防止血栓形成，以及比較于可溶性的抗TF抗體或可溶性TM或TM片段，它是一種更為有效的抗凝劑。融合蛋白在治療包括但不限于膿毒癥、彌漫性血管內(nèi)凝血、缺血性卒中、深靜脈血栓形成、急性冠脈綜合征、血管成形術(shù)后的血栓并發(fā)癥以及進(jìn)行性癌癥的凝血病的某些疾病時(shí)比低分子量肝素(“LMWH”)更為有效。另外，融合蛋白也可應(yīng)用于微血管手術(shù)、皮膚和靜脈移植以及器官移植。
另一方面，本發(fā)明提供了包括目標(biāo)融合蛋白的藥用組合物。
另一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防患者血栓形成的方法，包括施與上述患者治療有效量的融合蛋白，從而抑制了凝血酶的形成而不直接影響其它的凝血參數(shù)，例如血小板的活化和聚集。
另一方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防及治療患者的深靜脈血栓形成(“DVT”)或彌漫性血管內(nèi)凝血(“DIC”)或急性冠脈綜合征或具有凝血病的癌癥的方法，包括施與所述患者治療有效量的融合蛋白。
另一方面，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)患者的炎癥反應(yīng)的方法，包括施與所述患者治療有效量的融合蛋白。
仍在另一方面，可用本發(fā)明的融合蛋白在與血液接觸的醫(yī)學(xué)器械表面形成一層非成血栓性包膜。
另一方面，本發(fā)明涉及一種包含融合蛋白的試劑盒，該融合蛋白包含與TF或FVIIA/TF復(fù)合物結(jié)合的靶向蛋白，以及TM結(jié)構(gòu)域?；蛘?，所述試劑盒可包含編碼融合蛋白成分的DNA序列。
本發(fā)明也闡述了制備本發(fā)明融合蛋白的方法，重組和合成方法。


圖1.scFv(TF)3e10與sTF的結(jié)合增加了sTF對(duì)FVIIa的表觀親和力(apparent affinity)。在有和無(wú)800nM scFv(TF)3e10時(shí)，利用2nMFVIIa如實(shí)施例5“sTF/FVIIa活化檢測(cè)”所述進(jìn)行sTF/FVIIa活化檢測(cè)。將sTF滴定到測(cè)定物中并測(cè)定出顯色底物(S-2266)的裂解速率。用標(biāo)準(zhǔn)的4-parameter fit計(jì)算出sTF的表觀KD。
圖2.scFv(TF)3e10對(duì)sTF的結(jié)合親和力的測(cè)定。sTF/FVIIa檢測(cè)如實(shí)施例5“sTF/FVIIa活化檢測(cè)”所述利用3nM sTF和2nM FVIIa進(jìn)行。所用的sTF濃度低于與FVIIa結(jié)合的KD。與scFv(TF)3e10抗體的結(jié)合降低了sTF與FVIIa結(jié)合的KD，導(dǎo)致sTF/FVIIa復(fù)合物生成的增加，并因此加快了顯色底物S2266的裂解速率。以逐漸增加的濃度加入scFv(TF)3e10并利用標(biāo)準(zhǔn)的4-parameter fit用增加的反應(yīng)速度確定抗體對(duì)sTF的表觀KD值。
圖3.微量量熱法分析顯示scFv(TF)3e10對(duì)sTF/FVIIa復(fù)合物的親和力比對(duì)單獨(dú)sTF的親和力高出20倍。利用MicroCal VP-ITC設(shè)備進(jìn)行等溫滴定量熱法。通過(guò)將超過(guò)2.3倍摩爾量的FVIIai添加到sTF形成sTF/FVIIa復(fù)合物。用尺寸排阻層析確認(rèn)sTF被完全結(jié)合。對(duì)于抗體對(duì)復(fù)合物的親和力的確定，將1.2μM sTF/FVIIa復(fù)合物加入到微量量熱器孔中并將65μM scFv(TF)3e10抗體加入到注射器中。對(duì)于抗體對(duì)單獨(dú)sTF的親和力的確定，將10μM sTF加入到孔內(nèi)并將141μMscFv(TF)3e10加入到注射器中。用MicroCal Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)適合于單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
圖4.scFv(TF)3e10劑量依賴(lài)性地抑制FX活化檢測(cè)。在實(shí)施例5“因子X(jué)活化檢測(cè)”中描述了該檢測(cè)的細(xì)節(jié)。IC50代表達(dá)到50％最大抑制所需的劑量。
圖5.融合蛋白比TF抗體或單獨(dú)TMi456能更有效地抑制凝血。進(jìn)行凝血酶原時(shí)間(PT)檢測(cè)以比較融合蛋白與TF抗體或單獨(dú)的TMi456。將適當(dāng)體積的濃縮的抑制物或TF抗體(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)加入到100μl重組人組織凝血酶原激酶(Ortho Recombiplastin)中。約2分鐘后，加入100μl重構(gòu)人血漿。在Haemoliance測(cè)凝計(jì)上確定凝血時(shí)間。生成每種抑制物的劑量效應(yīng)曲線(xiàn)以及用回歸分析計(jì)算出延長(zhǎng)凝血時(shí)間2倍所需的濃度(nM)。
圖6.融合蛋白保留有全部的對(duì)蛋白C活化的輔因子活性。在實(shí)施例5“蛋白C活化檢測(cè)(顯色法)”中所描述的檢測(cè)含有20μl TM標(biāo)品，或含有EGF結(jié)構(gòu)域4-6及EGF3和EGF4之間的域間環(huán)的TMi456，或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)，20μl 1.5μM蛋白C以及20μl 3nM α凝血酶?；罨M(jìn)行1小時(shí)。通過(guò)加入20μl 0.16u/ml蛭素終止活化相。然后加入100μl lmM S2266并每10秒鐘測(cè)定A405共30分鐘。反應(yīng)速率依賴(lài)于生成的活化蛋白C的量。數(shù)據(jù)用mOD/min表示。
圖7.在含TF的磷脂表面提高了融合蛋白活化蛋白C的速率。加入TF小泡(vesicle)不影響TMi456活化蛋白C的速率。在實(shí)施例5“蛋白C活化檢測(cè)(在富含TF表面)”中所描述的檢測(cè)含有20μlTM標(biāo)品，或TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)，20μl的1.5μM蛋白C，20μl的3nMα凝血酶以及20μl的緩沖液或TF小泡(Innovin，人重組TF，4x用于PT的正常濃度)。活化進(jìn)行1小時(shí)。通過(guò)加入20μl 0.16u/ml蛭素終止活化相。然后加入100μl 1mM S2266并每10秒鐘測(cè)定A405共30分鐘。反應(yīng)速率依賴(lài)于所生成的活化蛋白C的量。數(shù)據(jù)用mOD/min表示。
圖8融合蛋白顯示出比TMi456更高的對(duì)TF誘導(dǎo)的凝血的特異性?；罨牟糠纸M織促凝血酶原活酶時(shí)間(APTT)檢測(cè)對(duì)內(nèi)源性和凝血中心途徑的抑制物是敏感的。在該檢測(cè)中所發(fā)生的凝血與TF無(wú)關(guān)。將抑制劑，TF抗體(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)稀釋到50μl重構(gòu)的人血漿中，其終濃度使得PT檢測(cè)延長(zhǎng)了2倍。然后往測(cè)凝計(jì)加入50μl APTT(Alexin HS)試劑和50μl CaCl2試劑(0.02mol/L)，并按秒測(cè)定凝血時(shí)間。
圖9.融合蛋白比它的任何一種單獨(dú)成分更有效地抑制TF誘導(dǎo)的全血凝血。利用Haemoscope Thromboelastogragh(TEG)分析儀分析全血凝血。將120nM TF抗體(scFv(TF)3e10)、TMi456或融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)與10μl組織促凝血酶原激酶試劑(1∶64稀釋)及20μl 0.2M CaCl2一起加入到檸檬酸化的全血中。得到每個(gè)標(biāo)本的R值(到開(kāi)始形成纖維蛋白的時(shí)間)。然后將該值轉(zhuǎn)化為未抑制的對(duì)照R值的a％。
圖10.融合蛋白在全血凝血檢測(cè)(TEG)上示出比LMWH更多的預(yù)期的劑量效應(yīng)。將逐漸增加濃度(從15nM開(kāi)始并以2x增量增加)的融合蛋白(scFv(TF)3e10-TMi456)或逐漸增加濃度(從0.15u/ml開(kāi)始并以2x增量增加)的依諾肝素(LMWH)與10μl組織促凝血酶原激酶試劑(1∶64稀釋)及20μl 0.2M CaCl2一起加入到檸檬酸化的全血中。得到每個(gè)標(biāo)本的R值(到開(kāi)始形成纖維蛋白的時(shí)間)并繪制出對(duì)相對(duì)濃度的曲線(xiàn)(將每個(gè)標(biāo)品的最低濃度設(shè)定為1(相似R值)，然后以2x增加之后的濃度)。
圖11.融合蛋白scFV(TF)3e10-TMi456在彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的體內(nèi)模型中是有效的。在實(shí)施例8所述的大鼠血栓栓塞模型中評(píng)價(jià)了TF抗體(scFV(TF)3e10)和融合蛋白(scFV(TF)3e10-TMi456)的(A)死亡百分比和(B)發(fā)病率-死亡率分?jǐn)?shù)。(A)在載體(vehicle)治療組，所用的TF劑量造成了60％死亡率(LD60)。0.7nmol/kg的scFv(TF)3e10-TMi456完全預(yù)防了死亡。相反，0.7nmol/kg的scFv(TF)3e10對(duì)死亡沒(méi)有影響。scFv(TF)3e10-TMi456比10倍更高劑量的scFv(TF)3e10更為有效。(B)在載體治療組，體內(nèi)劑量的TF造成了2.6的平均發(fā)病率-死亡率分?jǐn)?shù)，評(píng)分根據(jù)下面的評(píng)分系統(tǒng)0＝不受影響；1＝輕微呼吸窘迫(在30min內(nèi)恢復(fù))；2＝嚴(yán)重呼吸窘迫(垂死的，恢復(fù)需要超過(guò)60min)；以及3＝死亡。scFv(TF)3e10-TMi456劑量依賴(lài)性地預(yù)防了TF誘導(dǎo)的死亡和呼吸窘迫，其ED50值為0.46nmol/kg(0.019mg/kg)。scFv(TF)3e10-TMi456在7.0nmol/kg完全預(yù)防了死亡和呼吸窘迫，并在0.7nmol/kg完全預(yù)防了死亡而且顯著地減少了呼吸窘迫。相反，scFv(TF)3e10在0.7nmol/kg對(duì)死亡沒(méi)有影響以及對(duì)呼吸窘迫只有很弱或沒(méi)有作用。scFv(TF)3e10-TMi456比10倍更高劑量的scFv(TF)3e10更為有效。
發(fā)明詳述本發(fā)明的抗凝血融合蛋白由一種與組織因子(“TF”)或與因子VIIa/組織因子(“FVIIa/TF”)復(fù)合物相互作用的靶向蛋白構(gòu)成，該靶向蛋白被可操縱地連接到單獨(dú)的或組合有至少一種其它的TM結(jié)構(gòu)域的血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)EGF456結(jié)構(gòu)域上，其它的TM結(jié)構(gòu)域選自由N末端疏水性區(qū)域結(jié)構(gòu)域、EGF123結(jié)構(gòu)域、EGF3和EGF4之間的域間環(huán)、O-糖基化的富含絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，或其類(lèi)似物、片段、衍生物或變體組成的組中。
定義在描述本發(fā)明時(shí)，按如下所示定義下面的術(shù)語(yǔ)。
“重組蛋白質(zhì)或多肽”指通過(guò)重組DNA技術(shù)生成的蛋白質(zhì)或多肽，即被編碼所需多肽的外源性DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化的微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞所生成。在大多數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)物中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽沒(méi)有多糖。在酵母菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽可能有著不同于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的糖基化形式。
“天然”蛋白質(zhì)或多肽指從天然存在來(lái)源中回收的蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語(yǔ)“天然TM”包括天然存在的TM及其片段。
DNA“編碼序列”為當(dāng)置于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制下在宿主細(xì)胞中能被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成多肽的DNA序列。編碼序列的范圍由5’N末端的起始密碼子以及3’C末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括原核序列、來(lái)自真核mRNA的cDNA、來(lái)自真核DNA的基因組DNA序列以及合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’端。
“融合蛋白”是至少兩種可操縱連接的異源編碼序列表達(dá)所形成的蛋白。本發(fā)明的融合蛋白包括一種與TF或與FVIIa/TF復(fù)合物相互作用的靶向蛋白，該靶向蛋白可操縱地連接到單獨(dú)的或組合有至少一種其它的TM結(jié)構(gòu)域的血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)EGF456結(jié)構(gòu)域上，其它的TM結(jié)構(gòu)域選自由N末端疏水性區(qū)域結(jié)構(gòu)域、EGF123結(jié)構(gòu)域、EGF3和EGF4之間的域間環(huán)、O-糖基化的富含絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，或其類(lèi)似物、片段、衍生物或變體組成的組中。
“靶向蛋白”是與另一種蛋白或蛋白復(fù)合物結(jié)合或相互作用的蛋白。本發(fā)明的靶向蛋白是與TF或FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合或相互作用的蛋白。例如，抗TF或抗FVIIa/TF復(fù)合物抗體是本發(fā)明的靶向蛋白。靶向蛋白的兩個(gè)其它的例子是能與TF結(jié)合生成非活化的FVIIai/TF復(fù)合物的活性位點(diǎn)抑制因子VIIa(“FVIIai”)，以及能結(jié)合并失活FVIIa/TF復(fù)合物的組織因子途徑抑制物(“TFPI”)。
“核苷酸序列”是脫氧核糖核苷酸(堿基腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的雜聚物。用來(lái)自合成cDNA的DNA片段以及短寡核苷酸接頭可以裝配成編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA序列，并提供一個(gè)能在重組表達(dá)載體中表達(dá)的合成基因。在討論特殊的雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時(shí)，根據(jù)只給定cDNA的非轉(zhuǎn)錄鏈的5’到3’方向的序列的正常慣例來(lái)描述序列。
“重組表達(dá)載體”是用于擴(kuò)增或表達(dá)編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA的可復(fù)制的DNA構(gòu)建體。一個(gè)表達(dá)載體含有DNA控制序列和編碼序列。DNA控制序列包括啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域以及增強(qiáng)子。在此所定義的重組表達(dá)系統(tǒng)將在調(diào)節(jié)元件的誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白。
“轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”指已經(jīng)被外源DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。外源DNA可以是或可以不是整合到(共價(jià)連接于)構(gòu)成細(xì)胞基因組的染色體DNA中。例如，在原核細(xì)胞和酵母中，外源DNA可以保存于例如質(zhì)粒的附加體元件(episomal element)中，或穩(wěn)定地整合到染色體DNA中。對(duì)于真核細(xì)胞，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是外源DNA已經(jīng)整合到染色體復(fù)制體的細(xì)胞。通過(guò)真核細(xì)胞株或克隆生成含有外源DNA的子代細(xì)胞群的能力來(lái)驗(yàn)證這種穩(wěn)定性。
