專利名稱：一種檢測環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA的方法，屬于生物 檢測技術領域。
背景技術：
對基因(DNA)及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對于 疾病的早期診斷和治療以及在在衛(wèi)生防疫、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫等領域都具有十分重要的意 義。以往在這方面較為準確靈敏的檢測方法有熒光標記法、放射性標記等方法，這些方法都 需要復雜的操作和特殊的設備，應用范圍很窄。1993年PE公司的Dr. Kary B. Mullis發(fā)明了 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR。隨后PCR技術大規(guī)模的應用于生 物科研和臨床治療中，對DNA的檢測進入了新的時代，Dr. Mullis為此還獲得了1993年的諾 貝爾化學獎。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準確性高、操作較簡單等優(yōu)點，但由于其反應 進行和產(chǎn)品DNA的檢測需要特殊的儀器，PCR技術的使用一直被限定在專業(yè)的實驗室和醫(yī)院里
2001年日本榮研化學株式會社研制出了一種新型DNA擴增方式，環(huán)介導等溫核酸擴增技 術(LAMP)可以在恒溫條件下實現(xiàn)DNA的高效快速擴增，該方法反應條件簡單，DNA擴增效率 高，因此在核酸檢測方面具有明顯優(yōu)勢。但是對LAMP擴增制備的DNA產(chǎn)物使用常規(guī)的檢測方 法，如電泳法，熒光染料法等，均無法排除LAMP擴增所帶來的假陽性問題，而且需要特殊的 儀器，因此限制了LAMP技術的實際應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA的方法， 結合環(huán)介導等溫核酸擴增技術，以提高生物分子檢測的靈敏度，開發(fā)一種操作簡單、快速、 準確、不需要專業(yè)儀器設備的方法，廣泛應用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān) 測、檢驗檢疫，生物技術等領域的高靈敏度的DNA或RNA檢測。
本發(fā)明提出的納米金顆粒檢測環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA的方法，包括以下步驟(1) 制備標記有分子探針的納米金顆粒
將經(jīng)過修飾的分子探針加入到納米尺寸的金顆粒溶液中，經(jīng)過反應后，分子探針被固定 在納米金顆粒的表面。
(2) 環(huán)介導等溫核酸擴增目的DNA或目的RNA
環(huán)介導等溫核酸擴增技術將目的DNA分子大量復制或先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后大量復制目的RNA分子 ，目的分子被放大109倍，產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物DNA具有多重重復序列。
(3) 納米金顆粒探針與環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA雜交(如圖l所示) 將環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA與納米金顆粒上能識別環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)
物DNA的分子探針雜交。
(4) 納米金顆粒聚集，導致顏色改變
納米金顆粒沿環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體，進而引發(fā)納米金顆 粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據(jù)顏色變化可以判斷待測樣品是否具 有目的DNA或RNA。


圖l納米金顆粒探針與環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA雜交示意圖 圖2用納米金顆粒進行HIV檢測結果 圖3用納米金顆粒進行流感檢測結果 圖4用納米金顆粒進行大腸桿菌檢測結果
具體實施例方式
實施例一
HIV檢測
利用LAMP擴增技術從樣品中擴增HIV病毒感染的特異性信使RNA(mRNA)，用納米金顆粒探 針檢測擴增后的產(chǎn)物，從而判斷樣品的來源(人、動物)是否已被HIV感染。主要用于HIV感 染的快速診斷。
實驗材料與方法
1.針對HIV病毒設計LAMP擴增的引物，設計用于納米金顆粒探針檢測的巰基修飾DNA探針 耙向序列
5巰基修飾的DNA探針序列
5' -AGTGGCACCAGGCCAGAAAAAAAA-SH-3'
引物序列
HIV的FIP引物
5' -TTTAACATTTGCATGGCTGCT-TACCCATGTTTACAGCATTATC-3' HIV的BIP引物
5' -ATGAGAGAACCAAGGGGAAGT-GTCATGGATCCTATTTGCTCC-3' HIV的F3引物
