專利名稱：多能間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化皮膚模型的建立、鑒定及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨髓等多種組織未分化細(xì)胞分離及鑒定的方法，具體涉及一種建立成體骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化成皮膚干細(xì)胞及皮膚組織模型的方法。
背景技術(shù)：
近年來，對(duì)成體干細(xì)胞可塑性的研究已成為醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)。許多研究報(bào)道，源于一種組織的干細(xì)胞在適宜條件下可以分化為多種組織細(xì)胞；移植入體內(nèi)的造血干細(xì)胞，可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、甚至肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，顯示了成體干細(xì)胞廣闊的應(yīng)用前景。尤其是成體骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞因其相對(duì)較易分離獲得、體外培養(yǎng)可大量擴(kuò)增、體內(nèi)外均具有較強(qiáng)的多向分化能力，使其較之其他來源的干細(xì)胞更受關(guān)注。
但既往的研究報(bào)道多集中于干細(xì)胞向骨、軟骨、脂肪、肌肉、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞方向分化方面，而對(duì)于干細(xì)胞分化為皮膚細(xì)胞的報(bào)道較少，且在其鑒定方面也存在欠缺。
例如，Korbling等人用免疫組化和FISH的方法在接受了男性供者造血干細(xì)胞移植的婦女體內(nèi)檢測(cè)到了Y染色體和角質(zhì)素陽性細(xì)胞(Korbling.M，Katz RL，Khanna A，et al.Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral-bloodstem cells.N Engl J Med.2002 Mar 7；346(10)738-46.)；Krause等人用FISH方法，在移植有雄性小鼠造血干細(xì)胞的雌性小鼠的皮膚切片上，證實(shí)有Y染色體的存在(Krause，D.S.et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stemcell.Cell.2001 May 4；105(3)369-77)。但YING等人(Ying QL，Nichols J，Evans EP，Changing potency by spontaneous fusion.Nature.2002 Apr 4；416(6880)545-8)和TERADA等人(Terada N，Hamazaki T，Oka M et al.Bone marrow cells adopt the phenotype of othercells by spontaneous cell fusion.Nature.2002 Apr4；416(6880)542-5)則認(rèn)為，由于皮膚組織中存在有一些巨噬細(xì)胞，其可能吞噬供者的皮膚細(xì)胞，或者因兩種細(xì)胞的自發(fā)性融合，導(dǎo)致其獲得供者細(xì)胞的表型，因而上述實(shí)驗(yàn)有可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種建立成體骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化成皮膚干細(xì)胞及皮膚組織的動(dòng)物模型及其鑒定的方法。
本發(fā)明之方法的技術(shù)方案及具體步驟如下(一)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建的技術(shù)方案自成年BALB/C小鼠的骨髓中分離獲得并體外培養(yǎng)擴(kuò)增多能間充質(zhì)干細(xì)胞，將適量的供體BALB/C小鼠骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞和一定量的C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞共同植入經(jīng)致死量照射的成年C57BL/6小鼠體內(nèi)。待受體C57BL/6小鼠出現(xiàn)新生皮毛后，取該部位的皮膚組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)及種系遺傳標(biāo)記測(cè)定，得小鼠骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化成皮膚組織的模型。