“血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)”指一種內(nèi)皮細(xì)胞表面糖蛋白，它與凝血酶形成高度親和的復(fù)合物。已經(jīng)分離并測(cè)序來(lái)自牛和人的編碼天然TM的基因(它的基因組形式和cDNA形式)(Jackman，R.W.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(23)8834-8838和Jackman，R.W.et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(18)6425-6429，兩者在此一同并入?yún)⒖?。牛、人和小鼠TM序列彼此之間表現(xiàn)出高度同源性。人TM的cDNA編碼一個(gè)575個(gè)氨基酸的60.3kDa的蛋白質(zhì)，包括約18個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,827,824。
當(dāng)凝血酶與TM結(jié)合時(shí)，蛋白C的活化速度可以有1000倍或更多的提高，它形成了抗凝酶活化蛋白C。另外，當(dāng)凝血酶與TM結(jié)合時(shí)，凝血酶不再作用為促凝酶。特別的，在存在TM時(shí)，凝血酶催化的纖維蛋白形成、因子V活化以及血小板活化都被抑制。因此，TM將凝血酶轉(zhuǎn)化成一種生理性抗凝劑。
“血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)結(jié)構(gòu)域”指與TM的特殊功能或特性相關(guān)的不連續(xù)的氨基酸序列，如特征性的三級(jí)結(jié)構(gòu)單位。全長(zhǎng)TM基因編碼含有下面結(jié)構(gòu)域的前體或多肽原(pro-polypeptide)氨基酸-18--1為信號(hào)序列；氨基酸1-226是N末端疏水性區(qū)域；氨基酸227-462是富含半胱氨酸區(qū)域；由6個(gè)被小的域間肽或環(huán)所連接的串聯(lián)EGF樣重復(fù)組成；氨基酸463-497是O-糖基化的富含絲氨酸/蘇氨酸區(qū)域；氨基酸498-521為疏水跨膜區(qū)域；以及氨基酸522-557是C末端胞質(zhì)尾區(qū)。富含半胱氨酸區(qū)域可以被進(jìn)一步地分成3個(gè)結(jié)構(gòu)域氨基酸226-344是EGF123，由EGF樣重復(fù)1，2和3(殘基226-344)組成；氨基酸345-349是EGF3和EGF4之間的域間環(huán)；以及氨基酸350-462是EGF456，由EGF樣結(jié)構(gòu)域4，5和6組成。見(jiàn)例如Yost，C.S.et al.(1983)Cell 34(3)759-766；Wen，D.Z.et al.(1987)Biochemistry 26(14)4350-4357；和Wang，W.et al.(2000)，supra，在此將這些全部一起并入?yún)⒖肌?br> 當(dāng)指本發(fā)明融合蛋白時(shí)，術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”、“片段”、“衍生物”和“變體”以及靶向蛋白及TM結(jié)構(gòu)域指基本上保留有相同的生物學(xué)功能或活性的融合蛋白、靶向蛋白和TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物和變體，如下面進(jìn)一步描述。
“類(lèi)似物”包括其內(nèi)包含有本發(fā)明融合蛋白的氨基酸序列的多肽原。通過(guò)天然的體內(nèi)加工或通過(guò)如酶或化學(xué)裂解的本領(lǐng)域熟知的方法可以將本發(fā)明的活性融合蛋白從構(gòu)成前融合蛋白分子(pro-fusionprotein molecule)的其它氨基酸裂解開(kāi)來(lái)。例如，天然TM被天然表達(dá)為575個(gè)氨基酸的多肽原，然后在體內(nèi)被加工釋放出557個(gè)氨基酸的活性成熟多肽。
“片段”為基本上保留了相似的功能活性的融合蛋白、靶向蛋白或TM結(jié)構(gòu)域的一部分，如下面進(jìn)一步描述的在此闡述的體外檢測(cè)法所顯示的。
“衍生物”包括對(duì)融合蛋白的所有修飾物，其基本上保留了在此所闡述的功能并包括其它的結(jié)構(gòu)和附加功能，例如，PEG化的融合蛋白具有更長(zhǎng)的半衰期，通過(guò)添加硫酸軟骨素修飾的O-糖基化融合蛋白，以及生物素化的融合蛋白，如下進(jìn)一步描述的。
當(dāng)用相同的方法或檢測(cè)法確定每個(gè)多肽的生物學(xué)活性時(shí)，“基本上相似的功能活性”以及“基本上相同的生物學(xué)功能或活性”指生物學(xué)活性度是被比較的多肽所表現(xiàn)出的生物學(xué)活性的約30％到100％或更多。例如，當(dāng)用實(shí)施例5中所描述的蛋白C活化檢測(cè)法(顯色法)測(cè)定時(shí)，具有與實(shí)施例2(SEQ ID NO2)的融合蛋白基本上相似的功能活性的融合蛋白或TM結(jié)構(gòu)域是表現(xiàn)出聚集活化蛋白C的融合蛋白或TM結(jié)構(gòu)域。當(dāng)用實(shí)施例5所描述的sTF/FVIIa檢測(cè)或FX活化檢測(cè)法測(cè)定時(shí)，具有與實(shí)施例1的抗TF抗體(SEQ ID NO1)基本上相似的功能活性的靶向蛋白是表現(xiàn)出結(jié)合或中和TF或VFIIa/TF復(fù)合物的能力的靶向蛋白。
通過(guò)比較一個(gè)多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代和第二個(gè)多肽的序列來(lái)確定兩個(gè)多肽之間的“相似性”。這些保守取代包括在The Atlas of Protein Sequence and Structure 5 by Dayhoff(1978)和Argos(1989)EMBO J.8779-785中所述的那些取代。例如，屬于下面組之一的氨基酸表示著保守變化-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；-Cys、Ser、Tyr、Thr；-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；
-Lys、Arg、His；-Phe、Tyr、Trp、His；及-Asp、Glu。
在此所用的所有的其它技術(shù)術(shù)語(yǔ)和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所使用的術(shù)語(yǔ)具有相同的含義。
靶向蛋白本發(fā)明的靶向蛋白是與特定的預(yù)先選定的例如TF或FVIIa/TF復(fù)合物的靶分子具有特異結(jié)合的能力的蛋白質(zhì)，然后為將融合蛋白定向到具有預(yù)先選定的靶分子的細(xì)胞或組織中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，靶向蛋白是能結(jié)合并中和TF或FVIIa/TF復(fù)合物的抗體。“抗體”在此包括完整的免疫球蛋白(“Ig”)分子及其片段，如Fab、F(ab’)2和Fv，其能結(jié)合TF或FVIIa/TF復(fù)合物的表位。形成一個(gè)表位通常需要至少6、8、10或12個(gè)連續(xù)氨基酸。然而，含有非連續(xù)氨基酸的表位可能需要更多的，例如至少15、25或50個(gè)氨基酸。
典型地，在免疫化學(xué)檢測(cè)法中，特異結(jié)合TF或FVIIa/TF復(fù)合物的抗體所提供的檢測(cè)信號(hào)比其它蛋白所提供的檢測(cè)信號(hào)至少高5、10或20倍。優(yōu)選地，與TF或FVIIa/TF復(fù)合物特異結(jié)合的抗體在免疫化學(xué)檢測(cè)中不能檢測(cè)其它蛋白質(zhì)，并可以從溶液中免疫沉淀出TF或FVIIa/TF復(fù)合物。
可以用TF或FVIIa/TF復(fù)合物免疫哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人，以生成多克隆抗體。如果需要，可以將TF或FVIIa/TF復(fù)合物綴合到載體蛋白上，如牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白以及匙孔血藍(lán)蛋白。根據(jù)宿主的物種，可以用不同的佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)。這些佐劑包括但不限于Freund佐劑、無(wú)機(jī)膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、多肽、油乳劑、匙孔嘁血藍(lán)蛋白和二硝基酚)。在應(yīng)用于人的佐劑中，BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Cornybacterium parvum)是特別有用的。
利用任何能通過(guò)培養(yǎng)連續(xù)的細(xì)胞株進(jìn)行抗體分子生產(chǎn)的技術(shù)可以制備與TF或FVIIa/TF復(fù)合物特異性結(jié)合的單克隆抗體。這些技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以及EBV雜交瘤技術(shù)(Kohler et al.(1985)Nature 256495-497；Kozbor et al.(1985)J.Immunol.Methods 8131-42；Cote et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030；和Cote et al.(1984)Mol.Cell Biol.62109-120)。
此外，可以使用生成“嵌合抗體”所發(fā)展的技術(shù)，將小鼠抗體基因剪接到人抗體基因中以獲得具有適宜的抗原特異性和生物學(xué)活性的分子(Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855；Neuberger et al.(1984)Nature 312604-608；Takeda et al.(1985)Nature 314452-454)。單克隆和其它抗體也可以被“人源化”以阻止患者在治療性應(yīng)用抗體時(shí)觸發(fā)針對(duì)該抗體的免疫反應(yīng)。這些抗體與直接應(yīng)用在融合蛋白中的人抗體在序列上是相當(dāng)相似的或可能需要變更一些關(guān)鍵的殘基。通過(guò)用單個(gè)殘基的定點(diǎn)誘變?nèi)〈煌谌诵蛄械臍埢蛲ㄟ^(guò)移植完整的互補(bǔ)決定區(qū)可以將嚙齒動(dòng)物抗體和人序列之間的序列差異最小化。或者，利用如GB2188638B所闡述的重組方法可以生成人源化抗體。與TF或FVIIa/TF復(fù)合物特異性結(jié)合的抗體可以含有部分或完全人源化的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如在美國(guó)專(zhuān)利5,565,332中所闡述的。
或者，利用本領(lǐng)域已知的方法可以采用所述的用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)生產(chǎn)與TF或FVIIa/TF復(fù)合物特異性結(jié)合的單鏈抗體。通過(guò)從隨機(jī)組合Ig文庫(kù)的鏈替換(chain shuffling)可以生成具有相關(guān)特異性但不同的獨(dú)特型組成的抗體(Burton(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8811120-11123)。
利用如PCR的DNA擴(kuò)增方法用雜交瘤cDNA作為模板也可以構(gòu)建單鏈抗體(Thirion et al.(1996)Eur.J.Cancer Prev.5507-511)。單鏈抗體可以是單或雙特異的，以及可以是二價(jià)或四價(jià)的。例如，在Coloma and Morrison(1997)Natl.Biotechnol.15159-163中教導(dǎo)了四價(jià)、雙特異性單鏈抗體的構(gòu)建。在Mallendar and Voss(1994)J.Biol.Chem.269199-216中教導(dǎo)了二價(jià)、雙特異性單鏈抗體的構(gòu)建。
利用人工的或自動(dòng)的核苷酸合成可以構(gòu)建編碼單鏈抗體的核苷酸序列，利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法可以將其克隆進(jìn)表達(dá)構(gòu)建體中，并將其導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼序列。或者，用例如絲狀噬菌體展示技術(shù)可以直接生成單鏈抗體(Verhaar et al.(1995)Int.J.Cancer 61497-501；和Nicholls et al.(1993)J.Immunol.Meth.16581-91)。
如文獻(xiàn)中所闡述的，通過(guò)誘導(dǎo)體內(nèi)生產(chǎn)淋巴細(xì)胞群或篩選Ig庫(kù)或高度特異的結(jié)合試劑組(panel)也可以生成與TF或FVIIa/TF復(fù)合物特異性結(jié)合的抗體(Orlandi et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833-3837；Winter et al.(1991)Nature 349293-299)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向蛋白是一個(gè)能結(jié)合并中和TF的靶向部分(targeting moiety)而不是抗體。兩個(gè)這樣的實(shí)例是活性位點(diǎn)抑制因子FVIIa(FVIIai)和組織因子途徑抑制物(TFPI)。
FVIIa和FVIIai都和TF形成高度親和的復(fù)合物(Sorenson，B.B.and Rao，L.V.(1998)Blood Coagul.Fibrinolysis 9(Suppl 1)S67-71)。FVIIai是一種中和TF的抗凝劑，它通過(guò)與內(nèi)源性FVIIa競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合暴露的TF而發(fā)揮作用。FVIIai抑制了蛋白裂解活化的FVIIa形成活性FVIIa-TF復(fù)合物的能力并以這種方式抑制了凝血的啟動(dòng)。通過(guò)將TM結(jié)構(gòu)域遺傳學(xué)地融合到FVIIai，TM可以被靶向到富含TF的促血栓形成(prothrombotic)表面。
已經(jīng)分離并測(cè)序了編碼人FVII的cDNA(Hagen，H.S.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(8)2412-2416，在此一同并入?yún)⒖?。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)可以從分離于人肝臟的mRNA開(kāi)始制備出入FVII cDNA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)突變活性位點(diǎn)絲氨酸或通過(guò)用肽基氯甲基酮(peptidyl chloromethylketon)化學(xué)處理催化活性的FVIIa可以制備FVIIai，這是不可逆的修飾并抑制了活性位點(diǎn)。
TFPI以FXa依賴(lài)性方式靶向并抑制FVIIa/TF復(fù)合物(Salemink，I.et al.(1999)J.Biol.Chem.274(40)28225-28232)。TFPI首先與FXa結(jié)合，然后TFPI-FXa復(fù)合物結(jié)合并抑制FVIIa/TF復(fù)合物。通過(guò)將TM結(jié)構(gòu)域遺傳學(xué)地融合到TFPI中，TM將被靶向到富含TF的促血栓形成的表面。
已經(jīng)分離并測(cè)序了編碼人TFPI的cDNA(Wun，T.C.et al.(1988)J.Biol.Chem.263(13)6001-6004，在此一同并入?yún)⒖?。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)可以從分離于人肝臟的mRNA開(kāi)始制備出人TFPIcDNA。
