專利名稱：可吸收煅燒骨的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明可吸收煅燒骨的制備方法是一種可吸收雙相煅燒骨的制備、涂層及細(xì)胞復(fù)合法，涉及一種鈣磷陶瓷生物材料和骨組織工程的支架。
人工合成的生物陶瓷往往因孔隙間的交通不足而影響骨組織進(jìn)入材料深部。煅燒骨的孔隙與松質(zhì)骨有相似的結(jié)構(gòu)，有良好的孔與孔之間的交通，有利于成骨細(xì)胞、血管的長(zhǎng)入，具有良好的傳導(dǎo)成骨作用。傳統(tǒng)方法制作的煅燒骨主要由HAP組成，雖HAP能直接與新生骨結(jié)合，但在體內(nèi)難以吸收，從而影響了新生骨的后期重塑，并影響其生物力學(xué)的強(qiáng)度。因此有必要將煅燒骨中HAP部分或完全轉(zhuǎn)化為β-TCP。
另外，未經(jīng)表面改性的煅燒骨不利于細(xì)胞的貼附，材料表面改性的方法在文獻(xiàn)中有用纖維連接素、膠原等促進(jìn)細(xì)胞與材料的貼附。傳統(tǒng)的方法單純用膠原溶液浸泡煅燒骨，晾干后使用，細(xì)胞貼附也不好，需對(duì)煅燒骨的表面膠原涂層方法進(jìn)行改進(jìn)。
材料與細(xì)胞的復(fù)合方法是組織工程的難點(diǎn)，表面的貼附效率和密度是復(fù)合中要解決的難題，文獻(xiàn)中有用纖維蛋白原等提高細(xì)胞在材料內(nèi)部的聚集，材料和細(xì)胞的復(fù)合方法仍需改進(jìn)。
本發(fā)明的目的可通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種可吸收的雙相煅燒骨，可作為骨缺損的修復(fù)材料，HAP和β-TCP雙相煅燒骨其以成年牛椎體骨為原料，如使用內(nèi)徑16-18mm的空心電鉆，鉆取椎體中心的松質(zhì)骨，經(jīng)處理后，通過(guò)浸漬(NH4)2HPO4溶液、經(jīng)一次性煅燒和降低煅燒溫度，將煅燒骨中的HAP部分或完全轉(zhuǎn)化為β-TCP，其中煅燒溫度為900-1300℃。本發(fā)明原理是羥基磷灰石是骨的主要成分，當(dāng)(NH4)2HPO4溶液(AP)液滲入牛煅燒骨(CBB)，其中的HPO42-離子加熱后濃縮成P2O74-，P2O74-能與CBB的HAP的OH-反應(yīng)，產(chǎn)生PO43-離子。(NH4)2HPO4溶液的濃度和煅燒的次數(shù)、溫度及時(shí)間是決定β-TCP/HAP雙相煅燒骨成分、含量和結(jié)晶度的重要因素。通過(guò)降低煅燒溫度來(lái)降低結(jié)晶度，有利于材料的吸收。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，制備四種多用的煅燒骨，其β-TCP/HAP比例分別是4/6、6/4、8/2和10/0時(shí)，(NH4)2HPO4溶液濃度分別是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。
在上述技術(shù)方案基礎(chǔ)上，對(duì)煅燒骨及多孔材料采用膠原凝膠表面涂層，2-4mg/ml的膠原溶液經(jīng)對(duì)pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液在冷藏室內(nèi)透析，涂層時(shí)與1/10體積的10倍濃度的PBS混合，37℃溫育1小時(shí)。其原理是膠原溶液交聯(lián)成凝膠，膠原纖維貼于煅燒骨孔隙表面，有利于細(xì)胞的貼附，并消除對(duì)細(xì)胞的毒性及對(duì)機(jī)體的免疫原性。
經(jīng)過(guò)表面涂層處理的雙相煅燒骨可與細(xì)胞復(fù)合，細(xì)胞與煅燒骨及多孔材料的復(fù)合方法收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，讓細(xì)胞懸液完全吸入材料內(nèi)，培養(yǎng)箱中孵育2-5小時(shí)，加入含血清培養(yǎng)液，孵育3-8天后植入體內(nèi)。解決了傳統(tǒng)的材料與細(xì)胞的復(fù)合方法存在的缺陷，即細(xì)胞丟失多，細(xì)胞活力差，細(xì)胞密度底，本發(fā)明所述的煅燒骨與細(xì)胞的復(fù)合方法，可提高細(xì)胞在材料內(nèi)部的貼附效率、密度和活性。
