專利名稱：由粗水解產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的合同來源依照美國能源部和代表Argonne國家實驗室的芝加哥大學之間的合同號W-31-109-ENG-38，美國政府對本發(fā)明享有權(quán)益。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵方法，更具體地，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生能利用多種糖生產(chǎn)以琥珀酸為主要發(fā)酵產(chǎn)物的細菌菌株的方法。
2.發(fā)明背景羧酸有希望作為許多化學品的潛在前體。例如，琥珀酸可以作為塑料前體如1，4-丁二醇(BDO)，四氫呋喃，和γ-丁酸丙酮的原料。由琥珀酸衍生的新產(chǎn)品正在發(fā)展中，其中最著名的是琥珀酸和BDO連接制成的聚酯。一般地，琥珀酸的酯有潛力成為新的、“綠色”溶劑，其能代替更有毒的溶劑。整體上，琥珀酸可作為每年數(shù)百萬磅的化學品的前體，市場總價值超過十億。如同琥珀酸，其他4-碳二羧酸，如蘋果酸和富馬酸也有作為原料的潛力。
由可再生的原料(在本情形中通過發(fā)酵方法)生產(chǎn)這些羧酸是替代由不可再生來源獲得這些羧酸的更能源密集方法的一種途徑。琥珀酸鹽是通過丙酸鹽生產(chǎn)細菌壓氧發(fā)酵的中間產(chǎn)物，但那些方法導(dǎo)致低產(chǎn)率和濃度。
厭氧瘤胃細菌，例如棲瘤胃擬桿菌(Bateroides ruminicola)，嗜淀粉擬桿菌(Bacteroides amylophilus)也產(chǎn)生琥珀酸鹽。然而，但是瘤胃生物的特征是在發(fā)酵過程中不穩(wěn)定。
很久以來就已知大腸桿菌發(fā)酵能產(chǎn)生混合酸，如在Stokes，J.L.1949“大腸桿菌懸浮液對葡萄糖的發(fā)酵(Fermentation of glucose by suspensionsof Escherichia coli)”J.Bacteriol.57147-158所詳述的。但是，每發(fā)酵1mol葡萄糖，只產(chǎn)生1.2mol甲酸，0.1-0.2mol乳酸和0.3-0.4mol的琥珀酸。同樣地，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生羧酸的努力導(dǎo)致相對大量的生長底物如葡萄糖不會轉(zhuǎn)化成目的產(chǎn)物。
一些細菌，如A.succiniciproducens，如在Glassner等的美國專利No.5,143,834概述的，在發(fā)酵過程中利用，在中等升數(shù)中天然產(chǎn)生的琥珀酸只達到每升約35-40克(g/L)。宿主菌株A.succiniciproducens不能忍受高濃度鹽而進一步被中等濃度產(chǎn)物抑制，顯示其不是高度耐滲透的。最后，A.succiniciproducens存在操作問題，因為作為專性厭氧菌，使用該生物的方法必須在缺氧下進行。此外，接種物的培養(yǎng)基制備要求加入色氨酸。
本發(fā)明人在生產(chǎn)琥珀酸上的先前努力導(dǎo)致分離和利用突變的細菌。可作為ATCC登記號202021獲得的突變株，是美國專利重新頒發(fā)申請No.09/429,693的主題。重新頒發(fā)的申請No.09/429,693，其通過參考結(jié)合于此，教導(dǎo)了一株生產(chǎn)琥珀酸的細菌菌株(AFP111)，它能夠從其前體自發(fā)突變。突變株能在葡萄糖上發(fā)酵生長，高產(chǎn)率地生產(chǎn)琥珀酸，而其前體不能。但是，利用生產(chǎn)琥珀酸的這種方法，其明顯缺陷是限于單一突變株。
本發(fā)明人的其他努力(美國專利No.6,159,738)導(dǎo)致構(gòu)建具有增加的琥珀酸產(chǎn)量的細菌菌株的方法。此方法教導(dǎo)了大腸桿菌磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的改變，引起菌體產(chǎn)生更多琥珀酸。該方法缺陷是限于單一改變。