利用本領(lǐng)域熟知的方法可以表達(dá)并純化本發(fā)明的靶向蛋白(即抗體或其它相關(guān)蛋白質(zhì))。例如，利用流經(jīng)結(jié)合有TF的柱可以親和純化抗體及蛋白質(zhì)。然后用具有高鹽濃度的緩沖液可以將所結(jié)合的抗體或蛋白質(zhì)從柱上洗脫下來(lái)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶向蛋白是結(jié)合TF的scFv抗體，它抑制了FVIIa/TF復(fù)合物對(duì)FX的激活且不與FVIIa競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。為了生成結(jié)合TF的scFv抗體，從展示于絲狀噬菌體的人抗體文庫(kù)HuPhaBL3選擇固定化的可溶性TF。將來(lái)自結(jié)合TF的噬菌體的抗體在大腸桿菌(E.coli)中過(guò)度表達(dá)并用e-tag柱親和純化。用BIAcore，一種sTF依賴(lài)的因子VIIa檢測(cè)法(sTF/FVIIa檢測(cè)法)、FX活化檢測(cè)法和PT檢測(cè)法進(jìn)一步特征化所純化的抗體。在實(shí)施例1中顯示了稱(chēng)為scFv(TF)3e10的結(jié)合TF的scFV抗體的序列并對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1。下面將更詳細(xì)地描述結(jié)合TF的scFv抗體的分離、生產(chǎn)和特性。
血栓調(diào)節(jié)蛋白融合蛋白的TM結(jié)構(gòu)域部分作用為凝血酶催化的蛋白C活化的輔因子，活化蛋白C依次降解因子Va和VIIIa，因此阻止了進(jìn)一步的血栓形成。TM的結(jié)構(gòu)域包括例如N末端疏水性區(qū)域結(jié)構(gòu)域、EGF123、EGF3和EGF4之間的域間環(huán)、EGF456結(jié)構(gòu)域和O-糖基化的富含絲氨酸/蘇氨酸區(qū)域結(jié)構(gòu)域。EGF456結(jié)構(gòu)域特別地介導(dǎo)與凝血酶的結(jié)合以及蛋白C的活化(Kurosawa，S.et al.(1988)，supra；和Zushi，M.et al.(1989)supra)。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白的TM結(jié)構(gòu)域部分包括單獨(dú)的EGF456結(jié)構(gòu)域或組合有一個(gè)或多個(gè)其它的TM結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，EGF456結(jié)構(gòu)域含有使得蛋白質(zhì)更耐受氧化損傷和蛋白酶和/或增加它的催化效率的點(diǎn)突變。
編碼人TM的全長(zhǎng)DNA序列有助于基因的制備并被用為構(gòu)建編碼TM肽和含有TM及TM片段/肽的融合蛋白的DNA序列的起始點(diǎn)。
一些方法可以制備TM的全長(zhǎng)基因。人基因組文庫(kù)是商業(yè)化可獲得的。利用已發(fā)表的基因序列可以合成特異于這些基因的寡核苷酸探針。用寡核苷酸探針篩選基因組文庫(kù)的方法是已知的。TM的基因序列的文章表明在編碼區(qū)域內(nèi)沒(méi)有內(nèi)含子。因此，基因組克隆提供了用已知方法構(gòu)建TM的表達(dá)質(zhì)粒所必需的原材料。
通過(guò)利用已經(jīng)在基因兩側(cè)或內(nèi)部區(qū)域所確定的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)可以找到編碼TM的DNA片段(Jackman，R.W.et al.(1987)，supra)。或者，從cDNA庫(kù)(cDNA bank)中也可以得到全長(zhǎng)基因。例如，從內(nèi)皮細(xì)胞制備得到的信使RNA提供了制備cDNA的適當(dāng)?shù)脑牧稀Ｖ苽鋍DNA庫(kù)的方法是熟知的(見(jiàn)例如Sambrook，J.F.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory(1989)，在此一同并入?yún)⒖?。
融合蛋白本發(fā)明的抗凝血融合蛋白包括一種與TF或FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合的靶向蛋白，并且其被可操縱地連接到單獨(dú)的或組合有至少一種其它的TM結(jié)構(gòu)域的TM EGF456結(jié)構(gòu)域上，其它的TM結(jié)構(gòu)域選自由N末端疏水性區(qū)域結(jié)構(gòu)域、EGF123結(jié)構(gòu)域、EGF3和EGF4之間的域間環(huán)、O-糖基化的富含絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，或其類(lèi)似物、片段、衍生物或變體組成的組中。融合蛋白可以包括與任何組合的TM結(jié)構(gòu)域相連接的靶向蛋白。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白包括與TF結(jié)合的抗體，它被可操縱地連接到TM EGF456結(jié)構(gòu)域以及EGF3和EGF4之間的域間環(huán)(“TMi456”)或其類(lèi)似物、片段、衍生物或變體。
本發(fā)明的融合蛋白包括但不限于單鏈抗體的C末端部分與TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的N末端部分融合的構(gòu)建體、IgG抗體的C末端部分與TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的N末端部分融合的構(gòu)建體、Fab抗體的C末端部分與TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的N末端部分融合的構(gòu)建體、單鏈抗體的N末端部分與TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的C末端部分融合的構(gòu)建體、IgG抗體的N末端部分與TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的C末端部分融合的構(gòu)建體、Fab抗體的N末端部分與TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的C末端部分融合的構(gòu)建體、多于一個(gè)的單鏈抗體與TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的N末端和C末端部分融合的構(gòu)建體、多于一個(gè)的IgG抗體與TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的N末端和C末端部分融合的構(gòu)建體、多于一個(gè)的Fab抗體與TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的N末端和C末端部分融合的構(gòu)建體、多于一個(gè)的TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體與單鏈抗體的N末端和C末端部分融合的構(gòu)建體、多于一個(gè)的TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體與IgG抗體的N末端和C末端部分融合的構(gòu)建體、多于一個(gè)的TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體與Fab抗體的N末端和C末端部分融合的構(gòu)建體、一個(gè)或多于一個(gè)的TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體與嵌合單鏈抗體的N末端和C末端部分融合的構(gòu)建體。
本發(fā)明的融合蛋白包括實(shí)施例2(SEQ ID NO2)和實(shí)施例3(SEQ ID NO3)的融合蛋白，以及那些在序列上與它們有著非本質(zhì)差異的融合蛋白。“非本質(zhì)差異”將包括基本上保持了本發(fā)明多肽的至少一種生物學(xué)功能，優(yōu)選為凝血酶介導(dǎo)的蛋白C活化的輔因子活性的任何序列、取代或缺失變體。這些功能等價(jià)物可以?xún)?yōu)選包括與SEQ IDNO2或3的融合蛋白有至少約90％相同性，以及更優(yōu)選與SEQ IDNO2或3的融合蛋白有至少95％相同性，以及仍更優(yōu)選與SEQ IDNO2或3的融合蛋白有至少97％相同性的融合蛋白，以及還包括這些具有基本上相同的生物學(xué)活性的融合蛋白的部分。然而，本發(fā)明的內(nèi)容包括表現(xiàn)出如在此進(jìn)一步描述的功能等效性的任何在氨基酸序列上具有與SEQ ID NO2和3的融合蛋白非本質(zhì)差異的融合蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包括與TF結(jié)合的被可操縱地連接到TM結(jié)構(gòu)域EGF3的抗體，其對(duì)于激活凝血酶活化的纖維蛋白溶解激動(dòng)劑(TAPI)是必需的。
類(lèi)似物、片段、衍生物和變體本發(fā)明的融合蛋白、靶向蛋白或TM結(jié)構(gòu)域的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體可以是(i)其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被一個(gè)保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)所取代，以及這些取代的氨基酸殘基可以是或可以不是遺傳學(xué)密碼子所編碼的氨基酸；或(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括有一個(gè)取代基團(tuán)；或(iii)其中成熟的融合蛋白與另外一種化合物融合，如一種提高融合蛋白的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸被融合進(jìn)成熟的融合蛋白中，如前導(dǎo)或分泌序列或用于純化成熟融合蛋白的序列；或(v)其中多肽序列與一個(gè)更大的多肽融合，即人白蛋白、抗體或Fc以延長(zhǎng)作用時(shí)間。在此所提及的這些類(lèi)似物、片段、衍生物和變體被認(rèn)為是在在此說(shuō)明的本領(lǐng)域人員的范圍內(nèi)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的衍生物將包含在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定的，優(yōu)選非必需氨基酸殘基上進(jìn)行的保守氨基酸取代?！胺潜匦琛卑被釟埢窃诘鞍踪|(zhì)的野生型序列上可以被改變但不改變生物學(xué)活性的殘基，其中“必需”氨基酸對(duì)于生物學(xué)活性是必需的?！氨Ｊ匕被崛〈笔前被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基所取代。在本領(lǐng)域已經(jīng)識(shí)別了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)、具有非帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。對(duì)保守氨基酸殘基或?qū)τ谠诒Ｊ氐鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸殘基不能進(jìn)行非保守取代，除非進(jìn)行的非保守取代使得所生成的融合蛋白更能耐受氧化損傷以及蛋白酶和/或增強(qiáng)它們的催化效率。片段或生物學(xué)活性部分包括適合用為藥物、研究試劑等等的多肽片段。片段包括含有足夠類(lèi)似于或衍生于本發(fā)明的融合蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列并表現(xiàn)出該多肽的至少一種活性的肽，但它含有比在此闡述的全長(zhǎng)多肽更少的氨基酸。典型地，生物學(xué)活性部分包括具有多肽的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。多肽的生物學(xué)活性部分可以是長(zhǎng)度為例如5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽。這些生物學(xué)活性部分可以被合成制備或通過(guò)重組技術(shù)制備，以及利用在此闡述的和/或本領(lǐng)域熟知的手段評(píng)價(jià)活性部分的本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)功能活性。
另外，本發(fā)明優(yōu)選的衍生物包括已經(jīng)與另一種化合物融合的成熟的融合蛋白，如這種化合物可以提高多肽的半衰期和/或減少多肽潛在的免疫原性(例如，聚乙二醇，“PEG”)。PEG可用于賦予水溶性、大小、減慢腎臟清除速率以及減少融合蛋白的免疫原性。見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6,214,966。對(duì)于PEG化，利用本領(lǐng)域人員已知的任何方法都可以完成融合蛋白與PEG的融合。例如，首先通過(guò)將一個(gè)半胱氨酸突變引入到融合蛋白內(nèi)，隨后通過(guò)PEG-馬來(lái)酰亞胺的位點(diǎn)特異性衍生可以完成PEG化?？梢詫腚装彼崽砑拥诫牡腃末端，見(jiàn)例如Tsutsumi et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(15)8548-8553?？梢詫?duì)融合蛋白進(jìn)行的另一個(gè)修飾涉及生物素化。在某些情況下，將融合蛋白生物素化可能是有用的，使得它容易與鏈霉親和素相互作用。蛋白質(zhì)生物素化的方法在本領(lǐng)域是熟知的。此外，硫酸軟骨素可以和融合蛋白相連接。
本發(fā)明的融合蛋白、靶向蛋白和TM結(jié)構(gòu)域的變體包括具有與原始融合蛋白、靶向蛋白以及TM結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列足夠相似的氨基酸序列的多肽。術(shù)語(yǔ)“足夠相似”指相對(duì)于第二個(gè)氨基酸序列，第一個(gè)氨基酸序列含有足夠的或最小數(shù)目的相同或等價(jià)氨基酸殘基，使得第一個(gè)和第二個(gè)氨基酸序列具有共同的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域和/或共同的功能活性。例如，在此將含有至少約45％，優(yōu)選約75％到98％相同的共同的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列定義為足夠相似。優(yōu)選地，變體與本發(fā)明的優(yōu)選融合蛋白的氨基酸序列足夠相似。變體包括在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的多核苷酸或其互補(bǔ)物雜交的多核苷酸所編碼的融合蛋白的變體。這些變體通常保留了本發(fā)明的融合蛋白的功能活性。可以用多核苷酸的片段文庫(kù)生成用于篩選和隨后選擇的片段的多樣化群(variegated population)。例如，在其中每分子只發(fā)生約1次缺口的條件下，通過(guò)用核酸酶處理多核苷酸的雙鏈PCR片段，變性雙鏈DNA和復(fù)性DNA形成可以包括來(lái)自不同缺口產(chǎn)物的有義/反義堿基對(duì)的雙鏈DNA、通過(guò)用S1核酸酶處理從新形成的雙鏈體中去除單鏈部分并將所生成的片段文庫(kù)連接到表達(dá)載體中可以生成片段文庫(kù)。通過(guò)這個(gè)方法，可以生成編碼本發(fā)明融合蛋白的多種大小的N末端和內(nèi)部片段的表達(dá)文庫(kù)。
變體包括因?yàn)檎T變而在氨基酸序列上有所不同的融合蛋白以及靶向蛋白和TM結(jié)構(gòu)域。利用實(shí)施例5所述的蛋白C活化檢測(cè)法通過(guò)篩選例如截短突變或點(diǎn)突變的突變體的組合文庫(kù)可以確定具有凝血酶介導(dǎo)的蛋白C活化的輔因子活性的本發(fā)明的融合蛋白或TM結(jié)構(gòu)域的變體。利用實(shí)施例5所述的實(shí)施例5的sTF/FVIIa檢測(cè)法或FX活化檢測(cè)法通過(guò)篩選例如截短突變或點(diǎn)突變的突變體的組合文庫(kù)可以鑒定具有TF或FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合活性的本發(fā)明的融合蛋白或靶向蛋白的變體。另外，通過(guò)在融合蛋白的TM結(jié)構(gòu)域部分的殘基或序列上進(jìn)行不同的取代也可以構(gòu)建融合蛋白的生物等價(jià)類(lèi)似物，它可以使得融合蛋白對(duì)氧化損傷或蛋白酶的耐受性更強(qiáng)，見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利5,827,824，或增加融合蛋白的催化效率，見(jiàn)例如Adler，M.et al.(1995)J.Biol.Chem.270(40)23366-23372，和2001年12月27日出版的PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO01/98352，在此將所有的這些一起并入?yún)⒖肌?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在核酸水平的組合誘變生成變體的多樣化文庫(kù)并通過(guò)多樣化基因文庫(kù)將其編碼。例如，通過(guò)將合成寡核苷酸的混合物酶連到基因序列使得潛在的變體氨基酸序列的簡(jiǎn)并組(degenerate set)可表達(dá)為獨(dú)立的多肽或一組含有一組在此的序列的更大的融合蛋白(例如噬菌體展示)，這樣可生成變體的多樣化文庫(kù)。有多種方法可用于從簡(jiǎn)并寡核苷酸序列生成潛在變體文庫(kù)?？梢栽谧詣?dòng)DNA合成儀中進(jìn)行簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成基因連接到合適的表達(dá)載體中。應(yīng)用基因的簡(jiǎn)并組可以提供編碼所需的潛在變體序列組的所有序列的混合物。合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域是已知的(見(jiàn)，例如Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura et al.(1984a)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura et al(1984b)Science 1981056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