具體煅燒骨的制備松質(zhì)骨的來(lái)源取成年牛椎體或股骨頭及股骨下端，用內(nèi)徑16-18mm的空心電鉆鉆取椎體中心或股骨下端的松質(zhì)骨。牛椎體松質(zhì)骨內(nèi)部孔隙呈縱形小管，小管之間有側(cè)孔相交通，抗壓強(qiáng)度比較高，本發(fā)明優(yōu)選椎體松質(zhì)骨。股骨下端的松質(zhì)骨的孔隙呈網(wǎng)狀，但骨小梁較纖細(xì)，抗壓強(qiáng)度較低。首先對(duì)原料預(yù)處理，目的是盡可能去除雜質(zhì)、軟組織、脂肪和骨髓。流水沖洗，蒸餾水漂洗，去離子水煮沸5-12小時(shí)，最佳時(shí)間是10小時(shí)，高壓流水沖洗，去離子水漂洗2次，系列酒精脫水，烘干，溫度為50℃-70℃，4天；其次，進(jìn)行初次煅燒在高溫爐中煅燒，800℃，3小時(shí)，升溫速率為5℃-10℃/分。該步驟可以省略，以簡(jiǎn)化步驟；再次進(jìn)行浸漬煅燒骨塊浸泡于(NH4)2HPO4溶液中24小時(shí)，去除多余液體，50℃-70℃烘干4天。制備四種多用的煅燒骨(β-TCP/HAP比例分別是4/6、6/4、8/2和10/0)時(shí)的(NH4)2HPO4溶液濃度分別是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。再次煅燒在高溫爐中900℃-1300℃，1-4小時(shí)，升溫速率為5℃/分，自然降溫。溫度過(guò)高鈣磷陶瓷的結(jié)晶度過(guò)高，材料不易吸收，最佳溫度是1000℃。流水沖洗，去離子水漂洗2次，50℃-70℃烘干4天，高溫消毒備用，

圖1β-TCP/HAP雙相可吸收煅燒骨。膠原表面涂層可溶性膠原溶液，可購(gòu)自Cohesion公司的Vitrogen牌膠原或羅氏公司及Sigma公司的可溶性膠原，也可從豬、牛的真皮和肌腱中用3％的醋酸提取，4-6℃冷藏，pH2-4，濃度2-4mg/ml。透析可去除醋酸等對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)，并有利于形成凝膠。取4-6℃冷藏可溶性膠原溶液，裝入透析袋，對(duì)去離子水配置的稀鹽酸溶液，pH為3.0，透析6-10天或以上，置于4-6℃冷藏室中，磁力攪拌，每100ml膠原溶液對(duì)1.5-2L的透析液，每?jī)商鞊Q液一次，共2-3次。臨用前從冰箱取出，與1/10體積的10倍濃度的PBS混合，立即將煅燒骨投入液中，抽真空，反復(fù)三次，或?qū)⒒旌弦旱蔚届褵巧稀?7℃溫育0.5-2小時(shí)，使膠原形成凝膠，超凈臺(tái)內(nèi)晾干，去離子水沖洗2次，超凈臺(tái)內(nèi)晾干，環(huán)氧乙烷消毒，如圖2膠原表面涂層后的煅燒骨。
另一種涂層方法是用pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)膠原濃度為2mg/ml，用針頭濾器超濾消毒，4-6℃冷藏。用前取出，與1/10體積的10倍的不含NaCl的PBS混合，立即將高溫消毒過(guò)的煅燒骨投入液中，37℃溫育0.5-2小時(shí)，使膠原形成凝膠，放置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，打開(kāi)蓋子，超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射干燥，無(wú)菌容器包裝備用，可不需環(huán)氧乙烷消毒。上述兩種膠原表面涂層方法也適合于其他多孔材料的表面涂層。細(xì)胞與材料的復(fù)合方法培養(yǎng)并收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，用含血清a-MEM制成0.5-5×107個(gè)/1ml細(xì)胞懸液，滴入煅燒骨中，或?qū)㈧褵峭度霊乙褐校檎婵?，一個(gè)大氣壓，每次10-20秒，間隔5-15秒，反復(fù)三次，讓細(xì)胞懸液完全吸入材料內(nèi)。培養(yǎng)箱中孵育2-5小時(shí)，緩慢加入20-30ml含血清培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2的條件下孵育3-8天后植入體內(nèi)。該方法同樣適合其他多孔材料與細(xì)胞復(fù)合。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于可吸收雙相煅燒骨可用于修復(fù)骨缺損、骨不連、脊柱融合，并可以作為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞的載體，構(gòu)建組織工程化人工骨，也可用此可吸收雙相煅燒骨作為BMP的緩釋載體修復(fù)骨缺損。