5' -AAGGCTTTTAGCCCAGAAG-3' HIV的B3引物
5' -TCTCCTACTGGGATAGGTGG-3'
HIV的LoopF引物
5' -TAAATCTTGTGGGGTGGCTC-3'
HIV的LoopB引物
5' -CATAGCAGGAACTACTAGTACTCTT-3'
2. 納米金顆粒探針標記
取lml納米金顆粒(20nm， 1.2nM) ， 4°C， 13200rpm離心15分鐘，去除上清，加入lml磷 酸緩沖液(10mM， pH7.0)加入35ul巰基探針達到終濃度約3uM。室溫放置反應16小時。逐滴 加入濃氯化鈉溶液使之終濃度達到O. 1M，室溫反應至少40小時，期間振搖若干次。
4°C， 13200rpm離心30分鐘，去除上清，沉淀重懸于lml含有O. 1M NaCl的磷酸緩沖液( 10mM， pH 7.0)，重復兩次。最后4。C， 13200rpm離心30分鐘去除上清，沉淀重懸于100ul含 有O. 25M NaCl的磷酸緩沖液(10mM， pH7. 0) ， 4。C保存。
3. RT-LAMP擴增HIV感染特異性的mRNA
在PCR反應管中進行25ul的反應，反應成分包括0. 2uM F3和B3引物，1. 6uM FIP和BIP 引物，0. 8uM LoopF禾口LoopB引物，0. 4M betaine (Sigma-Aldrich， St. Louis， MO) ， 10mM MgSO4， 1. 4mM dNTPs， lxThermoPol reaction buffer (New England Biolabs， Ipswich,MA)， 8U Bst DNA polymerase (New England Biolabs)， 0. 625U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen， Carlsbad, CA) ， lOul提取的核酸或者熱處理后的血液樣品.整個反應在循環(huán) 恒溫水浴中進行，6CfC反應60分鐘，然后8(fC加熱2分鐘終止反應。
4. 納米金顆粒探針檢測
探針通過巰基偶聯(lián)到納米金顆粒表面。將LAMP擴增HIV的DNA產(chǎn)物經(jīng)95GC反應20分鐘， 置冰上快速冷卻，加入適量納米金顆粒探針，55°(]雜交反應1一2小時，至溶液由紅色變?yōu)闇\ 紫色。
5. 鑒定
如果溶液變色，則判定樣本中含有HIV感染特異性的mRNA，溶液保持紅色不變則不含有 HIV感染特異性的mRNA。如圖2所示，左側(cè)呈淡紫色的PCR管中的樣品含有HIV感染特異性的 mRNA，如果樣品是血液樣品，那么提供血樣的人已經(jīng)被HIV病毒所感染。而右側(cè)呈紅色的管 中的樣品則不含有HI V感染特異性的mRNA 。
實施例二 流感病毒檢測
利用LAMP擴增技術從樣品中擴增流感病毒(H1N1， H3N2 and H5N1) M1蛋白的DNA，納米 金顆粒探針檢測擴增后的DNA產(chǎn)物，從而判斷樣品中是否含有流感病毒。主要用于流感病毒 的快速診斷。
實驗材料與方法
1.針對流感病毒M1蛋白設計LAMP擴增的引物，設計用于納米金顆粒探針檢測的巰基修飾 DNA探針。
耙向序列
CTTAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATA 巰基修飾的DNA探針序列 5'-GATCGCACAGAGACTTAAAAAAAA-SH-3' 引物序列M1的F3引物
5'-GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACG-3' M1的B3引物
5'-TTCCCATTGAGGGCATTTTGGAC-3' M1的BIP引物
5'-CCTTAGTCAGAGGTGACAGGTACGATGCAGTCCTCGCTCAGTGGG-3' M1的FIP引物
5'-TGTCTTTAGCCATTCCATGAGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-3' Ml的LoopF引物
5'-GTTCTTTCCAGCAAAGACATC-3'
Ml的LoopB引物
5'-GTGTTCACGCTCACCG-3'
2. 納米金顆粒探針標記
取lml納米金顆粒(20nm， 1.2nM) ， 4°C， 13200rpm離心15分鐘，去除上清，加入lml磷 酸緩沖液(10mM， pH7.0)加入35ul巰基探針達到終濃度約3uM。室溫放置反應16小時。逐滴 加入濃氯化鈉溶液使之終濃度達到O. 1M，室溫反應至少40小時，期間振搖若干次。
4°C， 13200rpm離心30分鐘，去除上清，沉淀重懸于lml含有O. 1M NaCl的磷酸緩沖液( 10mM， pH 7.0)，重復兩次。最后4。C， 13200rpm離心30分鐘去除上清，沉淀重懸于100ul含 有O. 25M NaCl的磷酸緩沖液(10mM， pH7. 0) ， 4。C保存。
3. LAMP擴增流感病毒的DNA