在本領(lǐng)域已知有一些技術(shù)可用于篩選點(diǎn)突變或截短突變所形成的組合文庫(kù)的基因產(chǎn)品，以及用于篩選cDNA文庫(kù)的具有所選擇的性能的基因產(chǎn)品。這些技術(shù)適于快速篩選融合蛋白以及靶向蛋白和TM結(jié)構(gòu)域的組合誘變所形成的基因文庫(kù)的凝血酶介導(dǎo)的蛋白C活化的輔因子活性或TF-或FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合活性。通常用于篩選大基因文庫(kù)的最廣泛使用的能進(jìn)行高通量分析的技術(shù)包括將基因文庫(kù)克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用所形成的載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞并在對(duì)所需活性的檢測(cè)有助于分離編碼生成所檢測(cè)的產(chǎn)物的基因的載體的條件下表達(dá)組合基因。遞歸整體誘變(recursive ensemble mutagenesis，REM)，一種增強(qiáng)文庫(kù)內(nèi)功能性突變頻率的技術(shù)，可以和篩選檢測(cè)一起用于鑒定所需的變體。
生成融合蛋白利用任何本領(lǐng)域人員已知的方法通過(guò)將靶向蛋白融合或結(jié)合到TM結(jié)構(gòu)域或其類(lèi)似物、片段、衍生物或變體可以生成本發(fā)明的融合蛋白。利用多種已知的化學(xué)方法中的任何一種方法都可以將兩種成分化學(xué)地結(jié)合在一起。例如，連接可以是異源雙功能的交聯(lián)物(crosslinker)形式，例如，SPDP、碳二亞胺、戊二醛等等。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用例如通過(guò)應(yīng)用重組DNA技術(shù)生成同時(shí)編碼靶向蛋白和編碼TM結(jié)構(gòu)域并在例如大腸桿菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)DNA序列的多肽的核酸的重組手段可以將本發(fā)明的靶向蛋白融合到TM結(jié)構(gòu)域。用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的克隆方法可以以cDNA或基因組的形式克隆出編碼融合蛋白的DNA。見(jiàn)例如，Sambrook，J.F.et al.(1989)supra。
對(duì)于靶向蛋白是抗體的情況，一旦鑒定出編碼Fv區(qū)域的DNA序列，當(dāng)被表達(dá)時(shí)Fv序列表現(xiàn)出特異的結(jié)合活性，用本領(lǐng)域人員已知的方法可以制備包含該Fv區(qū)域的融合蛋白。因此，例如，Chaudhary，V.K.et al.(1989)Nature 339(6223)394-397；Batra，J.K.et al.(1990)J.Biol.Chem.265(25)15198-15202；Batra，J.K.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(21)8545-8549；Chaudhary，V.K.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(3)1066-1070，在此一同并入?yún)⒖?，它們描述了多種單鏈抗體融合蛋白的制備。Fv區(qū)域可以直接融合到TM結(jié)構(gòu)域或通過(guò)一個(gè)接頭(linker)序列連接。存在的接頭序列可以?xún)H僅提供靶向部分和TM結(jié)構(gòu)域之間的空間，以有助于這些區(qū)域之間的活動(dòng)以保證它們彼此之間保持它們的最佳構(gòu)象。包含連接子(connector)的DNA序列也可以提供有助于克隆的序列(例如引物或限制性位點(diǎn))或可以保留編碼靶向部分的序列和編碼TM結(jié)構(gòu)域的序列之間的讀框。本領(lǐng)域人員對(duì)于設(shè)計(jì)這樣的連接肽(connector peptide)是熟知的。
在本發(fā)明中，接頭序列可以用于連接靶向蛋白和TM結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在構(gòu)建包括單鏈抗體和TM EGF456結(jié)構(gòu)域以及EGF3與EGF4之間的域間環(huán)(TMi456)的融合蛋白時(shí)使用了兩個(gè)接頭序列。第一個(gè)連接單鏈抗體的輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域。第一個(gè)接頭序列為5個(gè)氨基酸長(zhǎng)。顯而易見(jiàn)的是可以使用其它的從0到10個(gè)氨基酸長(zhǎng)的短接頭序列。本發(fā)明的第二個(gè)接頭是一個(gè)15個(gè)氨基酸的接頭，它將抗體連接到TM結(jié)構(gòu)域。對(duì)本領(lǐng)域人員顯而易見(jiàn)的是可以使用許多不同的接頭序列且仍形成保留有抗凝活性以及活化蛋白C的融合蛋白。對(duì)現(xiàn)有的接頭的修飾將著力于最大化地增強(qiáng)含TF的磷脂表面的蛋白C的活化。
在一個(gè)優(yōu)選的方案中，利用噬菌體展示文庫(kù)制備單鏈抗體。在構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)的第一個(gè)步驟中，利用一組家族特異性引物從人骨髓、淋巴結(jié)和脾臟的混合mRNA(pooled mRNA)通過(guò)PCR克隆出可變區(qū)基因(VH(來(lái)自IgM)、Vκ和VL)。所形成的pCITE-VH(3.8×109個(gè)成員)、pZ604-Vκ(1.6×107)和pZ604-VL(3.2×107)文庫(kù)具有永久及高多樣性的V基因。從pCITE-VH文庫(kù)中擴(kuò)增出VH基因。從pZ604-Vκ和pZ604-VL文庫(kù)中PCR擴(kuò)增出在5’末端具有反向JH和接頭序列的Vκ和VL基因。然后將凝膠純化的含有VH、Vκ和VL的PCR產(chǎn)物一起剪接生成scFv基因庫(kù)((gene repertoire))。將scFv基因庫(kù)克隆進(jìn)噬粒載體pZ603并將連接產(chǎn)物電穿孔到合適的感受態(tài)TG1大腸桿菌中生成具有5.2×109個(gè)單一轉(zhuǎn)化體的scFv噬菌體展示文庫(kù)，HuPhabL3(Kay，B.K.et al.(1996)Phage Display of Peptides and ProteinsALaboratory Manual，Academic Press，San Diego CA；Marks，J.D.et al.(1991)J.Mol.Biol.222(3)581-597；Sheets，M.D.et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(11)6157-6162)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備了具有對(duì)TF的單VH/VL結(jié)合位點(diǎn)的單鏈抗體(scFv(TF)3e10)。在實(shí)施例1中顯示了scFv(TF)3e10(SEQ ID NO1)的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將含有在兩側(cè)具有NotI位點(diǎn)的TMi456序列(具有M388L和H381G突變)的PCR片段亞克隆到pZ612/3e10(基于來(lái)自Pharmacia的pCANTAB5的用于scFv(TF)3e10的細(xì)菌表達(dá)載體)的NotI位點(diǎn)。在此，將本發(fā)明的融合蛋白的TM部分的點(diǎn)突變表示為天然TM的氨基酸殘基的單字母的名稱(chēng)，隨后是在成熟TM中的氨基酸位置的數(shù)字以及氨基酸突變的單字母的名稱(chēng)。例如，M388L表示成熟TM的388位氨基酸的蛋氨酸變?yōu)榱涟彼帷otI位點(diǎn)在抗體序列和e-tag序列之間。這形成了包括scFV(TF)3e10-15個(gè)氨基酸的接頭-TMi456，之后是e-tag序列的融合蛋白的細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建體(pKM101)。為了形成哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，首先從pKM101模板生成PCR片段。該片段被設(shè)計(jì)用于連接到TM表達(dá)載體pTHR525的StuI/MscI位點(diǎn)上。這形成了一種載體(pKM113)，其具有Solulin信號(hào)序列，后接成熟融合蛋白序列，之后是e-tag序列。該載體含有氨芐青霉素抗性基因和潮霉素以及DHFR選擇標(biāo)記。MPSV LTR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。在該載體上進(jìn)行的定點(diǎn)誘變以包括R456G和H457Q突變，這賦予TM部分的蛋白酶耐受性。所形成的載體被稱(chēng)為pKM115。pKM115載體具有一個(gè)分離VH和VL結(jié)構(gòu)域的15個(gè)氨基酸的接頭以及另一個(gè)分離VL結(jié)構(gòu)域與TMi456的15個(gè)氨基酸的接頭。將分離VH和VL的接頭減少到5個(gè)氨基酸使之形成具有更高親和力的二聚體，稱(chēng)為pHM115.5。在實(shí)施例2中描述了pHM115.5所編碼的融合蛋白，scFv(TF)3e10-TMi456(SEQ ID NO2)。利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)通過(guò)缺失分離VH和VL結(jié)構(gòu)域的5個(gè)氨基酸的接頭中的3個(gè)氨基酸(GAP)以及缺失融合蛋白C末端的e-tag形成另外一種載體，pKM125。在實(shí)施例3中描述了所形成的融合蛋白，scFv(TF)3e10-TMi456Δ(SEQ ID NO3)。
融合蛋白的表達(dá)和純化有一些體外表達(dá)重組融合蛋白的方法，包括大腸桿菌、桿狀病毒、酵母哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其它的表達(dá)系統(tǒng)。在細(xì)菌內(nèi)表達(dá)所克隆的基因的方法是熟知的。為了在原核系統(tǒng)內(nèi)得到所克隆的基因的高水平表達(dá)，必需要構(gòu)建含有至少指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄終止的強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體。適合于這個(gè)目的的調(diào)節(jié)區(qū)域的實(shí)例為大腸桿菌的色氨酸生物合成途徑的大腸桿菌β-葡糖苷酶基因啟動(dòng)子和操縱子區(qū)域，或λ噬菌體的左側(cè)啟動(dòng)子。在轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌的DNA載體內(nèi)包含選擇標(biāo)記是有用的。這些標(biāo)記的實(shí)例包括特異地耐受氨芐青霉素、四環(huán)素或氯霉素的基因。
從用于表達(dá)融合蛋白及其類(lèi)似物的更高級(jí)的真核細(xì)胞系統(tǒng)中可選擇出多種細(xì)胞系統(tǒng)。所列舉的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株例如包括但不限于RPMI 7932、VERO和HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞株、W138、BHK、COS-7、C127或MDCK細(xì)胞株。一個(gè)優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株是CHL-1。當(dāng)使用CHL-1時(shí)，所含的潮霉素作為真核選擇標(biāo)記。CHL-1細(xì)胞來(lái)源于RPMI 7032黑素瘤細(xì)胞，一種容易獲得的人細(xì)胞株。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的約定，CHL-1細(xì)胞株已經(jīng)于1987年6月18日被保藏于ATCC，保藏號(hào)為#CRL 9446。在本發(fā)明中適合使用的細(xì)胞是從ATCC商業(yè)化獲得的。列舉的細(xì)胞株包括草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)和家蠶(Bombyx mori)。
原核系統(tǒng)大腸桿菌不能進(jìn)行翻譯后修飾，例如糖基化。另外，當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，具有復(fù)雜二硫鍵形式的蛋白經(jīng)常錯(cuò)誤地折疊。對(duì)在此所描述的融合蛋白而言，當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，盡管血栓調(diào)節(jié)蛋白輔因子的兩種活性仍然存在，但其輔因子活性顯著下降。在原核系統(tǒng)中，所表達(dá)的蛋白或以所謂的包涵體的非可溶性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞裂解后的可溶性組分中，或通過(guò)添加適宜的分泌信號(hào)序列被直接地分泌到周質(zhì)中。如果所表達(dá)的蛋白位于非可溶的包涵體內(nèi)，那么通常需要對(duì)包涵體的可溶性化以及之后的再折疊。
本領(lǐng)域人員已知的許多原核表達(dá)載體，如pKK223-3(PharmaciaFine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pKK233-2(Clontech，Palo Alto，CA，USA)和pGEM1(Promega Biotech，Madison，WI，USA)是商業(yè)化可獲得的。
在重組微生物表達(dá)系統(tǒng)中常用的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang，A.C.et al.(1978)Nature 275(5681)617-624；Goeddel，D.V.et al.(1979)Nature 281(5732)544-548)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel，D.V.et al.(1980)Nucl.Acids Res.8(18)4057-4074)以及tac啟動(dòng)子(Maniatis，T.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982))。另一種有用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)采用了λ噬菌體pL啟動(dòng)子和clts857熱誘導(dǎo)阻抑物(Bernard，H.U.et al.(1979)Gene 5(1)59-76；Love，C.A.et al.(1996)Gene 176(1-2)49-53)。也可以在例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的酵母宿主中表達(dá)重組融合蛋白。這通常具有進(jìn)行多種翻譯后修飾的能力。所表達(dá)的融合蛋白可以被分泌到?jīng)]有許多其它蛋白存在的培養(yǎng)基上清中，使得純化更為容易。用于表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的酵母載體具有某些必需的特性。載體的元件通常來(lái)源于酵母和細(xì)菌以容許質(zhì)粒在兩者中擴(kuò)增。細(xì)菌元件包括復(fù)制起點(diǎn)以及選擇標(biāo)記。酵母元件包括復(fù)制序列起點(diǎn)(ARS)、選擇標(biāo)記、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。
