專利名稱：抗乙型肝炎病毒雙質(zhì)?；蛞呙?、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗乙型肝炎病毒雙質(zhì)粒基因疫苗、其制備方法及其應(yīng)用。
DNA疫苗技術(shù)是將含有編碼外源蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入機(jī)體，以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的一種新型的免疫策略，它具有易于構(gòu)建、制備簡單及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能誘發(fā)機(jī)體持久的特異性細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，可兼作預(yù)防和治療性疫苗。在Nature,1992,356:152-154中，Tang DC等人公開了DNA疫苗技術(shù)。1993年Davis等人把含HBV表面抗原(HBsAg)編碼基因的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)肌肉免疫小鼠，成功地誘發(fā)了針對HBsAg的細(xì)胞與體液免疫(Davis HL et al,Vaccine,1996,14:910-915)。之后基因疫苗治療乙型肝炎成為人們爭相研究的熱點(diǎn)。Mancini M等人在Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:12496-12501.中，公開了將HBV DNA疫苗免疫有HBV復(fù)制的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠對HBV的免疫耐受狀態(tài)得以逆轉(zhuǎn)，產(chǎn)生了HBsAg抗體，清除了血液中游離的病毒顆粒，肝內(nèi)HBV的復(fù)制也得以抑制，進(jìn)一步表明DNA疫苗有可能成為乙型肝炎防治的新手段。
Major ME等人在Viral,1995,69:5798-5805,Davis HL等人在Vaccine,1994；12,1503-1509中，分別公開了將編碼不同病原基因的表達(dá)載體接種于動物體內(nèi)，均誘發(fā)特異性的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答。Chow YH，等人構(gòu)建了HBV preS2.S和IL-2的雙順反子載體，有效增強(qiáng)了免疫效果，且可克服與MHC相關(guān)的針對HBsAg免疫無反應(yīng)性(見J Viral,1997,71:169-178)。Geissler M等人檢測到的HBsAg特異性CD4+淋巴細(xì)胞主要為可分泌干擾素的Th1型淋巴細(xì)胞(見Gastroenterology,1997,112:1307-1320)。
DNA疫苗之所以成為治療性疫苗的重要基礎(chǔ)就是它能通過不同的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的活化，從而有效控制病毒感染，打破機(jī)體免疫耐受狀態(tài)。因而如何有效提高DNA疫苗的免疫效率，增強(qiáng)其誘導(dǎo)機(jī)體CTL反應(yīng)，及其作用機(jī)制與安全性研究是使DNA疫苗由動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)入臨床使用首先要探討的課題。
我國是全球乙型肝炎病毒(HBV)感染的高發(fā)區(qū)，大約有三分之一的HBV感染者在長期的病毒攜帶過程中轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝住⒏斡不蚋伟?。如何打破機(jī)體慢性感染所形成的免疫耐受狀態(tài)，是抗HBV治療研究的重要課題之一。基因疫苗以其獨(dú)特的體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、抗原表達(dá)修飾及分泌呈送方式，在誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答的同時(shí)，能有效地增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，打破某些病毒慢性感染所形成的免疫耐受，有希望成為抗HBV治療新的有效手段。
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建含GM-CSF信號序列的HBV Pre-S2.S基因真核表達(dá)載體，以增強(qiáng)DNA疫苗的蛋白表達(dá)及免疫原性；同時(shí)構(gòu)建IL-2與IFN-r融合蛋白基因真核表達(dá)載體，作為HBV DNA疫苗的免疫佐劑；通過利用雙質(zhì)粒的協(xié)同作用，激活抗原遞呈細(xì)胞，增強(qiáng)CTL特異性免疫反應(yīng)，以便深入探討DNA疫苗治療乙型肝炎病毒感染的可能性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開上述雙質(zhì)粒基因疫苗的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于探討上述雙質(zhì)粒基因疫苗在治療和預(yù)防病毒性乙型肝炎方面的用途。