專利名稱：大白菜cor25蛋白編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生理學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在大白菜(Brassica pekinensis)中表達(dá)的COR25蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
本發(fā)明中，我們從十字花科植物大白菜(Brassica pekinensis)中克隆到擬南芥COR47基因的同源基因COR25。
在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開(kāi)或報(bào)道過(guò)本專利申請(qǐng)中提及的大白菜COR25蛋白序列及其核酸序列。
本發(fā)明的第二目的是提供一種新的大白菜冷相關(guān)蛋白(COR25)。
本發(fā)明的第三目的是提供這種大白菜冷相關(guān)蛋白多肽和編碼序列在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗逆(耐低溫和耐旱)上的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有大白菜冷相關(guān)蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的大白菜冷相關(guān)蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是煙草。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有大白菜冷相關(guān)蛋白活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物以提高植物抗逆(耐低溫和耐旱)的方法，其步驟如下(1)將編碼具有大白菜冷相關(guān)蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達(dá)調(diào)控序列，形成含大白菜冷相關(guān)蛋白基因的植物表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，如農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的植物細(xì)胞(如農(nóng)桿菌)同真核宿主細(xì)胞共培養(yǎng)，在22-28℃條件下，暗培養(yǎng)1-2天后，通過(guò)篩選如抗生素篩選，獲得含有大白菜冷相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。含有大白菜冷相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫和干旱具有增強(qiáng)的抗性作用。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第103-765位的序列。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“大白菜冷相關(guān)蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有大白菜冷相關(guān)蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第103-765位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第103-765位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.3中第103-765位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的大白菜冷相關(guān)相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“大白菜冷相關(guān)蛋白或多肽”指具有大白菜冷相關(guān)蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然大白菜冷相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括大白菜冷相關(guān)蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的大白菜冷相關(guān)多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與大白菜冷相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗大白菜冷相關(guān)多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“大白菜冷相關(guān)保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1


發(fā)明還包括大白菜冷相關(guān)蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然大白菜冷相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的大白菜冷相關(guān)多肽時(shí)，可以將大白菜冷相關(guān)編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成大白菜冷相關(guān)蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析大白菜冷相關(guān)基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析大白菜冷相關(guān)的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有大白菜冷相關(guān)核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼大白菜冷相關(guān)的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在大白菜冷相關(guān)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于大白菜冷相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的大白菜冷相關(guān)核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選大白菜冷相關(guān)同源基因或同源蛋白。
為了得到與大白菜冷相關(guān)基因相關(guān)的大白菜cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選大白菜eDNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)大白菜冷相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自大白菜的文庫(kù)。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買(mǎi)到，例如購(gòu)自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與大白菜冷相關(guān)相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的大白菜冷相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列。在本申請(qǐng)之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過(guò)先合成多個(gè)多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明大白菜冷相關(guān)蛋白的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來(lái)自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