在酵母載體中用于表達(dá)的適宜啟動(dòng)子包括TRP1基因、ADH1或ADHII基因、酸性磷酸酶(PH03或PH05)基因、異細(xì)胞色素(isocytochrome)基因啟動(dòng)子或糖酵解途徑中所包含的啟動(dòng)子，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶和磷酸葡糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子(Hitzeman，R.A.et al.(1980)J.Biol.Chem.255(24)12073-12080；Hess，B.et al.(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7149-167；和Holland，M.J.andHolland，J.P.(1978)Biochemistry 17(23)4900-4907)。
商業(yè)化可獲得的酵母載體包括pYES2、pPIC9(Invitrogen，SanDiego，CA)、Yepc-pADH2a、pYcDE-1(Washington Research，Seattle，WA)、pBC102-K22(ATCC#67255)和YpGX265GAL4(ATCC#67233)。可以采用包括但不限于COS-7、L細(xì)胞、C127、3T3、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)、HeLa、BHK、CHL-1、NSO和HEK293的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株表達(dá)本發(fā)明的重組融合蛋白。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)生成的重組蛋白通?？扇懿⒈惶腔?，以及具有真實(shí)的N末端。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以含有非轉(zhuǎn)錄元件如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及5’或3’非翻譯序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、受體位點(diǎn)和剪接供體以及轉(zhuǎn)錄終止序列。在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中所用的啟動(dòng)子通常是例如病毒啟動(dòng)子，如多形瘤、腺病毒、HTLV、猿猴病毒40(SV40)和人巨細(xì)胞病毒(CMV)。
根據(jù)所選擇的表達(dá)系統(tǒng)以及宿主，通過(guò)使用用于蛋白質(zhì)純化的傳統(tǒng)層析的不同組合可以獲得均一的重組融合蛋白。這些包括免疫親和層析、反相層析、陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、疏水作用層析、凝膠過(guò)濾層析以及HPLC，如果表達(dá)系統(tǒng)將融合蛋白分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，就可以從培養(yǎng)基中直接純化蛋白。如果融合蛋白是非分泌的，就從細(xì)胞裂解物中分離蛋白。用任何傳統(tǒng)的方法包括凍融循環(huán)、超聲波、機(jī)械裂解或使用細(xì)胞裂解試劑可以進(jìn)行細(xì)胞裂解。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用哺乳動(dòng)物表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染CHO DXB11細(xì)胞。用400μg/ml潮霉素B的HAMS/F12培養(yǎng)基選擇穩(wěn)定群(population)。表達(dá)水平為大約500μg/L。為了增加表達(dá)水平，用100nM氨甲蝶呤的αMEM培養(yǎng)基選擇群。該群的近似表達(dá)水平是5mg/L。
融合構(gòu)建體在蛋白的C末端含有e-tag序列?？筫-tag親和柱購(gòu)自American/Pharmacia Biotech。用0.22μm濾膜濾過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)基并以2ml/min裝入到5ml的e-tag柱中。用0.2M磷酸緩沖液0.05％NaN3，pH7.0洗柱，然后收集到含有0.1容積的1M Tris緩沖液，pH8.2的試管內(nèi)以中和洗脫緩沖液?；蛘撸瑢V過(guò)后的培養(yǎng)基裝入到蛋白A柱中。在這種情況中，用50mM檸檬酸，300mM NaCl，pH6.5洗滌柱子并用pH3.0的相同緩沖液洗脫。在兩種情況中，隨后都將純化的樣本裝入到Sephadex 200柱中，將融合蛋白的單體與二聚體分離開(kāi)來(lái)。
藥用組合物本發(fā)明還提供了能施用給患者以達(dá)到治療作用的藥用組合物。通過(guò)組合具有所需純化程度的融合蛋白以及藥用有效量的生理上可接受的載體可以制備用于施用的本發(fā)明的藥用組合物。
本發(fā)明的融合蛋白可以應(yīng)用于用于靜脈內(nèi)施用或皮下施用或鞘內(nèi)施用的藥用組合物。因此，上述的融合蛋白優(yōu)選與可接受的無(wú)菌藥用載體組合，這些載體如5％葡萄糖、乳酸林格液、生理鹽水、無(wú)菌水或設(shè)計(jì)用于靜脈內(nèi)注入的其它任何商業(yè)化制備的生理性緩沖溶液。要知道對(duì)載體溶液和組合物的劑量及施用的選擇會(huì)因?yàn)橹委煂?duì)象和特殊的臨床背景的不同而有所不同，并被標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)操作所決定。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以施用有效量的這些藥用組合物以抑制對(duì)象中與凝血酶的過(guò)度生成相關(guān)的病理性后果。
可以丸式靜脈內(nèi)注射(bolus intravenous injection)、持續(xù)靜脈內(nèi)注射或組合兩種途徑施用融合蛋白?；蛘?，或另外，可以從肌內(nèi)部位將與適宜的賦形劑相混合的融合蛋白帶入到循環(huán)中。通過(guò)測(cè)定取自患者的一系列血液標(biāo)品的活化部分組織促凝血酶原激酶時(shí)間(activatedpartial thromboplastin time)(PT)可以監(jiān)測(cè)融合蛋白的全身治療。當(dāng)融合蛋白在循環(huán)中達(dá)到了足夠水平時(shí)，在這個(gè)檢測(cè)中觀察到凝血時(shí)間延長(zhǎng)。
本發(fā)明的重組融合蛋白和藥用組合物可用于腸外、局部、靜脈內(nèi)、口服或局灶施用。依照施用的方法，可以以多種單位劑量的形式施用藥用組合物。例如，可以以包括但不限于片劑、膠囊、粉末、溶液和乳劑的形式施用單位劑量形式。
本發(fā)明的重組融合蛋白和藥用組合物對(duì)于靜脈內(nèi)施用是特別有用的。用于施用的組合物通常包含單鏈抗體或含有溶解于藥用可接受的載體內(nèi)，優(yōu)選溶解于水溶液的單鏈抗體的融合蛋白的溶液?？梢允褂枚喾N水溶液載體，例如緩沖鹽水等等。這些溶液是無(wú)菌的并且通常不含非必需的物質(zhì)?？梢杂脗鹘y(tǒng)的、熟知的消毒技術(shù)消毒組合物。
本領(lǐng)域人員可以輕易地確定用于靜脈內(nèi)施用的常用的藥用組合物。施用的量明顯是蛋白特異的并且依賴(lài)于它的療效(potency)以及藥物動(dòng)力學(xué)的情況。用于制備腸外施用組合物的實(shí)際方法對(duì)于本領(lǐng)域人員是已知的或顯而易見(jiàn)的，并且在例如Remington′s PharmaceuticalScience，15thed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa(1980)的出版物中被更為詳細(xì)地描述。
可以施用含有本融合蛋白或其雞尾酒配方(即組合其它蛋白)的組合物用作治療性處理。在治療性應(yīng)用中，將能治愈或至少部分地阻止出血的足夠量的組合物施用給患出血異?；蚣膊〉幕颊?。能達(dá)到這一點(diǎn)的足夠量被定義為“治療有效量”。對(duì)此應(yīng)用的有效量將依賴(lài)于疾病的嚴(yán)重程度以及患者的一般健康狀況。
組合物的單次或多次施用依賴(lài)于所需的及患者所耐受的劑量和頻率。在任何時(shí)候，組合物應(yīng)當(dāng)提供能有效地治療患者的足夠量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
以治療有效量施用本發(fā)明的融合蛋白或它們的藥用可接受的組合物，治療有效量的不同依賴(lài)于多種因素，包括所采用的特異融合蛋白的活性；融合蛋白作用的代謝穩(wěn)定性及時(shí)間長(zhǎng)短；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用的方式和次數(shù)；排泄速率；藥物組合；特殊疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度；患者正進(jìn)行的治療。通常，每天的治療有效量為每天約0.14mg到約14.3mg/kg體重的本發(fā)明的融合蛋白或其可藥用可接受的組合物；優(yōu)選為每天約0.7mg到約10mg/kg體重；以及最優(yōu)選每天約1.4mg到約7.2mg/kg體重。例如，給一個(gè)70kg的人施用，劑量范圍為每天約10mg到約1g的本發(fā)明的融合蛋白或其藥用可接受的組合物；優(yōu)選每天約50mg到約700mg；以及最優(yōu)選每天約100mg到約500mg。
基因治療依照本發(fā)明也可以通過(guò)體內(nèi)表達(dá)這種融合蛋白來(lái)利用本發(fā)明的融合蛋白，這通常被稱(chēng)作為“基因治療”。因此，例如，可以用編碼融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)體外(ex vivo)工程化細(xì)胞，然后將工程化的細(xì)胞提供給需要用融合蛋白治療的患者。這些方法在技術(shù)上是熟知的。例如，利用本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)使用含有編碼本發(fā)明的融合蛋白的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒可以工程化細(xì)胞。
使用基因治療局部輸送本發(fā)明的抗凝血融合蛋白可以將治療試劑提供給靶部位，位于血管內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞。
體外和體內(nèi)基因治療的方法學(xué)都是被關(guān)注的。已知一些用于將潛在的治療基因轉(zhuǎn)移到特定的細(xì)胞群中的方法。見(jiàn)，例如，Mulligan(1993)Science 260926-931。這些方法包括1)直接基因轉(zhuǎn)移。見(jiàn)，例如Wolff et al.(1990)Science 2471465-1468；2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。見(jiàn)，例如Caplen et al.(1995)Nature Med.339-46；Crystal(1995)Nature Med.115-17；Gao and Huang(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.179280-2853)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。見(jiàn)，例如Kay et al.(1993)Science 262117-119；Anderson(1992)Science 256808-813；4)DNA病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這些DNA病毒包括腺病毒(優(yōu)選基于Ad2或Ad5的載體)、皰疹病毒(優(yōu)選基于單純皰疹病毒的載體)以及細(xì)小病毒(優(yōu)選基于“缺陷的”或非自主的細(xì)小病毒的載體，更優(yōu)選基于腺相關(guān)病毒的載體，最優(yōu)選基于AVV-2的載體)。見(jiàn)，例如Ali et al.(1994)Gene Therapy 1367-384；美國(guó)專(zhuān)利4,797,368，在此一起并入?yún)⒖?，以及美?guó)專(zhuān)利5,139,941，在此一同并入?yún)⒖肌?br> 對(duì)用于轉(zhuǎn)移感興趣的基因的特殊的載體系統(tǒng)的選擇依賴(lài)于多種因素。一個(gè)重要的因素是靶細(xì)胞群的性質(zhì)。盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)被廣泛地研究并用于許多基因治療應(yīng)用，但這些載體通常不適合用于感染非分裂細(xì)胞。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒具有致癌的潛能。然而，最近在慢病毒載體領(lǐng)域的進(jìn)展可以避免這些局限中的一些局限。見(jiàn)Naldini etal.(1996)Science 272263-267。
可能生成上述的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney鼠白血病毒、脾臟壞死病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類(lèi)白血病病毒、長(zhǎng)臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)以及乳癌病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體來(lái)源于Moloney鼠白血病毒。
腺病毒的優(yōu)點(diǎn)是它們具有廣泛的宿主范圍，并能感染靜止的或終末分化的細(xì)胞，如神經(jīng)元或肝細(xì)胞，以及基本上表現(xiàn)為非致癌性。見(jiàn)，例如Ali et al.(1994)，supra，p.367。腺病毒不整合到宿主基因組中。因?yàn)樗鼈兇嬖谟谌旧w外，極大地減少了插入誘變的危險(xiǎn)。Ali et al.(1994)，supra，p.373。
腺相關(guān)病毒具有與基于腺病毒的載體相似的優(yōu)點(diǎn)。然而，AAV定點(diǎn)整合到人的19號(hào)染色體(Ali et al.(1994)，supra，p.377)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA進(jìn)行基因治療的疾病包括但不限于深靜脈血栓形成、彌漫性血管內(nèi)凝血、急性冠脈綜合征或具有凝血病表現(xiàn)的癌癥。
根據(jù)該實(shí)施方案，在診斷的同時(shí)或診斷后即刻，將用編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA的基因治療提供給所需的患者。
根據(jù)該實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可以使用任何合適的含有編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA或編碼本發(fā)明的融合蛋白的類(lèi)似物、片段、衍生物或變體的DNA的基因治療載體。構(gòu)建這樣一個(gè)載體的技術(shù)是已知的。見(jiàn)，例如Anderson，W.F.(1998)Nature 39225-30；Verma I.M.and Somia，N.(1998)Nature 389239-242。用已知的技術(shù)可以可以將含有融合蛋白DNA的載體導(dǎo)入到靶位點(diǎn)。
基因治療載體包括一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子?？梢圆捎玫暮线m的啟動(dòng)子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV 40啟動(dòng)子和在Miller et al.(1989)Biotechniques 7(9)980-990中所描述的人巨細(xì)胞病毒(CVM)啟動(dòng)子或其它任何的啟動(dòng)子(比如，細(xì)胞啟動(dòng)子，例如真核細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。可以采用的其它病毒啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子以及B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。從在此所包含的教導(dǎo)中選擇合適的啟動(dòng)子對(duì)于本領(lǐng)域人員是顯而易見(jiàn)的。