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明構(gòu)建了二類真核表達(dá)基因疫苗；一種是含GM-CSF信號序列的HBV preS2.S基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞能較高水平地表達(dá)HBsAg，另外一種是協(xié)同免疫載體IL-2/IFN-r融合蛋白基因質(zhì)粒，在COS細(xì)胞中也表達(dá)了相應(yīng)的產(chǎn)物。用所構(gòu)建的質(zhì)粒聯(lián)合免疫接種小鼠，成功地誘發(fā)了小鼠抗人HBsAg特異的體液免疫應(yīng)答。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案為分別以含HBV基因的pHBVα1及人類細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因，即HBV中蛋白preS2+S抗原及人白細(xì)胞介素IL-2/INF-γ融合蛋白(FP)編碼基因，并將其定向克隆于已預(yù)先用EcoRⅠ消化的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動子下游，并分別在目的基因5’、3’端插入分泌性GM-SF及終止性PolyA信號序列，以構(gòu)建HBV基因疫苗及具有佐劑效果的真核表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pcDNA-HBV與pcDNA-FCK，簡稱為pS2·S及pFP。質(zhì)粒的大量提取，PEG法純化，按常規(guī)方法進(jìn)行。
DNA疫苗對乙型肝炎的治療性研究在正常動物及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)雖取得了可喜的成就，但要真正進(jìn)入臨床應(yīng)用，尚有許多工作要做，其中最重要的研究課題應(yīng)為如何增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果。針對上述問題，本發(fā)明從以下幾方面進(jìn)行了探討。(1)選擇合適的目的基因。HBV基因組含有多種抗原蛋白編碼基因，其中p-S1蛋白，p-S2蛋白及S蛋白均含有特定的抗原決定簇，可分別誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，其中抗-HBs具有較強(qiáng)的保護(hù)力，p-S2抗體可能與病毒清除密切相關(guān)，而p-S1則含有HBV與肝細(xì)胞膜受體的結(jié)合位點(diǎn)。因而我們選擇了HBV p-S2與S基因來構(gòu)建載體，同時(shí)，在p-S2基因片段前插入一段GM-CSF的信號序列，使DNA疫苗在體內(nèi)更高地表達(dá)HBS p-S2.S中分子蛋白。(2)質(zhì)粒載體的選擇。本發(fā)明所用真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+/-)帶有pCMV啟動子及ployA序列，可保證插入的目的基因用自身起始密碼在哺乳細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。(3)構(gòu)建IL-2/IFN-r融合基因質(zhì)粒作為免疫佐劑。近年研究表明多種細(xì)胞因子對DNA疫苗均具有較好的佐劑效應(yīng)，能有效增強(qiáng)基因疫苗的免疫原性。Davis等以pRSV-GM-CSF與pCMV-S共注射小鼠，發(fā)現(xiàn)抗HBs抗體明顯增高，我們構(gòu)建的IL-2/IFN-r融合基因質(zhì)粒與HBV pS2.S基因疫苗協(xié)同免疫小鼠，抗HBs抗體水平比單獨(dú)用HBV DNA疫苗免疫提高約3倍。IFN-r可能增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞表面MHCⅡ類分子表達(dá)，從而激發(fā)抗原遞呈過程，IL-2可通過增強(qiáng)抗原特異性T淋巴細(xì)胞增殖起作用，二者主要激活的均為細(xì)胞免疫應(yīng)答，因而該融合蛋白質(zhì)粒作為免疫佐劑，有可能調(diào)控機(jī)體對HBV DNA疫苗的免疫應(yīng)答類型。
DNA疫苗作為近年發(fā)展起來的一種全新疫苗，不僅可誘發(fā)抗體保護(hù)性抗體，更重要的是可誘導(dǎo)針對病毒抗原的細(xì)胞免疫，從而有效打破宿主對病毒的免疫耐受狀態(tài)。與肽類疫苗不同，DNA疫苗將編碼抗原蛋白的質(zhì)粒DNA注入肌肉或皮內(nèi)，由宿主合成抗原蛋白，因此它能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)為標(biāo)志的細(xì)胞免疫。Davis等[8]給小鼠肌注編碼HBsAg的重組質(zhì)粒，檢測到高水平的抗-HBs抗體和HBsAg特異性的CTL，研究表明，DNA疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的機(jī)制在于它模擬了病毒的自然感染過程。質(zhì)粒DNA被肌細(xì)胞攝取后，合成的蛋白質(zhì)被降解為含抗原表位的肽段，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與MHCⅠ類分子結(jié)合，再轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，激活受MHCⅠ類分子限制的CD8+CTL。部分分泌入血的抗原，誘導(dǎo)體液免疫，或被樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞俘獲，經(jīng)加工并與MHCⅡ分子結(jié)合，激活CD4+Th細(xì)胞，分泌IFN-r,IL-2等細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)作用。DNA疫苗的出現(xiàn)為人類完全征服乙型肝炎及其它病毒性疾病帶來了希望，其應(yīng)用和研究前景將極為廣闊。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。