本領(lǐng)域內(nèi)存在對發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法的需求，此方法不歸于單一的突變株或基因。該方法應(yīng)能用于任何具有特定的和容易確定的基因型的生物。該方法應(yīng)能在相對惰性的條件下使用強壯的生物(即具有高反饋抑制閾值的那些)實施，并以此來避免對復(fù)雜的環(huán)境控制測量的需要。此方法應(yīng)能利用木質(zhì)素纖維素材料水解作用衍生的糖混合物產(chǎn)生優(yōu)越的結(jié)果，因為這些底物提供便宜的糖來源，因此它們的使用能降低琥珀酸的生產(chǎn)成本。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種生產(chǎn)琥珀酸的方法，以此克服現(xiàn)有技術(shù)的許多缺點。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)高產(chǎn)率琥珀酸的發(fā)酵工藝。本發(fā)明的特征是利用含有多個突變基因的細菌基因組以實施該方法。本發(fā)明的一個優(yōu)勢是細菌易被操作以產(chǎn)生多個突變株。備選地，可利用已含有多個突變的細菌而不必進一步操作。
本發(fā)明還有另一個目的是提供操作細菌以生產(chǎn)大量的琥珀酸的方法。本發(fā)明的一個特征是破壞細菌內(nèi)糖代謝的正常調(diào)節(jié)。本發(fā)明的一個優(yōu)勢是能夠操作各種各樣的細菌，在生產(chǎn)琥珀酸發(fā)酵工藝中實現(xiàn)相對高的產(chǎn)物對生長底物的比率(例如1∶1或高于此)。本發(fā)明地另一優(yōu)勢是能夠利用成為葡萄糖代謝者和非葡萄糖代謝者的細菌。
本發(fā)明還有另一目的是發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸。本發(fā)明的一個特征是利用含有改變的磷酸轉(zhuǎn)移酶(pts)系統(tǒng)，丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)系統(tǒng)和乳酸脫氫酶(ldh)系統(tǒng)的細菌。本發(fā)明的一個優(yōu)勢是細菌可衍生于使用這些酶系統(tǒng)發(fā)酵糖的許多種屬。
簡明地，提供從工業(yè)級水解產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸的方法，該方法包括提供含有基因ptsG，pflB，和ldhA突變的生物；允許所述生物積累生物量；并允許所述生物代謝水解產(chǎn)物。
還提供細菌突變株，其特征在于它從包含于工業(yè)級水解產(chǎn)物中的底物生產(chǎn)琥珀酸，琥珀酸與底物的比率介于0.6∶1至1.3∶1之間(例如，每克消耗總糖產(chǎn)生的琥珀酸在0.6克至1.3克之間)。
附圖簡述由下述圖示本發(fā)明實施方案的詳細描述，可最好地理解本發(fā)明連同上述及其他的目的和優(yōu)勢。其中

圖1是表示用突變基因轉(zhuǎn)化細菌后增強的琥珀酸生產(chǎn)的圖表，其與本發(fā)明的特征一致；圖2是表示通過三重突變生物的工業(yè)水解產(chǎn)物的發(fā)酵的圖表，其與本發(fā)明的特征一致；和圖3是表示通過三重突變生物的合成糖發(fā)酵的圖表，其與本發(fā)明的特征一致。
發(fā)明詳述本發(fā)明人已開發(fā)了發(fā)酵生產(chǎn)高產(chǎn)率琥珀酸的方法。該方法利用所選生物改變的分解代謝物產(chǎn)物阻遏機制，以允許該生物利用葡萄糖和非葡萄糖原料的混合物生產(chǎn)琥珀酸。
得到的突變株和方案使琥珀酸與原料的比率高達1.3∶1，典型地0.9∶1。琥珀酸鹽的積累達到60g/L到75g/L之間。典型方案的持續(xù)時間超過70小時，通常在120至170小時之間。例如160小時后獲得產(chǎn)率為70g/L。該工藝在從約25℃至45℃之間是可行的，優(yōu)選范圍為約30℃到39℃之間。PH為5至9之間是合適的，更優(yōu)選范圍約是6.1至7.2。
本發(fā)明的突變株是發(fā)酵方案中特別有活力的組分，因為它們具有對發(fā)酵產(chǎn)物的增強的耐受性。例如，可以實現(xiàn)濃度為72g/L的琥珀酸，22g/L的乙酸鹽，14g/L的乙醇，8g/L的乳酸鹽而不誘導(dǎo)反饋抑制。