在PCR反應管中進行25ul的反應，反應成分包括0. 2uM F3和B3引物，1. 6uM FIP和BIP 引物，0. 8uM LoopF禾口LoopB引物，0. 4M betaine (Sigma-Aldrich， St. Louis， MO) ， 10mM MgSO4， 1. 4mM dNTPs， lxThermoPol reaction buffer (New England Biolabs， Ipswich, MA)， 8U Bst DNA polymerase (New England Biolabs) ， lOul提取的核酸或者熱處理后的血 液樣品.整個反應在PC財廣增儀中進行，6(fC反應60分鐘，然后80°(]加熱2分鐘終止反應。
4. 納米金顆粒探針檢測
探針通過巰基偶聯(lián)到納米金顆粒表面。將LAMP擴增HIV的DNA產(chǎn)物經(jīng)95GC反應20分鐘， 置冰上快速冷卻，加入適量納米金顆粒探針，55°(]雜交反應1一2小時，至溶液由紅色變?yōu)闇\ 紫色。
5. 鑒定如果溶液變色，則判定樣本中含有流感病毒，溶液保持紅色不變則不含有流感病毒。如 圖3所示，左側(cè)呈淡紫色的PCR管中的樣品含有流感病毒，如果樣品是血液樣品，那么提供血 樣的人已經(jīng)被流感病毒所感染。而右側(cè)呈紅色的管中的樣品則不含有流感病毒。
實施例三 大腸桿菌檢測
利用LAMP擴增技術從樣品中擴增大腸桿菌的特異性DNA，納米金顆粒探針檢測擴增后的 產(chǎn)物，從而判斷樣品中是否含有大腸桿菌。主要用于大腸桿菌快速檢測。 實驗材料與方法
1.針對大腸桿菌設計LAMP擴增的引物，設計用于納米金顆粒探針檢測的巰基修飾DNA探針。
耙向序列
CATGAAGGTG*AATTCGTGGTGTTTG TCGGACCGTCTGGCTGCGGTAAAT 巰基修飾的DNA探針序列 5'-TGTAACGAAAGCCTGGAAAAAAAA-SH-3' 引物序列
大腸桿菌的F3引物
5'-GCCATCTCCTGATGACGG-3'
大腸桿菌的B3引物
5'-ATTTACCGCAGCCAGACG-3'
大腸桿菌的BIP引物
5'-CTGGGGCGAGGTCGTGGTAT TCCGAACAAACACCACGAATT-3: 大腸桿菌的FIP引物
5'-CATTTTGCAGCTGTACGCTCGCAGCCCATCATGAATGTTGCT-3:
大腸桿菌的Loop F引物
5'-CTTTGTAACAACCTGTCATCGACA-3'
大腸桿菌的Loop B引物
5'-ATCAATCTCGATATCCATGAAGGTG-3'
9取lml納米金顆粒(20nm， 1.2nM) ， 4°C， 13200rpm離心15分鐘，去除上清，加入lml磷 酸緩沖液(10mM， pH7.0)加入35ul巰基探針達到終濃度約3uM。室溫放置反應16小時。
逐滴加入濃氯化鈉溶液使之終濃度達到O. 1M，室溫反應至少40小時，期間振搖若干次。
4°C， 13200rpm離心30分鐘，去除上清，沉淀重懸于lml含有O. 1M NaCl的磷酸緩沖液(
10mM， pH 7.0)，重復兩次。最后4。C， 13200rpm離心30分鐘去除上清，沉淀重懸于100ul含
有O. 25M NaCl的磷酸緩沖液(10mM， pH7. 0) ， 4。C保存。
3. LAMP擴增大腸桿菌的DNA
在在PCR反應管中進行25ul的反應，反應成分包括0. 2uM F3和B3引物，1. 6uM FIP和 BIP引物，0. 8uM LoopF和LoopB引物，0. 4M betaine (Sigma-Aldrich， St. Louis, MO)， lOmM MgSO4， 1. 4mM dNTPs， lxThermoPol reaction buffer (New England Biolabs， Ipswich, MA)， 8U Bst DNA polymerase (New England Biolabs) ， lOul提取的核酸或者熱 處理后的血液樣品。整個反應在PC財廣增儀中進行，6CfC反應60分鐘，然后8(fC加熱2分鐘 終止反應。
4. 納米金顆粒探針檢測
探針通過巰基偶聯(lián)到納米金顆粒表面。將LAMP擴增HIV的DNA產(chǎn)物經(jīng)95GC反應20分鐘， 置冰上快速冷卻，加入適量納米金顆粒探針，55°(]雜交反應1一2小時，至溶液由紅色變?yōu)闇\ 紫色。
5. 鑒定
如果溶液變紫色，則判定樣本中含有大腸桿菌，溶液保持紅色不變則不含有大腸桿菌。 如圖4所示，左側(cè)呈淡紫色的PCR管中的樣品含有大腸桿菌。而右側(cè)呈紅色的管中的樣品則不 含有大腸桿菌。
序列表
〈110>天津朝海科技有限公司
〈120> —種檢測環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物的方法
〈130> Demo〈160> 24
〈170> Patentln version 3. 5
〈210> 1
〈211> 296
〈212> DNA
〈213> Human immunodeficiency virus
〈400> 1
aaggctttta gcccagaagt aatacccatg tttacagcat tatcagaagg agccacccca 60
caagatttaa acaccatgtt aaatacagta gggggacatc aagcagccat gcaaatgtta 120
aaagatacca tcaatgaaga ggctgcagaa tgggatagat tgcatccagt gcatgcaggg 180
ccagtggcac caggccagat gagagaacca aggggaagtg acatagcagg aactactagt 240