利用本發(fā)明的大白菜冷相關(guān)蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與大白菜冷相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
表2為本發(fā)明的大白菜冷相關(guān)蛋白(COR25)與擬南芥冷相關(guān)蛋白(COR47)的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表3為本發(fā)明的大白菜冷相關(guān)蛋白(COR25)與擬南芥冷相關(guān)蛋白(COR47)的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，相似的氨基酸用“+”標(biāo)出。
實(shí)施例1大白菜冷相關(guān)基因的克隆1.組織分離(isolation)大白菜(品種為“早熟5號(hào)”)來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，將大白菜置于5℃處理3天后，立即將大白菜葉片置于液氮中冷凍保存。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50mL管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。
3.基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)擬南芥冷相關(guān)氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(1)RT-PCRPCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到2002BP(679bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)冷相關(guān)基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)冷相關(guān)基因。
(2)3′-RACEPCR[AP+BP003(5’-GATTCTCAAGTCGTCABPCCGGAGG-3’)]得到2002BP3’(358bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)冷相關(guān)基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)冷相關(guān)基因。
(3).5′-RACE第一輪PCR[AAP+BP004(5’-GGCTTATGCTCCTCTTCTTCGTGC-3’)]第二輪PCR[(AUAP+BPR005(5’-CGAACAAGCCACGATCCTTAACCT-3’))得到2001BP 5′(約700bp)(過(guò)程同(1))將測(cè)序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)過(guò)程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結(jié)果證明從大白菜中新得到的基因確為一個(gè)與植物冷相關(guān)的基因。
通過(guò)組合使用上述3種方法，獲得了候選的大白菜冷相關(guān)蛋白的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.3)。
實(shí)施例2大白菜冷相關(guān)基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的大白菜冷相關(guān)全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為955bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.3，其中開(kāi)放讀框位于103-765位核苷酸(663個(gè)核苷酸)。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出大白菜冷相關(guān)的氨基酸序列，共220個(gè)氨基酸殘基，分子量為24899.32道爾頓(因此將該基因命名為COR25)，等電點(diǎn)(pI)為5.05。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.4。
將大白菜冷相關(guān)的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與擬南芥冷相關(guān)基因Cor47在核苷酸水平上具有44％的相同性(附表2)；在氨基酸水平上，它與擬南芥冷相關(guān)蛋白COR47有43％的相同性和49％的相似性(附表3)。由此可見(jiàn)，大白菜冷相關(guān)基因與擬南芥冷相關(guān)基因無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。
實(shí)施例3大白菜冷相關(guān)基因Cor25在大白菜中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從大白菜葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用EcoRI和BamHI酶切DNA[10μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后，用DIG標(biāo)記的Cor25的全長(zhǎng)編碼序列為探針對(duì)膜進(jìn)行雜交(于65℃雜交16小時(shí))。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于42℃漂洗3次，每次5分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于55℃-65℃漂洗1-3次，用X光片壓片10-30分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說(shuō)明書(shū))。結(jié)果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)多條雜交條帶，說(shuō)明Cor25基因在大白菜中存在有多個(gè)拷貝(附

圖1。1EcoRI酶切；2BamHI酶切)。
實(shí)施例4大白菜冷相關(guān)基因Cor25在大白菜中的表達(dá)譜分析1.RNA的提取將大白菜分別置于干旱下處理2小時(shí)、100μM(微摩爾)的ABA(脫落酸)處理4小時(shí)、低溫(5℃)處理(0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、1天、10天)，以及低溫(5℃)處理后置于常溫(24℃)2小時(shí)、4小時(shí)后，提取RNA(RNA的制備參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測(cè)OD260；RNA含量計(jì)算1OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無(wú)菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(40μg)溶解于15mlRNA稀釋溶液中，在55℃-65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。9)在電泳液未蓋過(guò)膠的條件下點(diǎn)樣，80V電壓電泳10分鐘，待樣品全部進(jìn)入膠后，加電泳液蓋過(guò)膠面約半厘米。80-100V電泳5小時(shí)。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤(rùn)的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤(rùn)，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤1-2小時(shí)。
