一種利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法。該方法包括：將500g黑木耳先冷水浸泡24小時，粉碎機粉碎后，水溶性或脂溶性提取黑木耳中的黑木耳多糖；以灌胃給藥方式，對實驗兔注入等量各實驗黑木耳多糖成份組飼養(yǎng)，連續(xù)2個月；體外觀察實驗兔的生理指標(biāo)；對實驗兔生理指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果均以(x±S)表示，組間比較采用t檢驗法，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。該方法利用黑木耳中的黑木耳多糖，通過實驗延長新西蘭兔特異性血栓及纖維蛋白血栓的形成時間，縮短體外血栓長度，并減輕血栓濕重和干重，降低血小板粘附率和血液粘度，并可明顯縮短優(yōu)球蛋白溶解時間，降低血槳纖維蛋白原含量，升高纖溶酶活性，具有明顯抗血栓形成的作用。
【專利說明】一種利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 眾所周知，所謂血栓，就是在活體的心臟或血管腔內(nèi)，血液發(fā)生凝固或血液中的某 些有形成分互相粘集，形成固體質(zhì)塊，在這個過程中所形成的固體質(zhì)塊稱為血栓。在生理狀 態(tài)下，血液中的凝血因子不斷地被激活，從而產(chǎn)生凝血酶，形成微量纖維蛋白，沉著于血管 內(nèi)膜上，但這些微量的纖維蛋白又不斷地被激活了的纖維蛋白溶解系統(tǒng)所溶解，同時被激 活的凝血因子也不斷地被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)所吞噬。上述凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)的 動態(tài)平衡，有時在某些能促進(jìn)凝血過程的因素作用下，打破動態(tài)平衡，觸發(fā)凝血過程，形成 血栓。
[0003] 對于血栓的影響如下：
[0004] (1)阻塞血管動脈血栓未完全阻塞管腔時，可引起局部器官缺血而萎縮，如完全阻 塞或引起必需的供血量不足而又缺乏有效的側(cè)支循環(huán)時，可引起局部器官的缺血性壞死。 如腦動脈血栓引起腦梗死、心冠狀動脈血栓引起心肌梗死，血栓閉塞性脈管炎引起患肢壞 疽等。靜脈血栓形成后，若未能建立有效的側(cè)支循環(huán)，則引起局部淤血、水腫、出血，甚至壞 死，如腸系膜靜脈血栓可導(dǎo)致出血性梗死。肢體淺表靜脈血栓，由于靜脈有豐富的側(cè)支循 環(huán)，通常不引起臨床癥狀。
[0005] (2)栓塞。在血栓未和血管壁牢固粘著之前，血栓的整體或部分可以脫落，形成栓 子，隨血流運行，引起栓塞。如栓子內(nèi)含著細(xì)菌，可引起栓塞組織的敗血性梗死或栓塞性膿 腫。
[0006] ( 3 )心瓣膜變形。心瓣膜血栓機化，可引起瓣膜粘連，造成瓣膜狹窄，如在機化過程 中纖維組織增生而后瘢痕收縮，可造成瓣膜關(guān)閉不全，見于風(fēng)濕性心內(nèi)膜炎和亞急性細(xì)菌 性心內(nèi)膜炎。
[0007] (4)微循環(huán)的廣泛性微血栓形成，即DIC，可引起全身性廣泛出血和休克。
[0008] 目前主要的抗血栓藥物有阿司匹林，它能夠抑制血小板聚集，用于預(yù)防和治療缺 血性心臟病、心絞痛、心肺梗塞、腦血栓形成，應(yīng)用于血管形成術(shù)及旁路移植術(shù)也有效。但是 隨著普及，不良反應(yīng)也逐漸增多：胃腸道癥狀，過敏反應(yīng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，肝損害，腎損害，對 血液的影響，心臟毒性，瑞士綜合癥等。有鑒于此，我們發(fā)明了 一種利用黑木耳來防治血栓 的實現(xiàn)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0009] 鑒于上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法。該方法 利用黑木耳中的黑木耳多糖，通過實驗延長新西蘭兔特異性血栓及纖維蛋白血栓的形成時 間，縮短體外血栓長度，并減輕血栓濕重和干重，降低血小板粘附率和血液粘度，并可明顯 縮短優(yōu)球蛋白溶解時間，降低血槳纖維蛋白原含量，升高纖溶酶活性，具有明顯抗血栓形成 的作用。
[0010] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0011] 一種利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法，該方法包括：