actcttcagg agcaaatagg atggatgaca agtaatccac ctatcccagt aggaga 2%
〈210> 2 〈211> 24 〈212> DNA〈213> Human immunodeficiency virus
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agtggcacca ggccagaaaa aaaa 24
〈210> 3
〈211> 43
〈212> DNA
〈213> Human immunodeficiency virus
〈400> 3
tttaacattt gcatggctgc ttacccatgt ttacagcatt ate 43
〈210> 4
〈211> 42
〈212> DNA
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atgagagaac caaggggaag tgtcatggat ectatttget cc 42
〈210> 5〈211> 19 〈212> DNA
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aaggctttta gcccagaag 19
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tctcctactg ggataggtgg 20
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〈212> DNA
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13〈210> 8
〈211> 25
〈212> DNA
〈213> Human immunodeficiency virus
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catagcagga actactagta ctctt 25
〈210> 9
〈211> 355
〈212> DNA
〈213> Influenza virus
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aggccccctc aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgctg gaaagaacac 120
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actctttgtc caaaatgccc ttaatgggaa tggggatcca aataatatgg acagagcagt 300taaactgtat agaaagctta agagggagat aacattccat ggggccaaag aaata 355
<210> 10 〈211> 24 〈212> DNA
<213> Influenza virus <400> 10
gatcgcacag agacttaaaa aaaa 24
<210> 11 <211> 25 〈212> DNA
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gagtcttcta accga.ggtcg aaacg 25
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<210> 13 <211> 45 <212> DNA
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<213> Influenza virus
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gttctttcca gcaaagacat c 21
〈210> 16 〈211> 16
〈212> 醒
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gtgttcacgc tcaccg 16
〈210> 17 〈211> 204 〈212> 醒
<213> Escherichia coli
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gccatctcct gatgacgcat agtcagccca tcatgaatgt tgctgtcgat gacaggttgt 60tacaaaggga gaagggcatg gcgagcgtac agctgcaaaa tgtaacgaaa gcctggggcg 120
aggtcgtggt atcgaaagat atcaatctcg atatccatga aggtgaattc gtggtgtttg 180
tcggaccgtc tggctgcggt aaat 204
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〈213> Escherichia coli
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〈213> Escherichia coli