原料詳述本發(fā)明的方法和突變株的一個顯著特征是直接利用工業(yè)原料。可利用多種原料，包括但不限于淡浸漬水，以各種水解方法生產(chǎn)的木質(zhì)素纖維素水解產(chǎn)物，來源于玉米的(corn-derived)糖溶液(例如玉米漿)，源自乳清的乳糖及其他工業(yè)級的糖。例如，經(jīng)濃酸水解作用、或稀酸水解、酶水解生產(chǎn)的木質(zhì)素纖維素水解產(chǎn)物，或通過這些方法的組合生產(chǎn)的水解物都是適合的。來源于玉米的糖溶液也適用。
一般地，工業(yè)原料是葡萄糖和其他的糖的混合物，最常規(guī)的非葡萄糖的糖是木糖。圖2描述了本發(fā)明突變株之一利用葡萄糖和木糖。
綜上所述，任何含有葡萄糖和/或非葡萄糖的糖原料都適用。同樣，包含葡萄糖，山梨糖醇，木糖，阿拉伯糖，甘露糖，乳糖，葡糖醛酸，半乳糖，果糖及其組合是適當?shù)摹?br> 生物詳述本發(fā)明的方法利用含有生物分解代謝產(chǎn)物阻遏系統(tǒng)改變的生物。具體地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當細菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶(pts)系統(tǒng)，丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)系統(tǒng)和乳酸脫氫酶(ldh)系統(tǒng)存在改變時，這些細菌適合用于本發(fā)明的琥珀酸生產(chǎn)工藝。pflAB和ldhA分別是編碼丙酮酸甲酸裂解酶和發(fā)酵的乳酸脫氫酶的基因。
因此，對于用于本發(fā)明發(fā)酵工藝的生物類型的唯一限制是該生物最初必須有這些系統(tǒng)。天然含有這些系統(tǒng)改變的生物(例如自發(fā)突變株)或特定改造的生物都可使用。
在細菌是被改造的情形中，沒有或有很低的琥珀酸生產(chǎn)產(chǎn)率(例如，供給每1mol生長底物產(chǎn)率低于0.5mol)發(fā)酵的細菌被轉(zhuǎn)化成具有高琥珀酸生產(chǎn)產(chǎn)率的細菌(即供給每1mol生長底物產(chǎn)率等于或高于1mol琥珀酸)。
任何能進行任何琥珀酸發(fā)酵的細菌尤為適合作為轉(zhuǎn)導(dǎo)候選菌，包括但不限于發(fā)酵性的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌。優(yōu)選地，適合的菌株包括但不限于大腸桿菌屬(Escherichia coli)，克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)，歐氏桿菌屬(Erwinia)和乳桿菌屬(Lactobacillus)。
要經(jīng)改造以包括三個剔除(knockout)的生物，是通過使用噬菌體P1的一系列轉(zhuǎn)導(dǎo)來改變?？衫脴藴实腜1轉(zhuǎn)導(dǎo)方案，一種典型的方案在1972年J.H.Miller編輯的分子遺傳學實驗(Experiments in Molecular Genetics)(冷泉港實驗室，冷泉港，N.Y.)中公開，其通過參考結(jié)合于此。利用該方法，野生型或近野生型細菌菌株(例如大腸桿菌C600菌株；ATCC登記號23724)可用于產(chǎn)生缺少選自pfl，ldh，ptsG中的一個，兩個或三個功能基因的突變次代菌株。
可用于本發(fā)明的含有三個突變的大腸桿菌菌株實例之一被命名為AFP184(AFP＝備選的原料程序，Alternative Feedstock Program)。AFP 184有pfl缺失，ldh剔除，及有意插入近野生型大腸桿菌菌株的ptsG的不同突變形式。另一被稱為AFP 415的菌株也可使用。AFP415與AFP184唯一不同之處在于具有ptsG剔除。它表現(xiàn)類似于AFP184。
發(fā)明人吃驚地，出乎意料地發(fā)現(xiàn)AFP184和AFP415的代謝率和效價優(yōu)于美國專利Nos.5,770,435(現(xiàn)在重新頒發(fā)申請?zhí)?9/429,693)和6,159,738公開的W1485衍生株。
表1提供了AFP184和W1485衍生株(AFP111)琥珀酸產(chǎn)量的比較。值得注意的是雖然W1485衍生株利用非常精制的原料，AFP184仍能以工業(yè)級水解產(chǎn)物提供更高的值。