(二)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建的具體步驟1)供體小鼠骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞的制備將6-8周齡的BALB/C小鼠(購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)脫脊處死，以75％酒精浸泡消毒，以無菌手術(shù)剪子和鑷子取其后肢的脛骨和股骨，用注射器的針頭插入骨髓腔，以預(yù)冷的HANKS液(D-Hanks液配方(g/L)0.4g KCl，0.06g KH2P04，8.00g NaCl，0.35g NaHCO3，0.12g Na2HP04.12H20，0.01g酚紅，加超純水至1000ml；)沖出骨髓細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)吹打分散細(xì)胞后，再過4號(hào)針頭，使之成單細(xì)胞懸液，HANKS液和不完全RPMI1640培養(yǎng)液(購于LIFETECHNOLOGIES公司)各洗滌細(xì)胞一次(離心條件均為1000rpm，10min)，經(jīng)Ficoll(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，再經(jīng)磁珠(購于MACS公司)分選出CD45-Gly(-)的細(xì)胞。
加入特制的培養(yǎng)基(此培養(yǎng)基含DMEM，MCDB-201，2％FBS，10ng/ml EGF，10ng/mlPDGF-bb，10ng/ml LIF，insulin transferring selenium，linoleic acid，bovine sermalbumin(bsa)，10-9M dexamethasone，和10-4M ascorbic acid 2-phosphate，均購于sigma公司)，按8×105/cm2接種至培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24-72小時(shí)后，棄除懸浮細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2-3天換液一次，至細(xì)胞80-90％融合后，以含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化3分鐘，傳代培養(yǎng)。
2)受體同品系小鼠骨髓細(xì)胞的制備將6-8周齡的C57BL/6小鼠(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所動(dòng)物部提供)脫脊處死，無菌取其后肢的脛骨和股骨，用注射器的針頭插入骨髓腔，以預(yù)冷的HANKS液沖出骨髓細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)吹打分散細(xì)胞后，再過4號(hào)針頭，使之成單細(xì)胞懸液，以EDTA-NH4Cl(配方(g/L)8.29g NH4Cl，1.0012g KHCO3，29.225mg EDTA，加超純水至1000ml；)去除紅細(xì)胞，再以HANKS洗滌二次(離心條件均為1000rpm，10min)。用0.2％胎盤蘭染色按常規(guī)方法計(jì)算活細(xì)胞率，并以HANKS調(diào)整細(xì)胞至所需濃度備用。
3)受體小鼠的準(zhǔn)備將10-12周齡的C57BL/6小鼠(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所動(dòng)物部提供)進(jìn)行致死量照射(Gammacell 40，CES IUM 137，購于Atomic Energy of Canada Limited Radiochemical公司)，照射劑量為850Rad。
4)骨髓移植將1.5×107的C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞和5×105的BALB/C小鼠骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞由小鼠尾靜脈共同輸入經(jīng)致死劑量照射的C57BL/6小鼠體內(nèi)。
(三)鑒定構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?.用免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)新生皮膚細(xì)胞1)將陰性對(duì)照C57BL/6小鼠(MHC-I類抗原為H-2Kb)、陽性對(duì)照BALB/C小鼠(MHC-I類抗原為H-2Kd)及實(shí)驗(yàn)組小鼠的皮膚制成冰凍切片，以生物素化的抗H-2Kd單抗(購于BD公司)作為一抗，以DAB(購于DAKO A/S公司)為顯色系統(tǒng)進(jìn)行直接免疫組化試驗(yàn)。結(jié)果，陰性對(duì)照組切片上未見棕黃色的H-2Kd陽性細(xì)胞，且毛囊中可見明顯的黑色毛發(fā)片段；陽性對(duì)照組切片中可見較強(qiáng)棕黃色染色的H-2Kd陽性細(xì)胞，毛囊中未見有黑色毛發(fā)片段；在實(shí)驗(yàn)組切片中，毛囊中未見有黑色毛發(fā)片段，且在表皮和真皮層的毛囊周圍可見棕黃色的H-2Kd陽性細(xì)胞，提示這些細(xì)胞確為BALB/C小鼠來源。