圖1為pcDNA-HBV與pcDNA-FCK的構(gòu)建圖；圖2 HBV中蛋白及細(xì)胞介素融合蛋白真核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意簡圖；圖3為pcDNA-HBV與pcDNA-FCK兩重組質(zhì)粒的基因序列；圖4為融合蛋白IL-2/IFN-r表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析；1．標(biāo)記物；2．pcDNA-FCK；3．pcDNA3.1圖5 IL-2/IFN-r的Western印跡；A．IL-2 McAbs探針； 1．標(biāo)記物， 2,3．pcDNA-FCK， 4．pcDNA3.1B．IFN-r McAbs探針；1．標(biāo)記物， 2,3．pcDNA-FCK， 4．pcDNA3.1圖6不同劑量的基因疫苗誘導(dǎo)血清抗體量及陽性率(％)的產(chǎn)生；圖7 pFP對基因疫苗誘導(dǎo)健康鼠抗體產(chǎn)生的影響；Δ血清抗-HBS陽性率(≥10mIu.ml-1)*pS2.S+pcDNA3.1組比較，P＜0.01圖8各組質(zhì)粒接種后不同時(shí)間(周)HBV Tg小鼠血清HbsAg及抗-HBs水平變化。
下面是本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述的實(shí)施例是用于描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例中采用的質(zhì)粒、菌種及試劑如下質(zhì)粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)、PUC19(含HBV Pre-S1、Pre-S2與S基因)及COS-7細(xì)胞由美國哈佛大學(xué)Fusion生物醫(yī)藥公司惠贈，菌株DH5α購于GibcoBRL公司，COS-1與L-6TG細(xì)胞株引自上海細(xì)胞所。
限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、RNA抽提試劑盒、QIAprep及EndofreePlasmid Mega Kit質(zhì)粒制備純化試劑盒，QIAquick凝膠提取試劑盒、LipofectAMINE細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒，以及其他工具酶與試劑分別購于Promega、Gibco BRL、Boehringer、Amersham及QIAgene公司等，HBsAg與HBsAb檢測試劑盒購于華美生物公司，IL-2及IFN-r檢測試劑盒購于深圳晶美生物技術(shù)公司，衛(wèi)生部檢驗(yàn)中心質(zhì)檢室提供抗-HBs標(biāo)準(zhǔn)品。
實(shí)施例11．HBV pS2.S基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建以含HBV基因的原核表達(dá)質(zhì)粒PUC19為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因。正引物內(nèi)設(shè)計(jì)含有54mer的GM-CSF信號序列，引物序列為正引物5’-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCT GCAGCATCTCTgcaTCCACA GCTTTTCACC AAGCT-3’，反引物5’-TTAAATGTAT ACCCAAAGACAA-3’，擴(kuò)增片段長度為888bp。參照Sambrook等的方法將目的基因定向克隆于已預(yù)先用EcoRⅠ消化的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中CMV啟動子下游，稱之為pcDNA-HBV或p-S2.S。
2．IL-2/IFN-r人細(xì)胞介素融合蛋白基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建細(xì)胞基因組DNA的提取按Sambrook等的方法進(jìn)行。為不影響表達(dá)的細(xì)胞因子各自的空間構(gòu)象，在二類細(xì)胞因子基因片段之間插入24mer的無關(guān)序列，擴(kuò)增IL-2基因的引物序列為正引物P1 5'-ATGTACAGGA TGCAACTCCTA-3’，反引物P2 5’-TGGGTCCTGG CAGTAACAcg aacccccgcc tcctgaccca gcAGTTAGTG TTGAGATGAT-3’；擴(kuò)增IFN-r基因引物序列為正引物P3 5’-ATCATCTCAA CACTAACTgc tgggtcagga ggcgggggtt cgTGTTACTGCCAGGACCCA-3’，反引物P4 5’-TTACTGGGATGCTCTTCGACCT-3’。取1μg基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，P1+P2與P3+P4的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后混合作為融合蛋白基因擴(kuò)增的模板，用引物P1+P4行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為924bP的含中間序列的融合細(xì)胞因子基因片段，將其定向克隆于經(jīng)EcoRⅠ消化的pcDNA3.1(-)載體中，命名為pcDNA-FCK或pFP。