05.膜上RNA的檢測(cè)1)將膜浸在4*SSC中10分鐘，取出膜置濾紙上吸去多余的液體，將膜放入預(yù)雜交液中[50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸鈉(pH6.4)，5*Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚(yú)精DNA]，42℃下預(yù)雜交過(guò)夜。2)倒出預(yù)雜交液，換入等量的雜交液，將用DIG標(biāo)記的探針(Cor25的全長(zhǎng)編碼序列)在沸水中變性5分鐘，加入雜交液[50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸鈉(pH6.4)，10％葡聚糖硫酸脂，1*Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚(yú)精DNA]中，于42℃雜交16-24小時(shí)。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于42℃漂洗3次，每次5分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于55℃-65℃漂洗1-3次。4)用X光片壓片10-30分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說(shuō)明書(shū))。結(jié)果(Northem blot)發(fā)現(xiàn)，干旱處理(2小時(shí))和ABA處理(100μM，4小時(shí))都能誘導(dǎo)COR25基因的表達(dá)；COR25基因的表達(dá)也隨著低溫(5℃)處理時(shí)間的增長(zhǎng)而增強(qiáng)，低溫(5℃)處理10天后表達(dá)量達(dá)到最高；當(dāng)將大白菜從低溫(5℃)處理10天后置于常溫(24℃)2小時(shí)和4小時(shí)，COR25基因的表達(dá)量逐漸降低，證明COR25基因是與冷、旱和ABA誘導(dǎo)有關(guān)的基因(附圖2。1干旱處理2小時(shí)；2100μM ABA處理4小時(shí)；3不處理(對(duì)照)；4低溫(5℃)處理2小時(shí)；5低溫(5℃)處理4小時(shí)；6低溫(5℃)處理8小時(shí)；7低溫(5℃)處理1天；8低溫(5℃)處理10天；9低溫(5℃)處理后置于常溫(26℃)2小時(shí)；10低溫(5℃)處理后置于常溫(24℃)4小時(shí))。
實(shí)施例5大白菜冷相關(guān)蛋白或多肽在煙草細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的耐寒和耐旱性鑒定含目的基因(大白菜COR25基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)大白菜冷相關(guān)的全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將大白菜冷相關(guān)cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤(pán)法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
利用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草1.用無(wú)菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽(yáng)性菌落，接種于2ml YEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生長(zhǎng)兩周左右的煙草的無(wú)菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見(jiàn)方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無(wú)菌濾紙上吸干菌液；6.把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時(shí)；7.將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見(jiàn)愈傷組織的形成；8.約20天后可見(jiàn)分化芽長(zhǎng)出，待芽長(zhǎng)大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9.等根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開(kāi)始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
含大白菜COR25基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐寒和耐旱性鑒定鑒于編碼COR如擬南芥的COR47和COR17的基因已被證明對(duì)寒和旱脅迫具有抗性，而大白菜COR25與擬南芥的COR47具有較高的同源性，我們進(jìn)一步對(duì)含大白菜COR25的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行耐寒和耐旱性鑒定。用低溫(5℃)處理(0小時(shí)、8小時(shí)、1天、10天、20天)、干旱處理轉(zhuǎn)基因植株(2小時(shí)、1天、10天、20天)后研究COR25基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況以及各種處理對(duì)植株的存活率的影響。Northern blot分析結(jié)果證明，COR25基因在低溫和干旱脅迫時(shí)表達(dá)量增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫和干旱的耐受性與轉(zhuǎn)基因植株中COR25基因的表達(dá)量成正比，轉(zhuǎn)基因植株能耐受低溫和干旱處理，經(jīng)低溫或干旱處理20天后仍然成活，而非轉(zhuǎn)基因植株(對(duì)照)在低溫或干旱處理20天后最終死亡，證明COR25基因?qū)Φ蜏?寒冷)和干旱確有抗性。大白菜COR25基因?qū)⒖捎糜诶棉D(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗逆(耐寒和耐旱)的研究和產(chǎn)業(yè)化中。
表244％identity in 965nt overlapQuery 1 atggctgaggagtacaagaacgcttctgaggagttcaagaacgtccccgaacacgagacc 60||||||||||||||||||||| ||||| ||||| ||||||||Sbjct 90 atggctgaggagtacaagaac-----------------aacgttcccgagcacgagaca 131Cold and ABA regulated gene 30 M A E E Y K N N V P E H E TQuery 61 ccaaag--------------atcaccaccacggaggaaccatcggcggcgacgggagagg 106|||| | |||||||||| |||| |||||Sbjct 132 ccaacggtcgcaacagaggaatcacca----------------gcgacgacaacagagg 174Cold and ABA regulated gene 44 P T V A T E E S P A T T T EQuery 107 ttaaggatcgtggcttgttcgatttcttggggaaaaa---agaggaagtgaaacctcaag 163||| ||||||||| ||||| |||||||||||||| || ||||||||||||||||||||Sbjct 175 ttacggatcgtggattgtttgatttcttggggaagaaggaagaggaagtgaaacctcaag 234Cold and ABA regulated gene 58 V T D R G L