2)用針對(duì)P63(一種表皮再生性增殖的轉(zhuǎn)錄因子，可作為角質(zhì)干細(xì)胞較為特異的標(biāo)志)和H-2Kd的兩種單抗作為一抗，對(duì)上述小鼠皮膚組織的冰凍切片進(jìn)行了雙標(biāo)免疫組化試驗(yàn)。首先以抗P63單抗(購于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司)進(jìn)行間接免疫組化試驗(yàn)，以BCIP/NBT作為顯色系統(tǒng)，出現(xiàn)深藍(lán)色為陽性結(jié)果；加入雙標(biāo)阻斷液后，以抗H-2Kd單抗進(jìn)行直接免疫組化試驗(yàn)，以AEC(購于DAKO A/S公司)作為顯色系統(tǒng)，鮮紅色為陽性結(jié)果。結(jié)果可見，陽性對(duì)照組切片中在毛囊較低部位含有皮膚干細(xì)胞處可見明顯雙陽性細(xì)胞，在其周圍是紅色H-2Kd單陽性細(xì)胞，提示為成熟皮膚細(xì)胞；在陰性對(duì)照組切片中，在毛囊處可見深藍(lán)色P63陽性細(xì)胞，而無紅色H-2Kd陽性細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組切片中則顯示毛囊處呈深藍(lán)色P63陽性皮膚干細(xì)胞，周圍為紅染的H-2Kd陽性細(xì)胞。
3) 在無菌條件下獲取實(shí)驗(yàn)組小鼠含有白色毛發(fā)處的皮膚和陰性對(duì)照C57BL/6小鼠背部皮膚，并通過膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶(均購自SIGMA公司)消化等步驟，分離出皮膚細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，7-10天后，細(xì)胞達(dá)到90％融合后，收獲細(xì)胞，離心制成細(xì)胞涂片，然后再進(jìn)行上述雙標(biāo)免疫組化試驗(yàn)，并以麥?zhǔn)咸K木素進(jìn)行復(fù)染。實(shí)驗(yàn)組切片中既可見深藍(lán)色P63陽性和紅色H-2Kd陽性，即雙陽性細(xì)胞，提示此類細(xì)胞為供者源的皮膚干細(xì)胞，又可見紅色H-2Kd陽性，P63陰性，即單陽性細(xì)胞，提示此類細(xì)胞為供者源成熟皮膚細(xì)胞；從陰性對(duì)照組切片也可見兩類細(xì)胞，一類為H-2Kd陰性而P63陽性細(xì)胞，提示此類細(xì)胞為受者皮膚干細(xì)胞，另一類為H-2Kd和P63雙陰性細(xì)胞，提示為受者皮膚成熟細(xì)胞。從而排除了因組織切片免疫組化試驗(yàn)帶來的系統(tǒng)誤差的可能。從蛋白水平說明被測(cè)組織確實(shí)為H-2Kd陽性小鼠來源。
2.用RT-PCR手段從轉(zhuǎn)錄水平上鑒定皮膚細(xì)胞。
在無菌條件下獲取實(shí)驗(yàn)組小鼠含有白色毛發(fā)處的皮膚，并通過膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶消化等步驟，分離出皮膚細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，7-10天后，細(xì)胞達(dá)到90％融合后，收獲細(xì)胞，以TRIZOL(購于GIBCO公司)裂解細(xì)胞，獲取總RNA，利用RT-PCR試劑盒(購于TAKARA公司)和特異性H-2Kd cDNA引物(購于TAKARA公司)，擴(kuò)增出了特定長(zhǎng)度的H-2Kd cDNA片段，從基因水平說明被測(cè)組織確實(shí)為H-2Kd陽性小鼠來源。
3.將單純1.5×107的C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)同樣致死劑量照射的C57BL/6小鼠體內(nèi)，則未見白色毛發(fā)的出現(xiàn)，說明該種毛發(fā)的轉(zhuǎn)變與照射無關(guān)。
本發(fā)明填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白，建立了一種成體骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化為皮膚干細(xì)胞及皮膚組織的動(dòng)物模型，同時(shí)還可在蛋白和基因水平對(duì)該模型作多層面的檢測(cè)與鑒定。
該模型的構(gòu)建一者首次提供了成體骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為皮膚干細(xì)胞及皮膚組織，為成體干細(xì)胞可塑性的理論提供了新的直接證據(jù)；二者也為各種因素導(dǎo)致的皮膚損傷(如燒傷、射線損傷等)之臨床治療提供了一種新的途徑，為成體骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞移植在皮膚再生醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