[0012] (1)將500g黑木耳先冷水浸泡24小時，粉碎機粉碎后，水溶性或脂溶性提取黑木 耳中的黑木耳多糖；
[0013] (2)將實驗用的兔齡為2歲的新西蘭大白兔進(jìn)行高脂喂養(yǎng)，使得該實驗兔血清總 膽固醇達(dá)到6. 5mMol / L，高密度脂蛋白（HDL)達(dá)到6. Og / L以上；
[0014] (3)以灌胃給藥方式，對實驗兔注入等量各實驗黑木耳多糖成份組飼養(yǎng)，連續(xù)2個 月；
[0015] (4)體外觀察實驗兔的生理指標(biāo)；
[0016] (5)對實驗兔生理指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果均以（X土S)表示，組間比較采用t檢驗 法，P〈〇. 05具有統(tǒng)計學(xué)差異。
[0017] 上述方案中，所述水溶性提取黑木耳中的黑木耳多糖的具體過程為：稱取黑木耳 500g，絞碎后加入水浸泡20min，于90°C攪拌6小時，離心，取上清液，濃縮至黏稠，加入95% 乙醇攪拌，離心，取沉淀，加入無水乙醇洗滌，離心，取沉淀，70°C烘箱內(nèi)干燥，即得粗多糖， 等量分裝，備用。
[0018] 上述方案中，所述脂溶性提取黑木耳中的黑木耳多糖的具體過程為：取黑木耳 5〇〇g用粉碎機粉碎，裝入燒瓶中，先用石油醚90°C回流提取2小時，重復(fù)2次，抽濾后，減壓 濃縮得浸膏，再用氯仿、甲醇按上述過程進(jìn)行回流提取，減壓濃縮后，分別得到浸膏。將甲醇 層浸膏，經(jīng)常壓硅膠柱層析，凝膠柱層析SephadexLH-20,反復(fù)柱層析，重結(jié)晶法，得到3種 化合物，等量分裝，備用。
[0019] 上述方案中，所述體外觀察實驗兔的生理指標(biāo)包括血栓長度和血栓濕重：具體過 程是將實驗兔于末次給藥后2小時，用普魯卡因局麻，頸動脈插管放血2. OmL，加入盛有 0. 2mL，濃度3. 8 %枸櫞酸鈉抗凝劑的硅化試管中，混勻，血液置25 °C水浴待用。在體外模擬 狀態(tài)下，在血栓檢測裝置中形成血栓，用濾紙吸去水份，卡尺測定血栓長度，用分析天平秤 血栓的濕重。
[0020] 上述方案中，所述體外觀察實驗兔的生理指標(biāo)包括全血黏度和血漿黏度測定：具 體過程是先用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)式粘度計，測全血黏度。再將全血以3000r / min，離心IOmin 后，取血漿，然后再用旋轉(zhuǎn)式粘度計測血漿粘度。
[0021] 上述方案中，所述體外觀察實驗兔的生理指標(biāo)還包括血小板計數(shù)（PLT)、血小板聚 集率（％)、凝血酶原時間（PT)、活化部分凝血活酶時間（APTT)、甘油三脂（TG)、血清總膽固 醇（Ch )、高密度脂蛋白（HDL)，動物血管解剖等這些參數(shù)。
[0022] 本發(fā)明所述方法，通過兔子實驗，證明黑木耳多糖可顯著延長，縮短體外血栓長 度，并減輕血栓濕重，降低血栓形成的百分率，且可顯著降低高切變率全血的黏度，從而提 示黑木耳多糖有一定的抗血栓形成的作用，對防治某些心腦血管栓塞性疾病有重要意義。 黑木耳多糖可明顯延長家兔特異性血栓及纖維蛋白血栓的形成時間，使血栓長度縮短，減 輕血栓濕重和干重，減少血小板數(shù)，降低血小板粘附率和血液粘度，并可明顯縮短豚鼠優(yōu)球 蛋白溶解時間，降低血槳纖維蛋白原含量，升高纖溶酶活性，具有明顯抗血栓形成的作用。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0023] 以下結(jié)合附圖和【具體實施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0024] 圖1為本發(fā)明方法對于不同劑量黑木耳對抗血栓效果的比較的流程圖。
[0025] 圖2為本發(fā)明方法對于最適劑量條件下不同成份提取物對抗血栓效果的觀察的 流程圖。

【具體實施方式】：
[0026] 為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0027] 本發(fā)明方法具體實現(xiàn)過程包括以下幾部分：
[0028] 一、材料與儀器
[0029] 1.實驗用黑木耳：購自超市3Kg，經(jīng)鑒定為木耳科木耳屬黑木耳 Auriculariaauircular 子實體。
