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一種核酸擴增產(chǎn)物檢測方法

文檔序號:588451閱讀:646來源:國知局
專利名稱:一種核酸擴增產(chǎn)物檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種實驗檢測方法,具體是指核酸擴增反應(yīng)及其產(chǎn)物的檢測方法。
背景技術(shù)
生物遺傳物質(zhì)核酸可用作鑒定生物和診斷病原的靶分子,但試樣品中的靶核酸分子量通常較少,需要對樣品中的靶核酸分子進行擴增,亦核酸的體外合成反應(yīng),相關(guān)PCR技術(shù)、SDA技術(shù)和LAMP技術(shù)先后被發(fā)明和應(yīng)用,這些技術(shù)擴增的效率較高,可把幾個到幾十個靶核酸分子高效擴增為巨量核酸分子產(chǎn)物,為各種病原微生物診斷和生物樣本的核酸分子鑒定提供了技術(shù)基礎(chǔ)。檢測核酸擴增產(chǎn)物的方法有多種,有的需要昂貴的儀器,有的檢測試劑對擴增反應(yīng)有抑制作用,限制了這些方法的普及應(yīng)用,如LAMP反應(yīng),鑒于其核酸合成的高效性,在實施過程中,其擴增反應(yīng)需要在密閉的反應(yīng)容器內(nèi)進行,而其產(chǎn)物的檢測,不能采用打開容器取樣電泳鑒定擴增產(chǎn)物或加入染料的方法;因為若打開反應(yīng)容器,易產(chǎn)生靶核酸產(chǎn)物分子氣溶膠污染,導致后續(xù)檢測實驗出現(xiàn)無法消除的、持續(xù)的假陽性結(jié)果,一旦出現(xiàn)這種產(chǎn)物污染實驗環(huán)境的情況,其污染在短期內(nèi)極難消除,導致針對某一靶點的同一 LAMP檢測實驗在相當長時間內(nèi)不能開展,是應(yīng)用LAMP檢測病原實驗中最大的困擾,極大地限制了 LAMP技術(shù)的推廣應(yīng)用。雖然也有不打開容器而通過觀察濁度的產(chǎn)生來判斷檢測核酸擴增反應(yīng)的方法,但不同實驗者目視條件下,對濁度產(chǎn)生與否得結(jié)果判斷經(jīng)常不一致,必需使用昂貴的儀器來保證其精密度,難以在基層普及開展。而如果在反應(yīng)前即加入染料,其對核酸合成反應(yīng)有干擾。因此開展此類實驗,需要開發(fā)新的擴增產(chǎn)物檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了簡便、經(jīng)濟、靈敏且不需要打開反應(yīng)容器的核酸擴增反應(yīng)產(chǎn)物檢測及污染控制方法。為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案一種核酸擴增產(chǎn)物檢測方法,其特征在于包括如下步驟,(1)在核酸擴增反應(yīng)前,于反應(yīng)容器內(nèi),加入包裹有染料的固態(tài)微晶蠟,且保證微晶蠟不與反應(yīng)液接觸;(2)在核酸擴增反應(yīng)時,維持擴增反應(yīng)溫度低于微晶蠟的熔點,且微晶蠟珠不與反應(yīng)液接觸;(3)擴增反應(yīng)完成后,對反應(yīng)容器加溫至微晶蠟熔點,微晶蠟從固態(tài)轉(zhuǎn)變成液態(tài), 并浮于核酸反應(yīng)液的上層;其中包裹的染料進入反應(yīng)溶液中,與核酸擴增反應(yīng)液均勻混合, 核酸擴增產(chǎn)物與染料結(jié)合,產(chǎn)生顯色反應(yīng)。進一步地,所述步驟C3)后,對反應(yīng)液降溫,浮在反應(yīng)液上的液態(tài)微晶蠟?zāi)?,并形成一道固體屏障,將反應(yīng)溶液封閉在反應(yīng)容器底部。本發(fā)明的檢測方法科學合理、實用方便,一方面保證擴增反應(yīng)的高效、無干擾,另外微晶蠟的加入確保反應(yīng)過程中及完成后不打開反應(yīng)容器,微晶蠟的熔解將染料放入溶液中,可完成產(chǎn)物染料法檢測;而微晶蠟的降溫凝固更是形成一層保護屏障;這都有效防止在操作中核酸擴增產(chǎn)物形成氣溶膠污染。同時,加熱熔解微晶蠟珠也是滅活反應(yīng)中酶的步
馬聚ο


附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解,并且構(gòu)成說明書的一部分,與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明,并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中圖1-圖3分別是本發(fā)明的實施例1的擴增反應(yīng)前、滅活時、滅活后降溫時的反應(yīng)狀態(tài)示意圖;其中,圖1的標記示意為1-錐形微量離心管,2-微晶蠟染料蠟珠,3-反應(yīng)液。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明,應(yīng)當理解,此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。實施例1一種核酸擴增及擴增產(chǎn)物檢測方法是1,“微晶蠟熒光染料蠟珠”的制備,在柱狀模具中加入適量熔解狀態(tài)的液態(tài)微晶蠟,待凝固后加入定量的熒光染料溶液(通常為1000X SYBR Green I),再加入適量液態(tài)微晶蠟;因熒光染料溶液和微晶蠟不互溶,所以待完全凝固后,形成包裹有液態(tài)熒光染料的 “微晶蠟熒光染料蠟珠”,從模具中取出即可使用。