圖1受體C57BL/6小鼠移植后第50天的照片圖2皮膚組織切片單標(biāo)免疫組化結(jié)果a實(shí)驗(yàn)組(40×)，b實(shí)驗(yàn)組(100×)，c陽性對(duì)照(40×)，d陰性對(duì)照(40×)圖3皮膚組織切片雙標(biāo)免疫組化結(jié)果a陽性對(duì)照組(20×)，b實(shí)驗(yàn)組(20×)，c陰性對(duì)照(20×)圖4皮膚細(xì)胞雙標(biāo)免疫組化結(jié)果(100×)和RT-PCR結(jié)果a，b為不同視野的實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚細(xì)胞的雙標(biāo)免疫組化結(jié)果?？占^指示C57BL/6源皮膚細(xì)胞；有尾實(shí)心箭頭指示BALB/C源的皮膚干細(xì)胞；無尾實(shí)心箭頭指示BALB/C源成熟皮膚細(xì)胞；c為陰性對(duì)照組小鼠皮膚細(xì)胞的雙標(biāo)免疫組化結(jié)果。有尾實(shí)心箭頭指示C57BL/6源的皮膚干細(xì)胞；無尾實(shí)心箭頭指示C57BL/6源成熟皮膚細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1 構(gòu)建實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?)供體小鼠骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞的制備將6-8周齡的BALB/C小鼠(購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)脫脊處死，以75％酒精浸泡消毒，以無菌手術(shù)剪子和鑷子取其后肢的脛骨和股骨，用注射器的針頭插入骨髓腔，以預(yù)冷的HANKS液(D-Hanks液配方(g/L)0.4g KCl，0.06g KH2P04，8.00g NaCl，0.35g NaHCO3，0.12g Na2HPO4.12H2O，0.01g酚紅，加超純水至1000ml；)沖出骨髓細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)吹打分散細(xì)胞后，再過4號(hào)針頭，使之成單細(xì)胞懸液，HANKS液和不完全RPMI1640培養(yǎng)液(購于LIFETECHNOLOGIES公司)各洗滌細(xì)胞一次(離心條件均為1000rpm，10min)，經(jīng)Ficoll(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，再經(jīng)磁珠(購于MACS公司)分選出CD45-Gly(-)的細(xì)胞。
加入特制的培養(yǎng)基(此培養(yǎng)基含DMEM，MCDB-201，2％FBS，10ng/ml EGF，10ng/mlPDGF-bb，10ng/ml LIF，insulin transferring selenium，linoleic acid，bovine sermalbumin(bsa).10-9M dexamethasone，和10-4M ascorbic acid 2-phosphate，均購于sigma公司)，按8×105/cm2接種至培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24-72小時(shí)后，棄除懸浮細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2-3天換液一次，至細(xì)胞80-90％融合后，以含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化3分鐘，傳代培養(yǎng)。
2)受體同品系小鼠骨髓細(xì)胞的制備將6-8周齡的C57BL/6小鼠(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所動(dòng)物部提供)脫脊處死，無菌取其后肢的脛骨和股骨，用注射器的針頭插入骨髓腔，以預(yù)冷的HANKS液沖出骨髓細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)吹打分散細(xì)胞后，再過4號(hào)針頭，使之成單細(xì)胞懸液，以EDTA-NH4Cl(配方(g/L)8.29g NH4Cl，1.0012g KHC03，29.225mg EDTA，加超純水至1000ml；)去除紅細(xì)胞，再以HANKS洗滌二次(離心條件均為1000rpm，10min)。用0.2％胎盤蘭染色按常規(guī)方法計(jì)算活細(xì)胞率，并以HANKS調(diào)整細(xì)胞至所需濃度備用。
3)受體小鼠的準(zhǔn)備將10-12周齡的C57BL/6小鼠(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所動(dòng)物部提供)進(jìn)行致死量照射(Gammacell 40，CES IUM 137，購于Atomic Energy of Canada Limited Radiochemical公司)，照射劑量為850Rad。