[0030] 2.實驗用雄性新西蘭大白兔購自上海醫(yī)學(xué)研究所動物中心，兔齡2歲，體重 (1. 8 - 2. 0) Kg,，身體健康、體溫正常。動物實驗條件：溫度（22±2) °C，濕度50%?70%， 光照：150?200Lx，12h明暗交替，噪音<50dB，屏障系統(tǒng)溫度、濕度、光照、壓力梯度等設(shè)有 自動控制和顯示系統(tǒng)。自來水均過濾滅菌，置于高壓滅菌的飲水瓶中自由飲用。
[0031] 高脂血癥兔模型(血清總膽固醇大于6. 50mMol / L，高密度脂蛋白大于6. OOg / L):滅菌高脂兔全價營養(yǎng)顆粒飼料，自由采食2個。經(jīng)檢測血液個觀察指標(biāo)與解剖觀察冠狀 動脈、頸動脈證實已達(dá)到高脂血癥標(biāo)準(zhǔn)，再均衡分組，在日常高脂兔全價營養(yǎng)顆粒飼養(yǎng)的基 礎(chǔ)上加入實驗黑木耳各組分，再飼養(yǎng)2個月，取血檢測各觀察指標(biāo)及解剖觀察兔冠狀動脈、 頸動脈的血管脈粥樣硬化狀況與程度。
[0032] 3儀器：血栓檢測儀，分析天平，旋轉(zhuǎn)式粘度計，柱層析硅膠、薄層層析硅膠；所用 實驗用試劑均為分析純。
[0033] 二、實驗步驟：
[0034] 1?黑木耳成份的提取與分組：
[0035] ( 1)全效黑木耳粉末組：
[0036] 取黑木耳500g，冷水浸泡24h，粉碎機粉碎，等量分裝，伴入兔食料中。
[0037] (2)黑木耳多糖提取(水溶性組）；
[0038] 稱取黑木耳500g，絞碎后加入水浸泡20min，于90°C攪拌6h，離心，取上清液，濃縮 至黏稠，加入95%乙醇攪拌，離心，取沉淀，加入無水乙醇洗滌，離心，取沉淀，70°C烘箱內(nèi)干 燥，即得粗多糖，等量分裝，備用。
[0039] (3)黑木耳有機成份的提取與分離(脂溶性組）：
[0040] 取黑木耳500g用粉碎機粉碎，裝入燒瓶中，先用石油醚90°C回流提取2h，重復(fù)2 次，抽濾后，減壓濃縮得浸膏，再用氯仿、甲醇按上述過程進(jìn)行回流提取，減壓濃縮后，分別 得到浸膏。將甲醇層浸膏，經(jīng)常壓硅膠柱層析，凝膠柱層析SephadexLH-20,反復(fù)柱層析，重 結(jié)晶法，得到3種化合物，分別得A、B....等物質(zhì)，等量分裝，備用。
[0041] 2?動物準(zhǔn)備與實驗；
[0042] (1)購買動物實驗型新西蘭大白兔兔齡2歲，體重I. 8-2Kg，，身體健康、體溫正 堂 巾。
[0043] (2)高脂血癥兔動物模型制造：高脂喂養(yǎng)，血清總膽固醇達(dá)到6. 5mMol / L，高密度 脂蛋白（HDL)達(dá)到6. Og / L以上。高脂飼料購自。
[0044] (3)在高脂血癥兔動物模型上，依據(jù)觀察指標(biāo)數(shù)據(jù)，進(jìn)行均衡分配至各組，特殊狀 況與異常數(shù)據(jù)動物剔除。
[0045] (4)除對照組正常飼養(yǎng)外，各實驗組動物均以灌胃給藥方式，注入等量各實驗黑木 耳成份組飼養(yǎng)，連續(xù)2個月。
[0046] (5)于末次給藥后2h，將兔背位固定于手術(shù)臺上，用鹽酸普魯卡因局部麻醉，分離 一側(cè)頸總動脈并作頸總動脈插管，自頸總動脈取血實驗。各實驗組分別隨機抽取3只兔解 剖，觀察兔冠狀動脈、頸動脈的血管脈粥樣硬化狀況與程度。
[0047] 3體外各實驗兔觀察指標(biāo)：
[0048] (1)血栓長度、血栓濕重：將實驗兔于末次給藥后2h，用普魯卡因局麻，頸動脈插 管放血2. OmL，加入盛有0. 2mL，濃度3. 8 %枸櫞酸鈉抗凝劑的硅化試管中，混勻，血液置 25°C水浴待用。在體外模擬狀態(tài)下，在血栓檢測裝置中形成血栓，用濾紙吸去水份，卡尺測 定血栓長度，用分析天平秤血栓的濕重。
[0049] (2)全血黏度、血漿黏度測定：先用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)式粘度計，測全血黏度。再將全 血以3000r / min,離心IOmin后，取血楽，然后再用旋轉(zhuǎn)式粘度計測血楽粘度。
[0050] 其他檢測項目：血小板計數(shù)（PLT)、血小板聚集率（％)、凝血酶原時間（PT)、活化部 分凝血活酶時間（APTT)、甘油三脂（TG)、血清總膽固醇（Ch)、高密度脂蛋白（HDL)，動物血 管解剖等，這些指標(biāo)通過檢測，并以實驗報告形式匯報。
[0051] 4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法；
[0052] 結(jié)果均以（X土 S)表示，組間比較采用t檢驗法，P〈0. 05具有統(tǒng)計學(xué)差異。
[0053] 如圖1所示，該流程圖是為了通過實驗尋找黑木耳對抗血栓效果的最佳劑量。圖 中，I 組劑量：100 (mg/Kg/ 天）；II組劑量：200 (mg/Kg/ 天）JII組劑量：500 (mg/Kg/ 天）； IV組劑量：1000 (mg/Kg/天）；V組：高脂飲食對照組(未加黑木耳成份)。