經(jīng)X線衍射分析加0.3M，0.6M，1.0M和1.2M的AP液組制備的三種煅燒骨出現(xiàn)典型的β-TCP的波型，其中β-TCP/HAP比例分別是4/6，6/4，8/2和10/0，其中4/6如圖3所示，X線衍射分析示浸漬AP液后的煅燒骨(中)出現(xiàn)典型的β-TCP和HAP的混合波型。掃描電鏡觀察雙相煅燒骨孔徑和孔隙率均與松質(zhì)骨相似，孔徑約400-600μm，孔隙率約85％，均保留骨陷窩的結(jié)構(gòu)，如圖4，掃描電鏡觀察示雙相煅燒骨孔徑約400-600μm，孔隙率約85％，孔隙間交通良好(40×)。超微結(jié)構(gòu)觀察(2000-4000倍)見(jiàn)材料有蜂窩狀微孔。雙相煅燒骨比HAP煅燒骨孔隙率較高，微孔較大，約0.5-5μm，如圖5超微結(jié)構(gòu)觀察見(jiàn)煅燒骨有蜂窩狀微孔。雙相煅燒骨比HAP煅燒骨孔隙率較高，微孔較大，約0.5-5μm(2000×)；生物力學(xué)測(cè)定β-TCP的存在對(duì)煅燒骨的力學(xué)性能無(wú)明顯影響，最大抗壓強(qiáng)度3.188±0.943，彈性模量85.327±21.534。細(xì)胞在材料表面的貼附能力掃描電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞在材料表面貼附良好，細(xì)胞呈扁平的梭形、多邊形或多角形。表面涂層后，4小時(shí)細(xì)胞部分貼壁，24小時(shí)基本匯合；4天部分呈復(fù)層生長(zhǎng)，如圖6，表面涂層的煅燒骨與細(xì)胞復(fù)合后4天，細(xì)胞部分呈復(fù)層生長(zhǎng)(200×)；8天呈復(fù)層生長(zhǎng)，如圖7，表面涂層的煅燒骨與細(xì)胞復(fù)合后8天，細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)(200×)；30天呈網(wǎng)狀完全長(zhǎng)滿孔隙。復(fù)合后4-8天是植入的最佳時(shí)機(jī)。
裸鼠皮下誘導(dǎo)成骨試驗(yàn)3周，煅燒骨加BMSC組可見(jiàn)煅燒骨表面有大量類骨質(zhì)形成，以直接成骨為主，有少量軟骨內(nèi)成骨，如圖8，裸鼠皮下誘導(dǎo)成骨試驗(yàn)，復(fù)合BMSC的煅燒骨植入后3周，可見(jiàn)煅燒骨表面有大量類骨質(zhì)形成(100×)。5周材料表面成熟骨痂明顯，與材料無(wú)明顯界限，見(jiàn)圖9，裸鼠皮下誘導(dǎo)成骨試驗(yàn)5周，材料表面成熟骨痂明顯，與材料無(wú)明顯界限(100×)。本發(fā)明表明雙相煅燒骨與BMSC復(fù)合組織工程化人工骨有良好的誘導(dǎo)成骨作用，說(shuō)明雙相煅燒骨是BMSC的良好的載體。
吸收時(shí)間6個(gè)月時(shí)β-TCP/HAP比例分別是4/6的吸收率約40％，1年時(shí)吸收60％。β-TCP/HAP比例分別是8/2的吸收率6個(gè)月約70％，1年時(shí)完全吸收，該比例符合骨折愈合的需要。
圖5超微結(jié)構(gòu)觀察見(jiàn)煅燒骨有蜂窩狀微孔。雙相煅燒骨比HAP煅燒骨孔隙率較高，微孔較大，約0.5-5μm(2000×)圖6表面涂層的煅燒骨與細(xì)胞復(fù)合后4天，細(xì)胞部分呈復(fù)層生長(zhǎng)(200×)圖7表面涂層的煅燒骨與細(xì)胞復(fù)合后8天，細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)(200×)圖8裸鼠皮下誘導(dǎo)成骨試驗(yàn) 復(fù)合BMSC的煅燒骨植入后3周，可見(jiàn)煅燒骨表面有大量類骨質(zhì)形成(100×)圖9裸鼠皮下誘導(dǎo)成骨試驗(yàn) 5周，材料表面成熟骨痂明顯，與材料無(wú)明顯界限(100×)
方法2取成年牛椎體骨，用內(nèi)徑16-18mm的空心電鉆鉆取椎體中心的松質(zhì)骨。流水沖洗，蒸餾水漂洗，蒸餾水煮沸10小時(shí)，流水沖洗，去離子水漂洗2次，系列酒精脫水，50℃烘干4天。骨塊浸泡于(NH4)2HPO4溶液中24小時(shí)，傾去多余液體，50℃烘干4天。在高溫爐中煅燒，1000℃，3小時(shí)，升溫速率為5℃/分，自然降溫。流水沖洗，去離子水漂洗兩次，50℃烘干4天，高溫消毒備用。制備四種多用的煅燒骨(β-TCP/HAP比例分別是4/6和8/2和10/0)時(shí)的(NH4)2HPO4溶液濃度分別是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。