編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸序列是在合適的啟動(dòng)子的控制下。可以采用的合適的啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒啟動(dòng)子，如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人球蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子，如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括修飾后的上述逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子以及人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞株形成生產(chǎn)細(xì)胞株?？梢员晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X；如在Miller(1990)Human Gene Therapy 15-14中所描述的VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+#-86、GP+envAm12和DAN細(xì)胞株，在此將其全部?jī)?nèi)容一同并入?yún)⒖?。載體可以通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體以及CaPO4沉淀。在一個(gè)方法中，可以將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體裝入脂質(zhì)體內(nèi)，或與脂類(lèi)偶聯(lián)，然后施用給宿主。生產(chǎn)細(xì)胞株生產(chǎn)包含編碼多肽的核酸序列的感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。然后可以用這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼多肽的核酸序列?？梢员晦D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞以及造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
一種不同的基因治療的方法是“經(jīng)核治療(transkaryotictherapy)”，其中體外(ex vivo)處理患者的細(xì)胞誘導(dǎo)靜止的染色體基因在重新導(dǎo)入到患者后生產(chǎn)感興趣的蛋白。經(jīng)核治療假定個(gè)體具有活化所必需的基因的正?；パa(bǔ)。經(jīng)核治療包括將能激活新生基因的啟動(dòng)子或其它外源調(diào)節(jié)序列體外(ex vivo)導(dǎo)入到患者細(xì)胞的染色體DNA內(nèi)，培養(yǎng)并選擇活化的蛋白生產(chǎn)細(xì)胞，然后將活化的細(xì)胞重新導(dǎo)入到患者體內(nèi)，目的是之后這些細(xì)胞被完全地建立。然后“基因活化”細(xì)胞生產(chǎn)感興趣的蛋白一段顯著長(zhǎng)的時(shí)間，可能是患者的終生。美國(guó)專(zhuān)利5,641,670和5,733,761詳細(xì)闡述了這個(gè)概念，在此將其全部?jī)?nèi)容一起并入?yún)⒖肌?br> 試劑盒本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于研究或診斷目的的試劑盒。試劑盒通常包括一個(gè)或多個(gè)含有本發(fā)明的單鏈抗體的容器(container)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包括含有適合于用第二種分子例如TM結(jié)構(gòu)域或其片段衍生化的形式的單鏈抗體的容器。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包括含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的融合蛋白的容器。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可以含有編碼融合蛋白的DNA序列。優(yōu)選以適合于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并被宿主細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒提供編碼這些融合蛋白的DNA序列。質(zhì)?？梢院姓{(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)DNA表達(dá)的啟動(dòng)子(通常是可誘導(dǎo)啟動(dòng)子)。質(zhì)粒也可以含有適宜的限制性位點(diǎn)以有助于其它DNA序列插入到質(zhì)粒內(nèi)以生成多種融合蛋白。質(zhì)粒也可以含有許多其它的有助于編碼蛋白克隆與表達(dá)的元件。這些元件對(duì)于本領(lǐng)域人員是熟知的，包括例如選擇標(biāo)記、起始密碼子、終止密碼子等等。
治療適應(yīng)癥血栓形成起重要的病原作用的疾病包括心肌梗死、彌漫性血管內(nèi)凝血、深靜脈血栓形成、肺栓塞、缺血性卒中、感染性休克、急性呼吸窘迫綜合征、不穩(wěn)定絞痛和其它的動(dòng)脈和靜脈阻塞性病變。本發(fā)明的融合蛋白在所有的這些情況以及血栓形成是病理性的其它疾病中都是有用的。本發(fā)明的融合蛋白可能有用的其它病理性病變包括具有凝血病表現(xiàn)的癌癥以及炎癥。也可以發(fā)現(xiàn)化合物可以用于皮膚和靜脈移植物和器官移植。有用的意思是化合物能用于治療，或預(yù)防疾病或阻止它進(jìn)展到更嚴(yán)重的狀態(tài)。本發(fā)明的化合物也給例如接受生物假體如心瓣膜的患者提供了一種安全有效的抗凝劑。這些化合物可以取代肝素和華法林治療例如肺栓塞或急性心肌梗死。本發(fā)明的融合蛋白也可以用于包被凝血是相關(guān)的問(wèn)題的醫(yī)療器械。
檢測(cè)多種用于測(cè)定本發(fā)明的融合蛋白的TM活性的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是可利用的。在Salem，H.H.et al.(1984)，supra和Galvin，J.B.et al.(1987)J.Biol.Chem.262(5)2199-2205中所描述的檢測(cè)可測(cè)定蛋白C活性。簡(jiǎn)要地，檢測(cè)由兩個(gè)步驟組成。第一步是在所設(shè)定的條件下將試驗(yàn)的融合蛋白和凝血酶及蛋白C一起孵育。第二步，用蛭素或抗凝血酶III以及肝素失活凝血酶，利用顯色底物測(cè)定新活化蛋白C的活性，其中通過(guò)活化蛋白C的蛋白裂解活性釋放出生色團(tuán)。用純化試劑進(jìn)行該檢測(cè)。
或者，利用例如活化部分組織促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)、凝血酶凝血時(shí)間(TCT)和/或凝血酶原時(shí)間(PT)的血漿凝血時(shí)間檢測(cè)可以測(cè)定融合蛋白的作用。這些檢測(cè)區(qū)分了凝血抑制的不同機(jī)制并涉及蛋白C的活化。在任何一個(gè)檢測(cè)中，凝血時(shí)間的延長(zhǎng)都說(shuō)明分子能抑制血漿內(nèi)凝血。
用上述的檢測(cè)鑒定具有TM活性的融合蛋白，其在純化系統(tǒng)和血漿介質(zhì)中都能結(jié)合凝血酶并激活蛋白C。然后用進(jìn)一步的檢測(cè)法評(píng)價(jià)天然TM的其它活性，如對(duì)凝血酶催化的纖維蛋白原生成纖維蛋白的抑制(Jakubowski，H.V.et al.(1986)J.Biol.Chem.261(8)3876-3882)、對(duì)凝血酶活化因子V的抑制(Esmon，C.T.et al.(1982).J.Biol.Chem.257(14)7944-7947)、促進(jìn)抗凝血酶III和肝素輔因子II對(duì)凝血酶的抑制(Esmon，N.L.et al.(1983)J.Biol.Chem.258(20)12238-12242)、對(duì)凝血酶活化因子X(jué)III的抑制(Polgar，J.et al.(1987)Thromb.Haemost.58(1)140)、對(duì)凝血酶介導(dǎo)的蛋白S的失活的抑制(Thompson，E.A.and Salem，H.H.(1986)J.Clin.Inv.78(1)13-17)以及對(duì)凝血酶介導(dǎo)的血小板的活化和聚集的抑制(Esmon，N.L.et al.(1983)，supra)。
用在實(shí)施例5中詳細(xì)描述的以下檢測(cè)法測(cè)定本發(fā)明的融合蛋白的體外效力(potency)1)蛋白C活化檢測(cè)(顯色法)；2)sTF/FVIIa活化檢測(cè)；3)因子X(jué)活化檢測(cè)；以及4)蛋白C活化檢測(cè)(在富含TF的表面)。
在進(jìn)行本發(fā)明的操作時(shí)，當(dāng)然要明白所引述的特定的緩沖液、培養(yǎng)基、試劑、細(xì)胞、培養(yǎng)條件等均是非限制性的，而是應(yīng)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀任一所討論的特定上下文中時(shí)能認(rèn)識(shí)到的所有感興趣的或有價(jià)值的相關(guān)材料。例如，用一種緩沖體系或培養(yǎng)基取代另一種經(jīng)常是可能的，并仍能取得即使不相同也是相似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員有著這些系統(tǒng)和方法學(xué)的足夠多的知識(shí)，使得他們不進(jìn)行過(guò)多的試驗(yàn)就能進(jìn)行這樣的取代并最優(yōu)化在此所描述的方法和操作。
用下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，以幫助實(shí)施本發(fā)明。在應(yīng)用實(shí)施例的闡述時(shí)，應(yīng)理解的是相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到本發(fā)明方法的其它不同的實(shí)施方案。
沒(méi)有進(jìn)一步的闡述，相信本領(lǐng)域人員能通過(guò)先前的描述將本發(fā)明應(yīng)用到最完全的程度。因此，下面優(yōu)選的特殊的實(shí)施方案只是舉例說(shuō)明，而不是以任何一種方式闡述其它內(nèi)容。
在先前的和下面的實(shí)施例中，除非有特殊的說(shuō)明，所有的溫度被非修正地設(shè)定為攝氏度，所有部分和百分比為重量百分比。
上面所引用的所有申請(qǐng)、專(zhuān)利和出版物全部一同并入?yún)⒖肌?br> 所提供的下面的實(shí)施例將作為進(jìn)行本發(fā)明實(shí)踐的一個(gè)指導(dǎo)，并不意圖對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。
實(shí)施例1單鏈抗TF抗體構(gòu)建體scFv(TF)3e10(-18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A QV N L R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A SG F S F T D A W M S W V R Q A P G K E L E W V SS I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R DN S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C AR V L S L T D Y Y W Y G M D V W G Q G T L V T VS A G G G G S G A P N F M L T Q P H S V S A S PG K T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y QQ R P G S S P T T V I Y E D N H R P S G V P D RF S G S I D T S S N S A S L T I S G L K T E D EA D Y Y C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T VL G A A A G A P V P Y P D P L E P R A A (264)單鏈抗TF抗體scFv(TF)3e10(SEQ ID NO1)由信號(hào)肽(-18到-1)、VH結(jié)構(gòu)域(1到126)、VH-VL接頭(127到131)、VL結(jié)構(gòu)域(132到246)以及e-tag序列(247到264)組成。
實(shí)施例2融合蛋白構(gòu)建體1-scFv(TF)3e10-TMi456 (-18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A QV N L R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A SG F S F T D A W M S W V R Q A P G K E L E W V SS I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R DN S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C AR V L S L T D Y Y W Y G M D V W G Q G T L V T VS A G G G G S G A P N F M L T Q P H S V S A S PG K T V T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y QQ R P G S S P T T V I Y E D N H R P S G V P D RF S G S I D T S S N S A S L T I S G L K T E D EA D Y Y C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T VL G A A A G G G G S G G G G S G G G G S V E P VD P C F R A N C E Y Q C Q P L N Q T S Y L C V CA E G F A P I PHE P H R C QMF C N Q T A C PA D C D P N T Q A S C E C P E G Y I L D D G F IC T D I D E C E N G G F C S G V C H N L P G T FE C I C G P D S A L AGQI G T D C A A A G A PV P Y P D P L E P R A A (400)融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456(SEQ ID NO2)由信號(hào)肽(-18到-1)、VH結(jié)構(gòu)域(1到126)、VH-VL接頭(127到131)、VL結(jié)構(gòu)域(132到246)、VL-TM接頭(247到264)、TMi456結(jié)構(gòu)域(265到382)以及e-tag序列(383到400)組成。TMi456中的H381G、M388L、R456G和H457Q突變用下劃線(xiàn)表示。
實(shí)施例3融合蛋白構(gòu)建體2-scFv(TF)3e10-TMi456Δ
(-18) M L G V L V L G A L A L A G L V F P E M A QV N L R E S G G T L V Q P G G S L R L S C A A SG F S F T D A W M S W V R Q A P G K E L E W V SS I S G S G G S T Y Y A G S V K G R F T I S R DN S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C AR V L S L T D Y Y W Y G M D V W G Q G T L V T VS A G G G G S N F M L T Q P H S V S A S P G K TV T I S C T R S S G S V A S Y Y V Q W Y Q Q R PG S S P T T V I Y E D N H R P S G V P D R F S GS I D T S S N S A S L T I S G L K T E D E A D YY C Q S Y D S N N L V V F G G G T K L T V L G AA A G G G G S G G G G S G G G G S V E P V D P CF R A N C E Y Q C Q P L N Q T S Y L C V C A E GF A P I PHE P H R C QMF C N Q T A C P A D CD P N T Q A S C E C P E G Y I L D D G F I C T DI D E C E N G G F C S G V C H N L P G T F E C IC G P D S A L AGQI G T D C (379)融合蛋白2-scFv(TF)3e10-TMi456Δ(SEQ ID NO3)由信號(hào)肽(-18到-1)、VH結(jié)構(gòu)域(1到126)、VH-VL接頭(127到131)、VL結(jié)構(gòu)域132到243)、VL-TM接頭(244到261)以及TMi456結(jié)構(gòu)域(262到379)組成。TMi456中的H381G、M388L、R456G和H457Q突變用下劃線(xiàn)表示。