使用已含有一個或兩個遺傳異常的細菌，然后誘導(dǎo)剩下的剔除，也能產(chǎn)生包含所有三個剔除的突變株。在該情形中，可行的起始生物是W1485，ATCC登記號12435。AFP400是有意制成的三重剔除。它包含通過AugustBock的pfl缺失，由伊利諾斯大學的David Clark插入W1485產(chǎn)生FMJ123。依照見于P.K.Bunch等(1997)Microbiology 143，187-195的方案產(chǎn)生FMJ123，其通過參考結(jié)合于此。AFP400還包括ldhA剔除，也由Clark完成并插入FMJ123產(chǎn)生DC1327。DC1327的產(chǎn)生依照見于Chatterjee等，Appl.Environ.Microbiol.67，pp148-154的方案，其通過參考結(jié)合于此。如Chatterjee參考文獻所述，AFP400含有ptsG剔除。
表1通過不同譜系的大腸桿菌的琥珀酸生產(chǎn)的比較
通過將三個剔除引入菌株C600也可構(gòu)建三重剔除AFP404。AFP404與AFP184相類似，只是剔除了ptsG而不是該基因的點突變。它也可以約1mol/mol葡萄糖的產(chǎn)率生產(chǎn)琥珀酸。
從野生型菌株發(fā)展三重突變的方案也見于R.Chatterjee等。典型的顯示每個剔除存在的抗生素標記包括但不限于氯霉素，四環(huán)霉素，和卡那霉素。如此產(chǎn)生了新的含有剔除和抗生素標記的大腸桿菌菌株AFP400和AFP404。該方案如下構(gòu)建并導(dǎo)入插入失活的ptsG基因使用靶向蛋白質(zhì)的N-和C-末端的引物，由從W1485制備的基因組DNA通過PCR克隆大腸桿菌的天然ptsG基因，未擴增另外的基因組序列。將此基因克隆到載體pFJ118EH得到pJFptsG。通過將用EcoRI切除的pUC-4K(Pharmacia)的卡那霉素抗性盒插入pJFptsG內(nèi)的ptsG基因的MfeI位點得到質(zhì)粒pTSGK。由于NZN111已經(jīng)包括卡那霉素抗性標記，通過將來自菌株SE1752的Tn10-失活的ldhA基因?qū)隖MJ123構(gòu)建等價菌株。獲得的菌株，DC1327，與NZN111在生理上不能辨別。通過用pTSGK轉(zhuǎn)化細胞，將破壞的ptsG基因轉(zhuǎn)入DC1327，在有卡那霉素，無氨芐青霉素下培養(yǎng)細胞約30代，然后在有葡萄糖的LB平板上涂布培養(yǎng)物并厭氧溫育。純化能發(fā)酵生長的菌落，篩選它們對兩種抗生素的敏感性。
作為穩(wěn)定的抗卡那霉素、氨芐青霉素敏感型菌株，分離菌株AFP400，其發(fā)酵葡萄糖生成琥珀酸鹽，乙酸鹽和乙醇。通過PCR驗證已破壞的ptsG基因的適當整合。用與基因編碼區(qū)域外約110堿基對旁側(cè)序列相匹配的引物，從AFP400的DNA擴增破壞的基因。在整合載體中不存在這些序列。得到的產(chǎn)物大小為3.0kb，如從已知ptsG序列、其旁側(cè)區(qū)域和卡那霉素插入片斷所預(yù)知的。用ClaI(卡那霉素盒內(nèi)的位點)和AgeI(ptsG內(nèi)位點)消化產(chǎn)物，產(chǎn)生了預(yù)期的將盒插入ptsG的MfeI位點的片斷(對于ClaI為1.95和1.05kb，對于Agel為2.3和0.7kb)。
用上述同樣的方案，從大腸桿菌K12近野生型菌株C600衍生出的另一菌株AFP404，也包含三個剔除。
從上面討論的本發(fā)明人的前期研究(美國專利No.6,159,738和Chatteriee等)可已知剔除的位置。通過放入有抗生素標記的剔除基因一個拷貝，將剔除導(dǎo)入細胞。允許其發(fā)生同源重組，如通過宿主酶促進。然后選擇包含標記的染色體。ptsG剔除即以該途徑導(dǎo)入。通過PCR驗證其插入，詳見前已通過參考結(jié)合于此的Chatterjee等。
生長詳述本發(fā)明人制備的三重突變生物不是專性厭氧的。因此，早期生物量積累可在好氧條件發(fā)生，之后建立發(fā)酵條件。兩階段工藝的優(yōu)勢(即有氧然后無氧)如圖2所示，和圖1一階段厭氧方案的生長曲線相比，其中的琥珀酸的生產(chǎn)率大得多。
一般地，當生物量達到平衡點每毫升約108到1011個細胞(或每升約2-5克細胞干重)時，使發(fā)酵罐成為厭氧的。實驗室里大約是六小時后達到該濃度點。