F D F L G K K E E E V K P QQuery 164 a---aacgaccacaccgctagcgtcggaggtcgagcataaagctcagatcacggaagagc 220| |||||| ||| | ||| ||| |||| ||||| ||||||||| | ||| |Sbjct 235 agacaacgac------gctcgagtctgagttcgatcataaggctcagatctctgaa---c 285Cold and ABA regulated gene 78 E T T TL E S E F D H K A Q I S EQuery 221 cggcgtctgtggcgaagcacgaagaag---aggagcataagcctactctcctcgagcagc 277||| || | ||| ||||||| |||| ||||| | ||| |||||| || ||| |||Sbjct 286 cggagttagctgcggagcacgaggaagtgaaggagaacaagattactctgctagaggagc 345Cold and ABA regulated gene 95 P E L A A E H E E V K E N K I T L L E EQuery 278 ttcaccagaagcacgaggaggaagaggagaacaagcccagtctcttacagaagcttcacc 337|||| | ||| |||||| || |||||||||||||| ||| || | | ||||||||||Sbjct 346 ttcaagaaaagaccgaggaagatgaggagaacaagcctagtgtcatcgaaaagcttcacc 405Cold and ABA regulated gene 115 L Q E K T E E D E E N K P S V I E K L HQuery 338 gatccaacagctcctcttcctcttcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 397||||||||||||| |||||||||||Sbjct 406 gatccaacagctcttcttcctcttc----------------------------------- 430Cold and ABA regulated gene 135 R S N S S S S S SQuery 398 nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnggagtgatg------- 450||| ||||Sbjct 431 ---------------------------------------------gagcgatgaagaagg 445Cold and ABA regulated gene 144 S D E E GQuery 450 ------------------------------------------------------------ 450Sbjct 446 tgaggaaaagaaggagaagaagaagaagatcgttgaaggagaggaagataagaaaggact 505Cold and ABA regulated gene 149 E E K K E K K K K I V E G E E D K K G LQuery 451 ----gagaagatcaaagagaagcttccaggtcacagcgaaaaacctgatgattctcaagt 506||||||||||| |||||||| ||||| |||Sbjct 506 agtggagaagatcaaggagaagctcccaggacac-------------------------- 539Cold and ABA regulated gene 169 V E K I K E K L P G HQuery 507 cgtcaacacggaggctgca----------------------------------------- 525||Sbjct 540------------------cacgacaagacagcagaggatgatgtaccagtttccactacca 582Cold and ABA regulated gene 180 H D K T A E D D V P V S T TQuery 526 -----gtaccagtgtcgga----------------------------------------- 539||||||||||||||Sbjct 583 tcccggtaccagtgtcggagagtgtggtggagcatgaccatcccgaggaagagaagaaag 642Cold and ABA regulated gene 194 I P V P V S E S V V E H D H P E E E K KQuery 539------------------------------------------------------------- 539Sbjct 643 gattagttgagaagatcaaggagaagcttcctggtcaccacgacgagaaagcagaggatt 702Cold and ABA regulated gene 214 G L V E K I K E K L P G H H D E K A E DQuery 540------------------------------------tgaaacgg--------------cgg 550|| ||||| |||Sbjct 703 caccagctgtcacgtccacgccgttggttgtaacggagcatccggtggagcctacgacgg 762Cold and ABA regulated gene 234 S P A V T S T P L V V T E H P V E P T TQuery 551 agc------------atccggaggagaagaaagggattctcgaaaagatcaaagagaagc 598||| |||||||||||||||| |||||| | |||||||||||||||||||Sbjct 763 agcttccagtggaacatccggaggagaagaaggggattttggaaaagatcaaagagaagc 822Cold and ABA regulated gene 254 E L P V E H P E E K K G I L E K I K E KQuery 599 ttccaggttatcatgctaagagttctgaagaggaggagaagaaagaaaaagagtctgatg 658|||||||||||||||| |||| |||||||||| | |||||||||||||||||||||||Sbjct 823 ttccaggttatcatgccaagaccactgaagaggaagtgaagaaagaaaaagagtctgatg 882Cold and ABA regulated gene 274 L P G Y H A K T T E E E V K K E K E S DQuery 659 attaa 663|||||Sbjct 883 attaa 887Cold and ABA regulated gene 294 D ^^^Query大白菜冷相關(guān)蛋白COR25的核酸序列Sbjct擬南芥冷相關(guān)蛋白COR47的核酸序列(X59814.1)表343％ identity in 188aa overlap，49％similarity in 188aa overlapQuery1 MAEEYKNASEEFKNVPEHETPKITTTEEPSAATGEVKDRGLFDFLGKK-EEVKPQETTTP 59MAEEYKN NVPEHETP + T E P A T EV DRGLFDFLGKK EEVKPQETTTSbict30 MAEEYKN------NVPEHETPTVATEESP-ATTTEVTDRGLFDFLGKKEEEVKPQETTT- 81Query60 LASEVEHKAQITEEPASVAKHEE-EEHKPTXXXXXXXXXXXXXXNKPSLLQKLHRXXXXX 118L SE +HKAQI+ EP A+HEE +E+K T NKPS+++KLHRSbict82 LESEFDHKAQIS-EPELAAEHEEVKENKITLLEELQEKTEEDEENKPSVIEKLHR---SN 