2.膠原表面涂層可溶性膠原溶液，可購(gòu)自Cohesion公司的Vitrogen牌或羅氏公司可溶性膠原，也可從豬、牛的真皮和肌腱中用3％的醋酸提取，4-6℃冷藏，PH3，2-4mg/ml。取4-6℃冷藏可溶性膠原溶液，裝入透析袋(預(yù)煮沸30分鐘消毒并脫甘油)，對(duì)pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液透析8天，置于4-6℃冷藏室中，磁力攪拌，100ml膠原溶液對(duì)1.5L的透析液，每?jī)商鞊Q液一次，共三次。臨用前從冰箱取出，與1/10體積的10倍的PBS混合，立即將煅燒骨投入液中，抽真空，反復(fù)三次，或?qū)⒒旌弦旱蔚届褵巧稀?7℃溫育1小時(shí)，使膠原形成凝膠，超凈臺(tái)內(nèi)晾干，去離子水沖洗2次，超凈臺(tái)內(nèi)晾干，環(huán)氧乙烷消毒。
另一種涂層方法是用pH為3.0去離子水調(diào)節(jié)膠原濃度為2mg/ml，用針頭濾器超濾消毒，4-6℃冷藏。用前取出，與1/10體積的10倍的不含NaCl的PBS混合，立即將高溫消毒過(guò)的煅燒骨投入液中，37℃溫育1小時(shí)，使膠原形成凝膠，放置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，打開(kāi)蓋子，超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射干燥，無(wú)菌容器包裝備用，可不用環(huán)氧乙烷消毒。
3.細(xì)胞與材料的復(fù)合方法培養(yǎng)并收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用含血清a-MEM制成2×107個(gè)/ml細(xì)胞懸液，滴入煅燒骨中，或?qū)㈧褵峭度霊乙褐?，抽真空，一個(gè)大氣壓，每次15秒，間隔10秒，反復(fù)三次，讓細(xì)胞懸液完全吸入材料內(nèi)。培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，緩慢加入20ml含血清a-MEM或D-MEM，在37℃、5％CO2的條件下孵育4-8天后植入體內(nèi)。
權(quán)利要求
1，一種作為骨缺損的修復(fù)材料的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是HAP和β-TCP雙相煅燒骨以松質(zhì)骨為原料，通過(guò)浸漬(NH4)2HPO4溶液、一次性煅燒和降低煅燒溫度，將煅燒骨中的HAP部分或完全轉(zhuǎn)化為β-TCP，其中煅燒溫度為900-1300℃。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是制備四種多用的煅燒骨之β-TCP/HAP比例分別是4/6、6/4、8/2和10/0時(shí)，其(NH4)2HPO4溶液濃度分別是0.3M，0.6M，1.0M和1.2M。
3，根據(jù)權(quán)利要求1所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是對(duì)所得煅燒骨及多孔材料采用膠原凝膠表面涂層，2-4mg/ml的膠原溶液經(jīng)對(duì)pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液，在冷藏室內(nèi)透析，涂層時(shí)與1/10體積的10倍濃度的PBS混合，37℃溫育1小時(shí)。
4，根據(jù)權(quán)利要求3所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是所得煅燒骨可與細(xì)胞復(fù)合，細(xì)胞與煅燒骨及多孔材料的復(fù)合方法是收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，讓細(xì)胞懸液完全吸入材料內(nèi)，培養(yǎng)箱中孵育2-5小時(shí)，加入含血清培養(yǎng)液，孵育3-8天后植入體內(nèi)。
5，根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是所述松質(zhì)骨取成年牛椎體或股骨頭及股骨下端，用內(nèi)徑16-18mm的空心電鉆鉆取椎體中心或股骨下端的松質(zhì)骨。