在工業(yè)方案中，將淡浸漬水加木質(zhì)素纖維素水解物裝入發(fā)酵罐。包括必需的抗生素，其濃度如下100μg/ml羧芐青霉素，30μg/ml卡那霉素，10μg/ml四環(huán)霉素和30μg/ml氯霉素。加富肉湯含有(每升)10克胰蛋白胨，5克氯化鈉和1克酵母粉。平板固體培養(yǎng)基包含1.5％(wt/vol)Difco Bacto-瓊脂。根據(jù)Vogel，H.J.1956 Acetylornithinase in E.coli，Biol.Chem.21897-103的描述制備基本培養(yǎng)基E，其通過參考結(jié)合于此。
發(fā)酵的實驗室條件如下在含有10ml LB培養(yǎng)基的密閉的血清管中，補充0.5g MgCO3(加入以維持發(fā)酵期間培養(yǎng)基的pH)，抗生素，和約10g/L葡萄糖實施發(fā)酵生長?？梢允褂酶鞣N生長底物，包括但不限于糖，糖醇，糖酸及其組合。在厭氧生長中，以下述糖替代葡萄糖進行檢驗，其濃度為5g/L海藻糖，甘露糖，果糖，山梨糖醇和葡糖醛酸。
通過在補充有抗生素的LB培養(yǎng)基中過夜好氧培養(yǎng)菌株制備厭氧液體培養(yǎng)物的接種物。將過夜培養(yǎng)物的樣品在新鮮培養(yǎng)基中稀釋100倍，并使得好氧生長至A600為約1；用1ml接種物對厭氧培養(yǎng)基接種。
在適當時間無氧地從密封管中取樣以分析剩余的葡萄糖(或備選的糖底物)和形成的發(fā)酵產(chǎn)物的水平。為了在固體培養(yǎng)基上厭氧生長，將瓊脂平板在37℃下，在通過使用Gas-Pak產(chǎn)生的H2-CO2氣氛下的厭氧瓶中溫育。
用β-半乳糖苷酶活性的平板測定來檢驗菌株中正常分解代謝產(chǎn)物阻遏的存在。LB或E-瓊脂培養(yǎng)基是可以利用的數(shù)種培養(yǎng)基中的兩種。E-瓊脂培養(yǎng)基是常用的基礎(chǔ)營養(yǎng)培養(yǎng)基，在Vogel，H.J.，1956 Acetylornithase in E.coli，J.Bio/Chem 21897-103中已被討論，在此列入?yún)⒖嘉墨I。在典型的方案中，LB或E-瓊脂培養(yǎng)基中補充4g/L葡萄糖，4g/L乳糖，3mg/L的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和抗生素。以下這些培養(yǎng)基可以稱為X-Gal/葡萄糖瓊脂。形成藍色菌落表示由于沒有正常的分解代謝產(chǎn)物阻遏，在葡萄糖存在時表達β-半乳糖苷酶。相反地，形成白色菌落表示存在正常的分解代謝產(chǎn)物阻遏，因此沒有酶存在以裂解二糖乳糖。
本發(fā)明人還設(shè)計了在連續(xù)工藝中利用突變株的方法。進行重復(fù)的實驗，其中在培養(yǎng)物已經(jīng)生產(chǎn)約50g/L琥珀酸后，將1毫升混合物加入含有LB培養(yǎng)基、葡萄糖和MgCO3的新鮮夾雜物(enclosure)中。該新的接種物繼續(xù)有效生產(chǎn)琥珀酸。該過程重復(fù)3-4次，在每次情形中都導(dǎo)致琥珀酸的有效生產(chǎn)。
實施例1利用工業(yè)級水解產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸將AFP184放入有來自水稻秸稈的真水解產(chǎn)物的發(fā)酵罐中。典型的水解產(chǎn)物是商業(yè)制備的，并可獲自Arkenol Inc.，of Mission Viejo，CA.，其通過濃酸水解方法獲得。水稻秸稈培養(yǎng)基包含大約600g/L葡萄糖和169g/L木糖作為兩種主要糖組分，加上少量其他的糖。實驗數(shù)據(jù)見表2和圖2。
下面是基于AFP184的發(fā)酵工藝方案發(fā)酵培養(yǎng)基包含下列組分Difco酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，NaCl 10g/L，K2HPO47g/L，KH2PO43g/L，Arkenol′s水解產(chǎn)物16.5mg/L和卡那霉素30mg/L。工業(yè)級水解產(chǎn)物包括607g/L葡萄糖和169g/L木糖作為兩種主要糖組分，加上少量其他糖。除抗生素外培養(yǎng)基其他所有組分在121℃高壓滅菌20分鐘。經(jīng)冷卻后加入卡那霉素。