也可大量制備,置-20度貯存?zhèn)溆谩?,圖1所示,將核酸擴增反應(yīng)所需的試劑按常規(guī)方法加入到錐形微量離心管中, 啟動枋酸擴增反應(yīng)前,將“微晶蠟熒光染料蠟珠”置入容器;由于尺寸適合,蠟珠將被留滯在錐形反應(yīng)空間的上方,而反應(yīng)液在底部,蠟珠在核酸擴增反應(yīng)過程中不接觸反應(yīng)液,因此不會引入包括染料在內(nèi)的,對核酸合成反應(yīng)有干擾的物質(zhì)。核酸擴增反應(yīng)的要溫度小于微晶蠟的熔點,因此染料也不會從蠟珠中泄露進入反應(yīng)體系并干擾反應(yīng)。反應(yīng)所用的加溫設(shè)備可以是PCR儀或帶有溫控功能的水浴鍋;如果使帶有熱蓋功能的PCR儀,核酸合成反應(yīng)完成前,熱蓋溫度不應(yīng)超過微晶蠟的熔點。3,圖2所示,擴增反應(yīng)完成后,將反應(yīng)管加熱,溫度達到微晶蠟的熔點后,微晶蠟從固態(tài)變成液態(tài),由于其比重輕,浮于核酸反應(yīng)溶液的上層,而其中包裹的液態(tài)染料溶液因密度大于液態(tài)微晶蠟,自動沉入核酸擴增反應(yīng)溶液中;加熱所產(chǎn)生的熱能,可使染料溶液與核酸擴增反應(yīng)溶液均勻混合,其中的核酸擴增產(chǎn)物與染料結(jié)合,并產(chǎn)生顯色反應(yīng),這種顯色反應(yīng)通常還可以被一定波長的光激發(fā)產(chǎn)生更為明顯的熒光。通常,加溫過程也是核酸合成反應(yīng)完成后的滅活核酸合成酶活性的步驟。4,圖3所示,加熱滅活完成后,可以利用PCR儀降低反應(yīng)管的溫度,或者自然降溫, 當溫度降低到微晶蠟的凝固點,浮在反應(yīng)溶液上方的液態(tài)微晶蠟開始凝固,并迅速形成一道固體屏障,將反應(yīng)溶液封閉在容器的底部,避了在后續(xù)操作中核酸擴增產(chǎn)物形成氣溶膠污染。
5,結(jié)果判斷,使用STOR GREEN I染料時,陽性反應(yīng)呈綠色,即反應(yīng)管中有大量靶核酸分子被染色,自然光下溶液為深淺不同的綠色。陰性反應(yīng)為桔黃色,即STOR染料本身的顏色,同時其顯色靈敏度可被增強,即使用紫外線或者特定波長的光照射激發(fā)熒光染料,使其發(fā)出耀眼的熒光,STOR GREEN I可以被紫外(310nm)和可見藍光G97nm)激發(fā)后發(fā)綠光 (520nm)。最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已,并不用于限制本發(fā)明, 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明,對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說,其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改,或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi),所作的任何修改、等同替換、改進等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種核酸擴增產(chǎn)物檢測方法,其特征在于包括如下步驟,(1)在核酸擴增反應(yīng)前,于反應(yīng)容器內(nèi),加入包裹有染料的固態(tài)微晶蠟,且保證微晶蠟不與反應(yīng)液接觸;(2)在核酸擴增反應(yīng)時,維持擴增反應(yīng)溫度低于微晶蠟的熔點,且微晶蠟珠不與反應(yīng)液接觸;(3)擴增反應(yīng)完成后,對反應(yīng)容器加溫至微晶蠟熔點,微晶蠟從固態(tài)轉(zhuǎn)變成液態(tài),并浮于核酸反應(yīng)液的上層;其中包裹的染料進入反應(yīng)溶液中,與核酸擴增反應(yīng)液均勻混合,核酸擴增產(chǎn)物與染料結(jié)合,產(chǎn)生顯色反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸擴增產(chǎn)物檢測方法,其特征在于所述步驟C3)后,對反應(yīng)液降溫,浮在反應(yīng)液上的液態(tài)微晶蠟?zāi)?,并形成一道固體屏障,將反應(yīng)溶液封閉在反應(yīng)容器底部。
全文摘要
一種核酸擴增產(chǎn)物檢測方法,提供了一種不需要打開反應(yīng)容器的核酸擴增反應(yīng)產(chǎn)物檢測及污染控制方法,包括如下步驟,(1)在核酸擴增反應(yīng)前,于反應(yīng)容器內(nèi),加入包裹有核酸染料的固態(tài)微晶蠟,且保證微晶蠟不與反應(yīng)液接觸;(2)在核酸擴增反應(yīng)時,維持擴增反應(yīng)溫度低于微晶蠟的熔點,且微晶蠟珠不與反應(yīng)液接觸;(3)擴增反應(yīng)完成后,對反應(yīng)容器加溫至微晶蠟熔點,微晶蠟從固態(tài)轉(zhuǎn)變成液態(tài),并浮于核酸反應(yīng)液的上層;其中包裹的染料進入反應(yīng)溶液中,與核酸擴增反應(yīng)液均勻混合,核酸擴增產(chǎn)物與染料結(jié)合,產(chǎn)生顯色反應(yīng)。
文檔編號C12Q1/68GK102559860SQ20101061418
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者夏惠, 張惠, 陶志勇, 高琪 申請人:張惠, 江蘇省血吸蟲病防治研究所, 陶志勇
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