4)骨髓移植將1.5×107的C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞和5×105的BALB/C小鼠骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞由小鼠尾靜脈共同輸入經(jīng)致死劑量照射的C57BL/6小鼠體內(nèi)。
實(shí)施例2 鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?)用免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)新生皮膚細(xì)胞a)將陰性對(duì)照C57BL/6小鼠(MHC-I類抗原為H-2Kb)、陽性對(duì)照BALB/C小鼠(MHC-I類抗原為H-2Kd)及實(shí)驗(yàn)組小鼠的皮膚制成冰凍切片，以生物素化的抗H-2Kd單抗(購于BD公司)作為一抗，以DAB(購于DAKO A/S公司)為顯色系統(tǒng)進(jìn)行直接免疫組化試驗(yàn)。結(jié)果，陰性對(duì)照組切片上未見棕黃色的H-2Kd陽性細(xì)胞，且毛囊中可見明顯的黑色毛發(fā)片段；陽性對(duì)照組切片中可見較強(qiáng)棕黃色染色的H-2Kd陽性細(xì)胞，毛囊中未見有黑色毛發(fā)片段；在實(shí)驗(yàn)組切片中，毛囊中未見有黑色毛發(fā)片段，且在表皮和真皮層的毛囊周圍可見棕黃色的H-2Kd陽性細(xì)胞，提示這些細(xì)胞確為BALB/C小鼠來源。
b)用針對(duì)P63(一種表皮再生性增殖的轉(zhuǎn)錄因子，可作為角質(zhì)干細(xì)胞較為特異的標(biāo)志)和H-2Kd的兩種單抗作為一抗，對(duì)上述小鼠皮膚組織的冰凍切片進(jìn)行了雙標(biāo)免疫組化試驗(yàn)。首先以抗P63單抗(購于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司)進(jìn)行間接免疫組化試驗(yàn)，以BCIP/NBT作為顯色系統(tǒng)，出現(xiàn)深藍(lán)色為陽性結(jié)果；加入雙標(biāo)阻斷液后，以抗H-2Kd單抗進(jìn)行直接免疫組化試驗(yàn)，以AEC(購于DAKO A/S公司)作為顯色系統(tǒng)，鮮紅色為陽性結(jié)果。結(jié)果可見，陽性對(duì)照組切片中在毛囊較低部位含有皮膚干細(xì)胞處可見明顯雙陽性細(xì)胞，在其周圍是紅色H-2Kd單陽性細(xì)胞，提示為成熟皮膚細(xì)胞；在陰性對(duì)照組切片中，在毛囊處可見深藍(lán)色P63陽性細(xì)胞，而無紅色H-2Kd陽性細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組切片中則顯示毛囊處呈深藍(lán)色P63陽性皮膚干細(xì)胞，周圍為紅染的H-2Kd陽性細(xì)胞。
c)在無菌條件下獲取實(shí)驗(yàn)組小鼠含有白色毛發(fā)處的皮膚和陰性對(duì)照C57BL/6小鼠背部皮膚，并通過膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶(均購自SIGMA公司)消化等步驟，分離出皮膚細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，7-10天后，細(xì)胞達(dá)到90％融合后，收獲細(xì)胞，離心制成細(xì)胞涂片，然后再進(jìn)行上述雙標(biāo)免疫組化試驗(yàn)，并以麥?zhǔn)咸K木素進(jìn)行復(fù)染。實(shí)驗(yàn)組切片中既可見深藍(lán)色P63陽性和紅色H-2Kd陽性，即雙陽性細(xì)胞，提示此類細(xì)胞為供者源的皮膚干細(xì)胞，又可見紅色H-2Kd陽性，P63陰性，即單陽性細(xì)胞，提示此類細(xì)胞為供者源成熟皮膚細(xì)胞；從陰性對(duì)照組切片也可見兩類細(xì)胞，一類為H-2Kd陰性而P63陽性細(xì)胞，提示此類細(xì)胞為受者皮膚干細(xì)胞，另一類為H-2Kd和P63雙陰性細(xì)胞，提示為受者皮膚成熟細(xì)胞。從而排除了因組織切片免疫組化試驗(yàn)帶來的系統(tǒng)誤差的可能。從蛋白水平說明被測(cè)組織確實(shí)為H-2Kd陽性小鼠來源。
2)用RT-PCR手段從轉(zhuǎn)錄水平上鑒定皮膚細(xì)胞。
在無菌條件下獲取實(shí)驗(yàn)組小鼠含有白色毛發(fā)處的皮膚，并通過膠原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶消化等步驟，分離出皮膚細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，7-10天后，細(xì)胞達(dá)到90％融合后，收獲細(xì)胞，以TRIZOL(購于GIBCO公司)裂解細(xì)胞，獲取總RNA，利用RT-PCR試劑盒(購于TAKARA公司)和特異性H-2Kd cDNA引物(購于TAKARA公司)，擴(kuò)增出了特定長(zhǎng)度的H-2Kd cDNA片段，從基因水平說明被測(cè)組織確實(shí)為H-2Kd陽性小鼠來源。
3)將單純1.5×107的C57BL/6小鼠的骨髓細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)同樣致死劑量照射的C57BL/6小鼠體內(nèi)，則未見白色毛發(fā)的出現(xiàn)，說明該種毛發(fā)的轉(zhuǎn)變與照射無關(guān)。