接種搖瓶及1升發(fā)酵罐中均使用該發(fā)酵培養(yǎng)基。接種時，將50mg培養(yǎng)基置入250mg搖瓶中，接種0.2mg在30％甘油中-70℃下保存的AFP 184貯存培養(yǎng)物。搖瓶在搖床上37℃，250rpm下培養(yǎng)過夜(約16小時)。全部搖瓶內(nèi)容物然后用于接種發(fā)酵罐，其溫度維持在37℃。通氣入發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基以允許微生物的快速生長。六小時后當達到所需細胞量時，采用下列措施1.關(guān)閉通氣以達到厭氧條件，其將引發(fā)琥珀酸的產(chǎn)生；2.以每分鐘0.03mg的速率注入CO2氣體；和3.將含有用去離子水稀釋至總葡萄糖加木糖濃度為500g/L的Arkenol’s水解產(chǎn)物的原料溶液加入發(fā)酵罐，使得發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)總糖濃度達到50g/L。在實驗過程中，當發(fā)酵罐中糖濃度低時，加入更多原料為琥珀酸生產(chǎn)提供足夠的底物。因為細胞產(chǎn)生琥珀酸pH會下降。通過自動pH控制器的作用，加入1.5M Na2CO3溶液維持pH 6.5。間隔取樣分析光密度，葡萄糖，木糖，琥珀酸，乙酸，乳酸和乙醇。
表2用含有ptsG，ldh和pfl異常的突變株由Arkenol生產(chǎn)琥珀酸，乙酸和乙醇
實施例2從合成糖混合物生產(chǎn)琥珀酸利用AFP 184結(jié)合合成糖原料開發(fā)了發(fā)酵方案。如圖3所示，直到80小時，琥珀酸鹽快速生產(chǎn)，并稍微保持穩(wěn)定直至在約140小時后最終達到60g/L。
發(fā)酵培養(yǎng)基包含下列組分Difco酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 10g/L，K2HPO47g/L，KH2PO43g/L，葡萄糖7.6g/L，木糖1.85g/L和卡那霉素30mg/L。除抗生素外培養(yǎng)基其他所有組分在121℃高壓滅菌20分鐘。經(jīng)冷卻后再加入卡那霉素。接種搖瓶及1升發(fā)酵罐均使用該發(fā)酵培養(yǎng)基。接種時，將50mg培養(yǎng)基置入250mg搖瓶中，用0.2mg保存在30％甘油中-70℃下AFP184貯存培養(yǎng)物接種。搖瓶在培養(yǎng)搖床上37℃，250rpm下培養(yǎng)過夜(約16小時)。然后將全部搖瓶內(nèi)容物用于接種溫度維持在37℃的發(fā)酵罐。
通氣入發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基以允許生物的快速生長。六小時后當達到所需細胞量時，采用下列措施1.關(guān)閉通氣以施加厭氧條件，其可引發(fā)琥珀酸的生產(chǎn)；2.以每分鐘0.03mg的速率將CO2氣體通入培養(yǎng)基；3.將含400g/L的葡萄糖和84g/L木糖的原料溶液加入發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)總糖濃度達到50g/L。
在實驗過程中，當發(fā)酵罐中糖濃度低時，加入更多原料為琥珀酸生產(chǎn)提供足夠的底物。因為細胞產(chǎn)生琥珀酸pH下降，通過自動pH控制器的作用，加入1.5M Na2CO3溶液維持pH6.5。間隔取樣分析光密度，葡萄糖，木糖，琥珀酸，乙酸，乳酸和乙醇。
表3，下文和圖3舉例說明了利用合成糖混合物時得到的琥珀酸產(chǎn)量。
如實施例1和實施例2的比較可見，當用工業(yè)級水解產(chǎn)物與用合成的原料相比時，突變株的琥珀酸生產(chǎn)是相當?shù)?分別參見表2和3的時刻120和122)。該結(jié)果說明本發(fā)明方案的穩(wěn)固特征，工業(yè)級水解產(chǎn)物內(nèi)固有的任何有毒原料都不會降低產(chǎn)率。
表3利用合成糖的發(fā)酵方案中的琥珀酸生產(chǎn)
盡管已經(jīng)參考舉例說明的實施方案的細節(jié)描述了本發(fā)明，這些細節(jié)不是意欲限制如后附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的范圍。
PCT/RO/134表PCT/RO/134表的中文譯文PCT/US2002/035761