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ctggggcgag gtcgtggtat tccgaacaaa cacca.cga.at t 41
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<213> Escherichia coli
〈400> 22
cattttgcag ctgta.cgctc gcagcccatc atgaatgttg ct 42〈210> 23 〈211> 24 <212> DNA
<213> Escherichia coli
〈400> 23
ctttgtaaca acctgtcatc gaca 24
〈210> 24 〈211> 25 〈212> DNA
〈213> Escherichia coli
<400> 24
atcaatctcg ata.tccatga aggtg 25
20
權利要求
1.一種用納米金顆粒檢測環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)制備標記有分子探針的納米金顆粒；(2)用環(huán)介導等溫核酸擴增技術擴增待檢測樣品中的目的DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后用環(huán)介導等溫核酸擴增技術擴增待檢測樣品中的目的RNA；(3)納米金顆粒探針與環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA雜交；(4)雜交引發(fā)納米金顆粒聚集，導致納米金顆粒聚集處顏色改變，以此判斷待檢測樣品是否含有目的DNA或RNA。
2. 根據(jù)權利要求l，待檢測樣品中環(huán)介導等溫核酸擴增技術的擴增對 象可以是DNA、 RNA或DNA和RNA的混合物。
3. 根據(jù)權利要求l，納米金顆粒探針包括兩個部分， 一是納米尺度的 金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針。
4. 根據(jù)權利要求l，納米金顆粒探針和環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物 DNA雜交可以和環(huán)介導等溫核酸擴增反應在相同反應條件下、相同反應容器中同時進行。
5. 根據(jù)權利要求l，納米金顆粒探針和環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物 DNA雜交可以發(fā)生在溶液中或者固體表面。
6. 根據(jù)權利要求l，納米金顆粒探針與環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物 DNA雜交引發(fā)溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計 等光學儀器檢測。
7. 根據(jù)權利要求3，分子探針是指可以識別環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA的功能分子，這些分子包括DNA， RNA， PNA，蛋白質(zhì)，化學分子。
8.根據(jù)權利要求4，相同反應條件包括但不限于溶液組成，成分濃 度，PH值，溫度，反應時間等。
9.根據(jù)權利要求l，本方法可以用于檢測HIV、乙肝、丙肝、包括甲 型H1N1在內(nèi)的流感、手足口病、腦膜炎等病毒性疾病的病原體病毒，大腸桿菌、葡萄球菌等 細菌性疾病的病原體細菌，腳氣、灰指(趾)甲等真菌性疾病的病原體真菌，鸚鵡熱衣原體 、沙眼衣原體、肺炎衣原體等致病衣原體。
10.根據(jù)權利要求l，本方法可以用于腫瘤的診斷，包括肝癌，肺癌 ，腦癌，食道癌，前列腺癌，乳腺癌，子宮癌，骨癌，白血病等惡性腫瘤，也可用于腫瘤惡 性程度的鑒定。
11.根據(jù)權利要求l，本方法可以用于人體疾病的診斷、動物疾病的 診斷、植物疾病的診斷、食品衛(wèi)生的監(jiān)測、胎兒性別的鑒定、基因變異的鑒定、單核甘酸 多態(tài)性的檢測、細胞內(nèi)基因變化的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測環(huán)介導等溫核酸擴增技術(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)產(chǎn)物的方法，首先制備標記有分子探針的納米金顆粒，用環(huán)介導等溫核酸擴增技術擴增待檢測的DNA或RNA，再利用分子探針標記的納米金顆粒與環(huán)介導等溫核酸擴增技術產(chǎn)物DNA分子進行分子雜交，從而促進納米金顆粒相互靠近，導致顏色變化。根據(jù)顏色信號變化，判斷待檢測樣品是否含有待檢測的DNA或者RNA。本方法具有靈敏度高、特異性好，操作簡便，快速、不需要專業(yè)設備等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101659999SQ20091030516
公開日2010年3月3日 申請日期2009年8月4日 優(yōu)先權日2009年8月4日
發(fā)明者孫國明, 高利增 申請人:天津朝?？萍加邢薰?br>