實(shí)施例4融合蛋白在細(xì)菌/哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)細(xì)菌表達(dá)是可能的，但它所生成的蛋白所具有的TM輔因子活性被極大地減低。在CHO細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白。表達(dá)質(zhì)粒含有潮霉素B和DHFR選擇標(biāo)記。初始選擇在400μg/ml潮霉素中進(jìn)行以選擇出一個(gè)群。然后對(duì)所得到的群進(jìn)行100nM氨甲蝶呤選擇。在這個(gè)選擇期間，從群中選擇出具有含有選擇標(biāo)記和靶向基因的DNA區(qū)域的擴(kuò)增拷貝的細(xì)胞。作為選擇的結(jié)果，表達(dá)水平從近0.3mg/L增加到約6mg/L。
實(shí)施例5體外檢測(cè)1.蛋白C活化檢測(cè)(顯色法)通過(guò)在微量滴度板內(nèi)混合下列蛋白的每一種蛋白各20μl進(jìn)行本檢測(cè)TM樣品(未知的或標(biāo)準(zhǔn)的)、凝血酶(3nM)和蛋白C(1.5μM)。每種蛋白的檢測(cè)稀釋液為20mM Tris-HCl、0.1M NaCl、2.5mM CaCl2、2.5mg/ml BSA、pH7.4。在37℃下孵育2個(gè)小時(shí)，隨后加入20μl蛭素(0.16單位/μl 370nM)至檢測(cè)稀釋液并另外孵育10分鐘以終止蛋白C的活化。
通過(guò)加入100μl 1mM S2266(檢測(cè)稀釋液)檢測(cè)所形成的活化蛋白C的量，并繼續(xù)在37℃孵育。用Molecular Devices讀板器每10秒讀取每個(gè)孔在405nm的吸光度共30分鐘。儲(chǔ)存吸光度數(shù)據(jù)并計(jì)算出每秒鐘吸光度的變化(斜率)。每秒鐘吸光度的變化與pmol/ml活化蛋白C成比例。
利用不同濃度的總活化蛋白C經(jīng)驗(yàn)性地確定該比率。通過(guò)將0到1.5μM的蛋白C和60nM兔TM以及30nM凝血酶混合，孵育0到4小時(shí)，如上加入蛭素并測(cè)定S2266活性可以生成含有100％活化蛋白C的樣品。100％蛋白C被活化的條件被定義為S2266活性(A405/sec)達(dá)到平臺(tái)的條件。
每單位活性被定義為在上述的試劑條件下每ml/min生成1pmol活化蛋白C。或者，給出比較于天然去污劑可溶的兔TM的活性數(shù)值。
2.sTF/FVIIa活化檢測(cè)下面描述了本檢測(cè)的原理。底物三肽p-nitroanilide的酰胺鍵被sTF/FVIIa復(fù)合物水解。在405nm監(jiān)測(cè)所釋放的生色團(tuán)產(chǎn)物p-nitroanilide，用摩爾消光系數(shù)9920M-1cm-1計(jì)算出每單位時(shí)間所形成的產(chǎn)物濃度。將初始速率加入到4參數(shù)方程Y＝(A-D)/(1+(x/C)^B)+D可測(cè)定出IC50值(C)。
H-D-Val-Leu-Arg-p-NA→H-D-Val-Leu-Arg+p-NAS2266底物 三肽生色團(tuán)試劑和溶液1.檢測(cè)緩沖液50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％BSA，pH7.52.人FVIIa(HCVIIA-0060，Haematologic Technologies Inc.)10x工作溶液-在使用前配成20nM檢測(cè)緩沖液溶液。
3.可溶性TF(Berlex)10x工作溶液-在使用前配成30nM檢測(cè)緩沖液溶液。
4.顯色底物S2266(Kabi Pharmacia Hepar Inc.)儲(chǔ)存溶液10nM H2O溶液，4℃下儲(chǔ)存。2.5x工作溶液-在使用前配成2.5mM檢測(cè)緩沖液溶液。
5.抗體在使用前配成2.5x檢測(cè)緩沖液稀釋液。
檢測(cè)條件室溫下在96孔微量滴度板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。各種成分的最終濃度如下sTF 3nM抗體從1000到0.625nM不等；FVIIa 2nMS2266 1mM檢測(cè)步驟1.將0.1ml 2.5xAB(或緩沖液對(duì)照)吸入到每個(gè)孔內(nèi)。
2.加入0.025ml 10x sTF，在室溫下輕晃孵育10min。
3.加入0.025ml 10x FVIIa，在室溫下輕晃孵育10min。
4.加入0.1ml 2.5x S2266底物，馬上將滴度板轉(zhuǎn)移到讀板器并在405nm每隔10秒鐘測(cè)定酶動(dòng)力學(xué)共15分鐘。
3.因子X(jué)活化檢測(cè)下面描述了本檢測(cè)的原理。將FVIIa與重組人TF小泡(vesicle)一起孵育形成能活化底物FX的蛋白酶復(fù)合物。在存在(或不存在)不同濃度的抗體時(shí)形成該復(fù)合物，然后引入底物FX，進(jìn)行反應(yīng)以形成產(chǎn)物，活化的蛋白酶FXa能水解顯色底物S2222的p-nitroanilide酰胺鍵。在405nm監(jiān)測(cè)所釋放出的生色團(tuán)產(chǎn)物p-nitroanilide，用摩爾消光系數(shù)9920M-1cm-1計(jì)算出每單位時(shí)間所形成的產(chǎn)物濃度。將初始速率加入到4參數(shù)方程Y＝(A-D)/(1+(x/C)^B)+D可測(cè)定出IC50值(C)。
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-NA→Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-OH+p-NAS2222底物生色團(tuán)試劑和溶液1.檢測(cè)緩沖液50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.1％BSA，pH7.52.人FVIIa(HCVIIA-0031，Haematologic Technologies Inc.)4x工作溶液-在使用前配成100pM檢測(cè)緩沖液溶液。
3.重組人TF(來(lái)自Innovin，Dade，在我們實(shí)驗(yàn)室重構(gòu))工作溶液-在使用前配成1∶480檢測(cè)緩沖液稀釋液。
4.因子X(jué)(HCX-0060，Haematologic Technologies Inc.)4x工作溶液-在使用前配成1000nM檢測(cè)緩沖液溶液。
5.顯色底物S2222(Kabi Pharmacia Hepar Inc.)儲(chǔ)存溶液6mM H2O溶液，4℃下儲(chǔ)存工作溶液-在使用前配成0.78mM的3.57mM EDTA(用于終止反應(yīng))、150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH7.5的溶液。
6.抗體在使用前配成4x檢測(cè)緩沖液稀釋液。
檢測(cè)條件在室溫下96孔微量滴度板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。各種成分的最終濃度如下rTF小泡 1/4的1∶480稀釋液；
抗體 從1000到0.625nM不等；FVIIa 25pM；FX 250nM；S2222 0.546mM；檢測(cè)步驟1.將0.015ml 4xAB(或緩沖液對(duì)照)吸入到每個(gè)孔內(nèi)。
2.加入0.015ml 4xrTF小泡。
3.加入0.015ml 4x FVIIa，在室溫下輕晃孵育10min。
4.加入0.015ml 4x FX，在室溫下輕晃孵育5min。
5.加入0.14ml S2222底物，馬上將滴度板轉(zhuǎn)移到讀板器并在405nm每隔10秒鐘測(cè)定酶動(dòng)力學(xué)共15分鐘。
4.蛋白C活化檢測(cè)(在富含TF表面)按上述的顯色法蛋白C活化檢測(cè)法進(jìn)行本檢測(cè)，除了在本檢測(cè)中在添加凝血酶和蛋白C之前將含有人TF的PC/PS小泡添加到融合蛋白中。
實(shí)施例6抗TF抗體的特性從完整的人單鏈抗體噬菌體展示文庫(kù)中分離得到七種不同的TF結(jié)合抗體。用BIAcore測(cè)定的sTF結(jié)合抗體的親和力在35和470nM之間。用sTF/VIIa檢測(cè)確定抗體是否能阻斷活性VIIa/TF復(fù)合物的形成。在sTF/VIIa檢測(cè)中，VIIa與sTF的結(jié)合加快顯色肽底物S2266的裂解速率大于20倍。抑制FVIIa與TF結(jié)合的抗體阻斷了這種加速。在所分離到的七種不同的抗體中，它們中只有一種，scFv(TF)3e10不抑制sTF/VIIa檢測(cè)。該抗體增加了FVIIa與sTF的親和力，降低了KD5倍(圖1)。利用sTF/FVIIa檢測(cè)所測(cè)定的scFv(TF)3e10抗體對(duì)sTF的KD值為65.4nM(圖2)。用微量量熱法比較scFv(TF)3e10對(duì)TF及對(duì)FVIIa/TF復(fù)合物的親和力。這些試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗體對(duì)TF/FVIIa復(fù)合物的親和力是對(duì)游離sTF親和力的20倍(33nM對(duì)600nM，圖3)。用FX活化檢測(cè)比較抗體，它由磷脂小泡中的全長(zhǎng)TF、FVIIa和FX組成。用顯色底物S2765測(cè)定所生成的FXa的量。盡管scFv(TF)3e10抗體沒(méi)有BIAcore所測(cè)定的最高親和力以及它增加了FVIIa對(duì)sTF的親和力，但是它是這一組中唯一能抑制FX活化及在PT檢測(cè)中能延長(zhǎng)凝血時(shí)間的抗體。scFv(TF)3e10(二聚體)抗體在FX活化檢測(cè)中的抑制作用的IC50為0.44nM(圖4)并且在417nM時(shí)出現(xiàn)PT的2倍延長(zhǎng)(圖5)。
依照與重組人可溶性TF的結(jié)合鑒定scFv(TF)3e10抗體。人與鼠或人與兔之間TF的序列同源性分別為58％和71％?？贵w與人TF的獨(dú)特表位的結(jié)合干擾了FVIIa/TF復(fù)合物對(duì)FX的活化。生理上，該抗體具有優(yōu)于與FVII或FVIIa競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TF的抗體的優(yōu)點(diǎn)。人血漿中的FVII和FVIIa的KD為10nM，或比該KD高出100倍到1000倍之間。高親和復(fù)合物的脫離速率(off-rate)將是低的(70到700秒鐘，預(yù)期Kon＝108M-1sec-1)。相反，F(xiàn)X對(duì)VIIa/TF復(fù)合物的Km為0.200到4μM之間以及人血漿中的FX濃度為130nM(在0.03和0.65倍KD之間)。FVIIa/TF復(fù)合物在凝血上的主要功能是將FX轉(zhuǎn)化為FXa。
實(shí)施例7融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456的體外特性在多種體外檢測(cè)中評(píng)價(jià)了本發(fā)明的融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456的特性。融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456保留了抑制FVIIa/TF復(fù)合物活化FX的能力(IC50＝0.5nM，數(shù)據(jù)未示出)以及作為凝血酶催化的蛋白C的活化的輔因子(顯色檢測(cè)，圖6)。在缺少含TF的磷脂小泡時(shí)，在融合蛋白和單獨(dú)Tmi456之間沒(méi)有觀察到對(duì)TM的輔因子活性的顯著差異。相反，在存在含TF磷脂小泡時(shí)，融合蛋白但不是TMi456的TM輔因子活性增強(qiáng)了＞5倍(圖7)。融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456抗TF誘導(dǎo)的凝血(PT檢測(cè)、外源性凝血途徑)的體外效力比scFv(TF)3e10抗體高出6倍，比單獨(dú)TMi456高出17倍(圖5)。相反，融合蛋白抗內(nèi)源性和常見(jiàn)凝血途徑的體外效力不受顯著影響(APTT和TCT檢測(cè)，數(shù)據(jù)未示出)。因此，造成PT2倍延長(zhǎng)的融合蛋白的劑量對(duì)APTT只有輕微影響，而對(duì)PT有等價(jià)作用劑量的TMi456造成了APTT的4倍延長(zhǎng)(圖8)。這個(gè)體外數(shù)據(jù)與在血栓形成的動(dòng)物模型中所預(yù)期的TF/FVIIa定向抗凝劑的結(jié)果是一致的，已知該抗凝劑在出血率上有更好的作用。與基于血漿的凝血檢測(cè)一致，融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456比scFv(TF)3e10或單獨(dú)Tmi456在TF誘導(dǎo)的全血凝血檢測(cè)(thromboelastograph，TEG)中有著更強(qiáng)的作用(圖9)。另外，融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456比低分子量肝素(LMWH)在TF誘導(dǎo)的全血凝血檢測(cè)中有更多的預(yù)期的劑量效應(yīng)(圖10)。綜上，上述數(shù)據(jù)說(shuō)明本發(fā)明的融合蛋白在體外是有效的和選擇性的抗凝劑。
實(shí)施例8體內(nèi)大鼠血栓栓塞模型融合蛋白scFv(TF)3e10-TMi456的TF抗體部分特異于靈長(zhǎng)類(lèi)TF。在清醒的雄性Sprague-Dawley大鼠(350-400g，n＞7/組)上用人TF(含有人重組TF的組織促凝血酶原激酶試劑，Ortho)觸發(fā)形成血栓栓塞模型。在這個(gè)彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)模型中，通過(guò)組織促凝血酶原激酶注射，TF誘導(dǎo)了肺內(nèi)纖維素沉積、呼吸衰竭和死亡。將等摩爾量的scFv(TF)3e10-TMi456或scFv(TF)3e10或小泡注射到尾靜脈內(nèi)，15分鐘后丸式注射(bolus injection)組織促凝血酶原激酶(0.5ml/kg)。在載體(vehicle)治療組中，這種劑量的TF造成了60％的死亡率(LD60)，通常發(fā)生在組織促凝血酶原激酶注射后的5分鐘內(nèi)。根據(jù)下面的發(fā)病率-死亡率評(píng)分系統(tǒng)將大鼠評(píng)分0＝不受影響；1＝輕微呼吸窘迫(在30min內(nèi)恢復(fù))；2＝嚴(yán)重呼吸窘迫(垂死的，恢復(fù)需要超過(guò)60min)；以及3＝死亡。用平均分?jǐn)?shù)比較4組不同處理組的效果。在圖11中描述了利用這種體內(nèi)檢測(cè)方法的結(jié)果。本發(fā)明的融合蛋白在這個(gè)檢測(cè)中能抑制死亡和呼吸窘迫。
用通?；蛱厥饷枋龅姆磻?yīng)物和/或本發(fā)明的操作條件取代在上述實(shí)施例中所使用的反應(yīng)物和/或操作條件可以重復(fù)出具有相似成功率的上述實(shí)施例。
雖然本發(fā)明已經(jīng)被舉例說(shuō)明某些融合蛋白構(gòu)建體的生成，但顯而易見(jiàn)的是在不脫離本發(fā)明的精神和范圍時(shí)可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行變化和修飾。
序列表<110>舍林股份公司<120>作為抗凝劑的新的靶向組織因子的血栓調(diào)節(jié)蛋白融合蛋白<130>52295AUSM1<150>US 60/376,566<151>2002-05-01<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>282<212>PRT<213>Artificial<400>1Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val1 5 10 15Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu20 25 30Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe35 40 45Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys50 55 60Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr65 70 75 80Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser85 90 95Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr100 105 110Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp115 120 125Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135 140Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His145 150 155 160Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg
165 170 175Ser Ser Gly Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg180 185 190Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro195 200 205Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn210 215 220Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp225 230 235 240Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly245 250 255Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro260 265 270Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala275 280<210>2<211>418<212>PRT<213>Artificial<400>2Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val1 5 10 15Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu20 25 30Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe35 40 45Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys50 55 60Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr65 70 75 80Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser85 90 95Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr100 105 110Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp115 120 125Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135 140Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Pro Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His145 150 155 160
Ser Val Ser Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg165 170 175Ser Ser Gly Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg180 185 190Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro195 200 205Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn210 215 220Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp225 230 235 240Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly245 250 255Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser260 265 270Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro Val Asp Pro275 280 285Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr290 295 300Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu305 310 315 320Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp325 330 335Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile340 345 350Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly355 360 365Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys370 375 380Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gln Ile Gly Thr Asp Cys385 390 395 400Ala Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg405 410 415Ala Ala<210>3<211>397<212>PRT<213>Artificial<400>3Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val1 5 10 15
Phe Pro Glu Met Ala Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Thr Leu20 25 30Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe35 40 45Ser Phe Thr Asp Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys50 55 60Glu Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr65 70 75 80Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser85 90 95Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr100 105 110Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Trp115 120 125Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala130 135 140Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser145 150 155 160Ala Ser Pro Gly Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly165 170 175Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser180 185 190Ser Pro Thr Thr Val Ile Tyr Glu Asp Asn His Arg Pro Ser Gly Val195 200 205Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser210 215 220Leu Thr Ile Ser Gly Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys225 230 235 240Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Asn Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys245 250 255Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly260 265 270Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg275 280 285Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu290 295 300Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg305 310 315 320Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro325 330 335
Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp340 345 350Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys355 360 365Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly370 375 380Pro Asp Ser Ala Leu Ala Gly Gln Ile Gly Thr Asp Cys385 390 39權(quán)利要求
1.一種抗凝血融合蛋白，包括一種與組織因子(TF)或因子VIIa/TF(FVIIa/TF)復(fù)合物相互作用的靶向蛋白，該靶向蛋白被可操縱地連接到單獨(dú)的或組合有至少一種其它的TM結(jié)構(gòu)域的血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)EGF456結(jié)構(gòu)域或其類(lèi)似物、片段、衍生物或變體上，所述其它的TM結(jié)構(gòu)域選自由EGF3和EGF4之間的域間環(huán)、EGF123結(jié)構(gòu)域、O-連接的糖基化結(jié)構(gòu)域以及N末端疏水性區(qū)域結(jié)構(gòu)域或其類(lèi)似物、片段、衍生物或變體組成的組中。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中TM結(jié)構(gòu)域包括EGF3和EGF4之間的域間環(huán)。
3.權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述EGF456結(jié)構(gòu)域含有使得所述融合蛋白更耐受氧化損傷或蛋白酶活性或者增加所述融合蛋白的催化效率的點(diǎn)突變。
4.權(quán)利要求3的融合蛋白，其中所述EGF456結(jié)構(gòu)域含有至少一種選自由H381G、M388L、R456G和H457Q組成的組中的點(diǎn)突變。
5.權(quán)利要求4的融合蛋白，其中所述EGF456結(jié)構(gòu)域由在H381G、M388L、R456G和H457Q的點(diǎn)突變組成。
6.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述靶向蛋白是一種與TF結(jié)合的抗體。
7.權(quán)利要求6的融合蛋白，其中所述抗體是一種單克隆抗體。
8.權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述單克隆抗體與FVIIa/TF復(fù)合物結(jié)合比與單獨(dú)TF結(jié)合具有更高的親和力。
9.權(quán)利要求8的融合蛋白，其中所述單克隆抗體是一種單鏈抗體、Fab二聚體抗體或IgG抗體。
10.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述單克隆抗體是一種單鏈抗體。
11.權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述單克隆抗體被可操縱地連接到一個(gè)以上TM結(jié)構(gòu)域上。
12.權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述單克隆抗體中和TF。
13.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白是糖基化的。
14.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白通過(guò)添加聚乙二醇被修飾。
15.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白是生物素化的以結(jié)合鏈霉親和素。
16.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述靶向蛋白是FVIIai。
17.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述靶向蛋白是TFPI。
18.一種藥用組合物，包括權(quán)利要求1的融合蛋白，其中組合物包括藥用可接受的賦形劑以及治療有效量的所述融合蛋白。
19.一種預(yù)防血栓形成的方法，包括施用治療有效量的權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白抑制凝血酶的生成，但不直接影響其它的凝血參數(shù)，例如血小板的活化和聚集。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述方法預(yù)防缺血性卒中、血管成形術(shù)后的血栓性并發(fā)癥或微血管手術(shù)中的血栓形成。
21.一種預(yù)防和治療患者的深靜脈血栓形成(DVT)、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、急性冠脈綜合征、或具有凝血病表現(xiàn)的癌癥的方法，包括施用給所述患者治療有效量的權(quán)利要求1的融合蛋白。
22.一種用于調(diào)節(jié)患者的炎癥反應(yīng)的方法，包括施用給所述患者治療有效量的權(quán)利要求1的融合蛋白。
23.權(quán)利要求23的方法，其中所述炎癥反應(yīng)選自由膿毒癥、皮膚和靜脈移植以及器官移植組成的組中。
24.權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述融合蛋白可以被用于在醫(yī)療器械的表面形成非成血栓性包膜，其中所述醫(yī)療器械與血液接觸。
25.一種包括權(quán)利要求1的融合蛋白的試劑盒。
26.一種包括編碼權(quán)利要求1的融合蛋白成分的DNA序列的試劑盒。
27.一種基因治療組合物，包括編碼由SEQ ID NO2或SEQ IDNO3的氨基酸序列組成的融合蛋白的DNA，以及組合有治療有效量的基因治療載體。
28.一種抗凝血融合蛋白，包括與TF或FVIIa/TF復(fù)合物相互作用的靶向蛋白，其中所述靶向蛋白是一種與TF結(jié)合的單鏈抗體，它被可操縱地連接到TM EGF456結(jié)構(gòu)域和EGF3與EGF4之間的域間環(huán)，其中所述EGF456結(jié)構(gòu)域由在H381G、M388L、R456G和H457Q的點(diǎn)突變組成。
29.權(quán)利要求28的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ IDNO2或SEQ ID NO3的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的融合蛋白，其包含與組織因子(TF)結(jié)合的靶向蛋白，其可操縱地連接到單獨(dú)的或組合有至少一種其它的TM結(jié)構(gòu)域的血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)EGF456結(jié)構(gòu)域上，其它的TM結(jié)構(gòu)域選自由N末端疏水性區(qū)域結(jié)構(gòu)域、EGF123結(jié)構(gòu)域、EGF3和EGF4之間的域間環(huán)、O－糖基化的富含絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，或其類(lèi)似物、片段、衍生物或變體組成的組中。所述融合蛋白結(jié)合于損傷部位并阻止血栓形成的啟動(dòng)。所述融合蛋白可以用于治療多種血栓性病變，包括但不限于深靜脈血栓形成、彌漫性血管內(nèi)凝血以及急性冠脈綜合征。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1665526SQ03815702
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月1日
發(fā)明者戴維·萊特, 柯克·麥克萊恩 申請(qǐng)人:舍林股份公司