[0054] 觀察指標(biāo)：
[0055] 1.血栓狀態(tài)評估指標(biāo)：血栓長度、血栓濕重、全血黏滯度、血漿黏滯度。
[0056] 2.凝血狀態(tài)評估指標(biāo)：血小板計數(shù)（PLT)、血小板聚集率、凝血酶原時間（PT)、活 化部分凝血活酶時間（APTT)。
[0057] 3.血脂代謝評估指標(biāo)：甘油三脂（TG)、血清總膽固醇（Ch)、高密度脂蛋白（HDL)。
[0058] 4.血管動脈粥樣硬化：解剖觀察兔冠狀動脈、頸動脈的血管脈粥樣硬化狀況與程 度。
[0059] 實驗結(jié)果參見如下表1，不同劑量全效黑木耳粉對抗血栓效果的比較(尋找最佳劑 量)。
[0060]

【權(quán)利要求】
1. 一種利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法，該方法包括： (1) 將500g黑木耳先冷水浸泡24小時，粉碎機粉碎后，水溶性或脂溶性提取黑木耳中 的黑木耳多糖； (2) 將實驗用的兔齡為2歲的新西蘭大白兔進(jìn)行高脂喂養(yǎng)，使得該實驗兔血清總膽固 醇達(dá)到6. 5mMol / L，高密度脂蛋白（HDL)達(dá)到6. Og / L以上； (3) 以灌胃給藥方式，對實驗兔注入等量各實驗黑木耳多糖成份組飼養(yǎng)，連續(xù)2個月； (4) 體外觀察實驗兔的生理指標(biāo)； (5) 對實驗兔生理指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果均以（x土S)表示，組間比較采用t檢驗法， P〈0. 05具有統(tǒng)計學(xué)差異。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法，其特征在于，所述水溶性提取 黑木耳中的黑木耳多糖的具體過程為：稱取黑木耳500g，絞碎后加入水浸泡20min，于90°C 攪拌6小時，離心，取上清液，濃縮至黏稠，加入95%乙醇攪拌，離心，取沉淀，加入無水乙醇 洗滌，離心，取沉淀，70°C烘箱內(nèi)干燥，即得粗多糖，等量分裝，備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法，其特征在于，所述脂溶性提取 黑木耳中的黑木耳多糖的具體過程為：取黑木耳500g用粉碎機粉碎，裝入燒瓶中，先用石 油醚90°C回流提取2小時，重復(fù)2次，抽濾后，減壓濃縮得浸膏，再用氯仿、甲醇按上述過程 進(jìn)行回流提取，減壓濃縮后，分別得到浸膏。將甲醇層浸膏，經(jīng)常壓硅膠柱層析，凝膠柱層析 SephadexLH-20,反復(fù)柱層析，重結(jié)晶法，得到3種化合物，等量分裝，備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法，其特征在于，所述體外觀察實 驗兔的生理指標(biāo)包括血栓長度和血栓濕重：具體過程是將實驗兔于末次給藥后2小時，用 普魯卡因局麻，頸動脈插管放血2. OmL，加入盛有0. 2mL，濃度3. 8%枸櫞酸鈉抗凝劑的硅化 試管中，混勻，血液置25°C水浴待用。在體外模擬狀態(tài)下，在血栓檢測裝置中形成血栓，用濾 紙吸去水份，卡尺測定血栓長度，用分析天平秤血栓的濕重。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法，其特征在于，所述體外觀察實 驗兔的生理指標(biāo)包括全血黏度和血漿黏度測定：具體過程是先用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)式粘度計， 測全血黏度。再將全血以3000r / min,離心lOmin后，取血楽，然后再用旋轉(zhuǎn)式粘度計測血 漿粘度。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的利用黑木耳防治血栓的實現(xiàn)方法，其特征在于，所述體外觀察實 驗兔的生理指標(biāo)還包括血小板計數(shù)、血小板聚集率、凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時 間、甘油三脂、血清總膽固醇、高密度脂蛋白，動物血管解剖這些參數(shù)。
【文檔編號】A61P7/02GK104415048SQ201310363145
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】柳弈誠 申請人:上海市建青實驗學(xué)校