137Query119 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXLPGHSEK-PDDSQVVNTEAAVP 177LPGH +K +D V+T VPSbict138 SSSSSSSDEEGEEKKEKKKKIVEGEEDKKGLVEKIKEKLPGHHDKTAEDDVPVSTTIPVP 197Query178 VSDETAEH 185VS+ EHSbict198 VSESVVEH 205Query大白菜冷相關(guān)蛋白COR25氨基酸序列Sbjct擬南芥冷相關(guān)蛋白COR47氨基酸序列(CAA42483.1)本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1GCGGATCCATGGCTGAGGAGTACAAGAAC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2TCGAGCTCTTAATCATCAGACTCTTTTTC(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度955bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.31 atcacagctc tttactatca ccttaaaagc aaagttaaag ctctcatagt ctctgtttac61 atttctcgtt aactgttcaa tattgatcaa gagtaactaa ccatggctga ggagtacaag121 aacgcttctg aggagttcaa gaacgtcccc gaacacgaga ccccaaagat caccaccacg181 gaggaaccat cggcggcgac gggagaggtt aaggatcgtg gcttgttcga tttcttgggg241 aaaaaagagg aagtgaaacc tcaagaaacg accacaccgc tagcgtcgga ggtcgagcat301 aaagctcaga tcacggaaga gccggcgtct gtggcgaagc acgaagaaga ggagcataag361 cctactctcc tcgagcagct tcaccagaag cacgaggagg aagaggagaa caagcccagt421 ctcttacaga agcttcaccg atccaacagc tcctcttcct cttcaagcga ggaagaaggt481 gaagatggtc aaaagaggaa gaaggagaag aagaagaaga tcgtcgaagg agaagagaag541 aagggagtga tggagaagat caaagagaag cttccaggtc acagcgaaaa acctgatgat601 tctcaagtcg tcaacacgga ggctgcagta ccagtgtcgg atgaaacggc ggagcatccg661 gaggagaaga aagggattct cgaaaagatc aaagagaagc ttccaggtta tcatgctaag721 agttctgaag aggaggagaa gaaagaaaaa gagtctgatg attaagaaag ttgaacgaat781 atataatgat attggagtcg gacatttgct gtgtttcttt ctgtgatgat ttctccttta841 tgttttaagc tgttctgtaa gattgtgttt ttcgttggtt gcatttagca cctttgtatt901 gtaatttgca ttgtctattt tataaagttc gcatatggta aaaaaaaaaa aaaaa(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度220氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.41 MAEEYKNASE EFKNVPEHET PKITTTEEPS AATGEVKDRG LFDFLGKKEE VKPQETTTPL61 ASEVEHKAQI TEEPASVAKH EEEEHKPTLL EQLHQKHEEE EENKPSLLQK LHRSNSSSSS121 SSEEEGEDGQ KRKKEKKKKI VEGEEKKGVM EKIKEKLPGH SEKPDDSQVV NTEAAVPVSD181 ETAEHPEEKK GILEKIKEKL PGYHAKSSEE EEKKEKESDD
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有大白菜COR25蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位的核苷酸序列。
4.一種分離出的大白菜COR25蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其特征在于它是真核細(xì)胞。
8.一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有COR25蛋白活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物以提高植物抗逆的方法，特征在于其步驟如下(1)將編碼具有大白菜COR25蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達(dá)調(diào)控序列，形成含大白菜COR25蛋白的植物表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第103-765位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；(3)通過(guò)篩選，獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。轉(zhuǎn)基因植物及其后代對(duì)逆境具有增強(qiáng)的抗性。
9.一種核酸分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
10.一種用于檢測(cè)樣品中是否存在大白菜COR25核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用權(quán)利要求9所述探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于大白菜COR25核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長(zhǎng)度為15～50個(gè)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在大白菜中表達(dá)的新的COR25蛋白、編碼序列及其在改良植物抗逆(耐低溫和耐旱)上的應(yīng)用。本發(fā)明涉及包含所說(shuō)基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體。還涉及被所說(shuō)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的所說(shuō)基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。本發(fā)明將所說(shuō)基因在植物中表達(dá)，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)逆境(低溫和干旱)具有增強(qiáng)的抗性。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1415752SQ0214527
公開(kāi)日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2002年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者唐克軒, 盧泳全, 孫小芬, 姚劍虹, 吳為人 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)