實(shí)施例4在完成了兩組共12只C57BL/6小鼠(每組6只)體內(nèi)皮膚分化模型的構(gòu)建后，對(duì)所有小鼠的新生皮毛進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)和DNA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40天后，在12只受體小鼠中，有11只小鼠的背部黑毛中出現(xiàn)了白毛，并逐漸擴(kuò)展到3-4cm2，同時(shí)在其腹部及頸部也出現(xiàn)了白毛。說明用本發(fā)明之方法構(gòu)建的模型之重復(fù)率可達(dá)90％以上。
權(quán)利要求
1.建立成體骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化成皮膚組織的模型的方法，其特征在于，自成年BALB/C小鼠的骨髓中分離獲得并體外培養(yǎng)擴(kuò)增多能間充質(zhì)干細(xì)胞，將適量的供體BALB/C小鼠骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞和一定量的C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞一同植入經(jīng)致死量照射的成年C57BL/6小鼠體內(nèi)，待受體C57BL/6小鼠出現(xiàn)新生皮毛后，取該部位的皮膚組織進(jìn)行蛋白和基因水平的種系遺傳標(biāo)記測(cè)定，得成體骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化成皮膚干細(xì)胞和皮膚組織的模型。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述受體C57BL/6小鼠為10-12周齡。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟a)分別制備供體小鼠骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞、受體同品系小鼠骨髓細(xì)胞及受體小鼠；b)將供體小鼠骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞和受體同品系小鼠骨髓細(xì)胞一同植入受體小鼠體內(nèi)，對(duì)受體小鼠的新生皮毛進(jìn)行蛋白和基因水平種系遺傳標(biāo)記測(cè)定。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白水平種系遺傳標(biāo)記測(cè)定為用單標(biāo)免疫組化和雙標(biāo)免疫組化法檢測(cè)受鼠的新生皮膚，特別是以雙標(biāo)免疫組化法鑒定受鼠新生皮膚組織干細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因水平種系遺傳標(biāo)記測(cè)定為用RT-PCR法檢測(cè)受鼠的新生皮膚。
6.用如權(quán)利要求1所述的方法建立之動(dòng)物模型在皮膚再生醫(yī)學(xué)臨床前實(shí)驗(yàn)研究和/或臨床實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及骨髓等多種組織未分化細(xì)胞分離及鑒定的方法，具體涉及一種建立成體骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化成皮膚組織的模型的方法。其技術(shù)方案為自成年BALB/C小鼠的骨髓中分離獲得并體外培養(yǎng)擴(kuò)增多能間充質(zhì)干細(xì)胞，將適量的供體BALB/C小鼠骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞和一定量的C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞共同植入經(jīng)致死量照射的成年C57BL/6小鼠，待受體C57BL/6小鼠出現(xiàn)新生皮毛后，取該部位的皮膚組織進(jìn)行蛋白和基因水平的種系遺傳標(biāo)記測(cè)定，得成體骨髓源多能間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)分化成皮膚干細(xì)胞及皮膚組織的模型。本發(fā)明可應(yīng)用于皮膚再生醫(yī)學(xué)的臨床前和/或臨床實(shí)驗(yàn)研究中。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1502691SQ0214548
公開日2004年6月9日 申請(qǐng)日期2002年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月19日
發(fā)明者趙春華, 鄧為民 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所