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)
PCT/RO/134表的中文譯文PCT/US2002/035761
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)
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涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)
權(quán)利要求
1.一種由工業(yè)級水解產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸的方法，包括a)提供含有基因ptsG，pflB，和ldhA突變的生物；b)允許所述生物積累生物量；和c)允許所述生物代謝水解產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物來源于選自由大腸桿菌屬(Escherichia coli)，克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)，歐氏桿菌屬(Erwinia)和乳桿菌屬(Lactobacillus)組成的組的屬。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中生物量積累至每毫升約108到1011個細胞。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中工業(yè)級水解產(chǎn)物是木質(zhì)素纖維素水解產(chǎn)物或來源于玉米的糖溶液。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中溫度選自約25℃至45℃之間。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中生物量在需氧環(huán)境下積累。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中pH選自約5至9之間。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中水解產(chǎn)物包含在首次原料量內(nèi)，并且其中通過加入二次原料量使得該方法連續(xù)。
9.權(quán)利要求9所述的方法，其中二次原料量是當琥珀酸濃度大約在50g/L時添加。
10.一種細菌突變株，其特征在于它從包含在工業(yè)級水解產(chǎn)物中的底物生產(chǎn)琥珀酸，琥珀酸與底物比率在0.6∶1和1.3∶1之間。
11.權(quán)利要求10所述的突變株，其中底物是選自由葡萄糖，乳糖，山梨糖醇，木糖，阿拉伯糖，甘露糖，葡糖醛酸，半乳糖，果糖或其組合組成的組的糖。
12.權(quán)利要求10所述的突變株，其中突變株包含不起作用的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，不起作用的丙酮酸甲酸裂解酶系統(tǒng)，和不起作用的乳酸脫氫酶系統(tǒng)。
13.權(quán)利要求12所述的突變株，其中不起作用的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)是點突變的結(jié)果。
14.權(quán)利要求8所述的突變株，其中突變株能同時利用一種以上底物同時產(chǎn)生琥珀酸。
全文摘要
本發(fā)明提供由工業(yè)級水解產(chǎn)物生產(chǎn)琥珀酸的方法，包含提供含有ptsG，pflB，和1dhA基因突變的生物，允許所述生物積累生物量，并允許所述生物代謝水解產(chǎn)物。本發(fā)明還提供細菌突變株，其特征在于從包含在工業(yè)級水解產(chǎn)物中的底物生產(chǎn)琥珀酸，琥珀酸與底物的比率在0.6∶1和1.3∶1之間。
文檔編號C12N15/74GK1886516SQ02830142
公開日2006年12月27日 申請日期2002年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者N·P·恩吉姆, M·唐納利, C·Y·圣維利－米勒德 申請人:Ut巴特勒有限公司