6，根據(jù)權(quán)利要求5所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是第一，對(duì)所述松質(zhì)骨進(jìn)行預(yù)處理，包括流水沖洗、蒸餾水漂洗、去離子水煮沸5-12小時(shí)、高壓流水沖洗、去離子水漂洗、酒精脫水、烘干，其中，烘干溫度為50℃-70℃，4天；第二，進(jìn)行浸漬，煅燒骨塊浸泡于(NH4)2HPO4溶液中24小時(shí)，去除多余液體，50℃-70℃烘干4天；第三，煅燒，在高溫爐中900℃-1300℃，1-4小時(shí)，升溫速率為5℃/分，自然降溫；第四，流水沖洗，去離子水漂洗2次，50℃-70℃烘干4天，高溫消毒備用；第五，膠原表面涂層，4-6℃冷藏可溶性膠原溶液，裝入透析袋，對(duì)去離子水配置的稀鹽酸溶液，pH為3.0，透析6-10天或以上，置于4-6℃冷藏室中，磁力攪拌，每100ml膠原溶液對(duì)1.5-2L的透析液，每?jī)商鞊Q液一次，共2-3次，臨用前從冰箱取出，與1/10體積的10倍濃度的PBS混合，立即將煅燒骨投入液中，抽真空，反復(fù)三次，或?qū)⒒旌弦旱蔚届褵巧希?7℃溫育0.5-2小時(shí)，使膠原形成凝膠，超凈臺(tái)內(nèi)晾干，去離子水沖洗2次，超凈臺(tái)內(nèi)晾干，環(huán)氧乙烷消毒，成膠原表面涂層后的煅燒骨。
7，根據(jù)權(quán)利要求3所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是，煅燒骨的涂層方法是用pH為3.0去離子水配置的稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)膠原濃度為2mg/ml，用針頭濾器超濾消毒，4-6℃冷藏，用前取出，與1/10體積的10倍的不含NaCl的PBS混合，立即將高溫消毒過(guò)的煅燒骨投入液中，37℃溫育0.5-2小時(shí)，使膠原形成凝膠，放置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，打開(kāi)蓋子，超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射干燥，無(wú)菌容器包裝備用。
8，根據(jù)權(quán)利要求6所述的可吸收煅燒骨的制備方法所得煅燒骨的用途，其特征是，用于細(xì)胞與材料的復(fù)合，即培養(yǎng)并收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，用含血清a-MEM制成0.5-5×107個(gè)/1ml細(xì)胞懸液，滴入煅燒骨中，或?qū)㈧褵峭度霊乙褐?，抽真空，一個(gè)大氣壓，每次10-20秒，間隔5-15秒，反復(fù)三次，讓細(xì)胞懸液完全吸入材料內(nèi)；培養(yǎng)箱中孵育2-5小時(shí)，緩慢加入20-30ml含血清培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2的條件下孵育3-8天后植入體內(nèi)。
9，根據(jù)權(quán)利要求6所述的可吸收煅燒骨的制備方法，其特征是，在將煅燒骨塊浸泡于(NH4)2HPO4溶液前，進(jìn)行初次煅燒，在高溫爐中煅燒，800℃，3小時(shí)，升溫速率為5℃-10℃/分。
10，根據(jù)權(quán)利要求1所述的可吸收煅燒骨的制備方法所得煅燒骨的用途，其特征是，可用于修復(fù)骨缺損、骨不連、脊柱融合，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞的載體，構(gòu)建組織工程化人工骨，也可作為BMP的緩釋載體修復(fù)骨缺損。
全文摘要
本發(fā)明可吸收煅燒骨的制備方法是一種可吸收雙相煅燒骨的制備、涂層及細(xì)胞復(fù)合法。一種作為骨缺損的修復(fù)材料的可吸收煅燒骨的制備方法,HAP和β－TCP雙相煅燒骨以松質(zhì)骨為原料,通過(guò)浸漬(NH
文檔編號(hào)C12N5/08GK1422672SQ0214549
公開(kāi)日2003年6月11日 申請(qǐng)日期2002年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月21日
發(fā)明者徐小良, 湯亭亭, 戴尅戎 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院