3．重組質(zhì)粒的制備與純化重組載體pcDNA-HBV,pcDNA-FCK分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆，經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，采用QIA prep和Endofree Plasmid Mega Kit，按操作說明書制備和純化質(zhì)粒，溶于無菌無熱源的PBS緩沖液中，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+/-)內(nèi)含巨細(xì)胞病毒啟動子(pCMV)與polyA序列，可保證插入基因用自身起始密碼在多種哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。經(jīng)PCR、酶切、基因重組等技術(shù)分別構(gòu)建了帶有粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF信號序列的HBV preS2.S基因及IL-2/IFN-r融合蛋白基因的重組載體pcDNA-HBV與pcDNA-FCK見
圖1，結(jié)構(gòu)示意簡圖見圖2。兩重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果均獲得特異性目的基因片段，測序結(jié)果表明目的基因序列正確并已正向插入到pcDNA3.1中pCMV的下游，二重組質(zhì)粒分別經(jīng)xhoⅠ,xbaⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ等酶切，結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖3)。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)在LipofectAMINE介導(dǎo)下，將已純化的重組載體pcDNA-HBV,pcDNA-FCK按操作說明書分別轉(zhuǎn)染COS-1,COS-7與L-6TG細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將細(xì)胞按106/皿接種于35mm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換液，每皿加入5μg質(zhì)粒DNA,G418篩選抗性克隆。培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)分別收集培養(yǎng)上清，采用ELISA方法檢測表達(dá)產(chǎn)物。
質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后培養(yǎng)48h和72h，收集培養(yǎng)上清液，ELISA方法測定HBsAg,IL-2及IFN-r表達(dá)，取平行兩皿測定均值。由表1可見表達(dá)的產(chǎn)物在COS-1與COS7細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平相似，均明顯高于在L-6GT細(xì)胞中的表達(dá)水平(P＜0.01)，細(xì)胞培養(yǎng)48h的產(chǎn)物表達(dá)水平略高于72h的表達(dá)水平，但無顯著性差異。
表1*P＜0.01，與cos-1和COS-7細(xì)胞比較。
實(shí)施例3
融合蛋白IL-2/IFN-r基因表達(dá)產(chǎn)物Western印跡鑒定融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)膜(500mA,3小時(shí))，轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜，分別用IL-2單抗及IFN-r單抗進(jìn)行顯色鑒定。重組載體pcDNA-FCK轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞COS-7及COS-1，培養(yǎng)48h后取培養(yǎng)上清液，濃縮后SDS-PAGE電泳，可見在30kD左右有一產(chǎn)物帶(圖4)。表達(dá)產(chǎn)物IL-2/IFN-r可與IL-2單抗及IFN-r單抗發(fā)生反應(yīng)，說明該融合蛋白中既有IL-2存在，又有IFN-r存在，結(jié)果見圖5。
實(shí)驗(yàn)例1雙質(zhì)粒HBV DNA疫苗誘導(dǎo)健康及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體液免疫的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)動物健康C57BL/6小鼠購自中山醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，雌性，6-8周齡，屬Ⅱ級動物并具合格證書。HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，品系為C57BL/6小鼠，清潔級，由HBV全基因(adr型)隨機(jī)轉(zhuǎn)染，傳至9-10代，經(jīng)剪尾，組織DNA提取，PCR檢測HBV DNA呈陽性，再以ELISA方法篩選血清HBsAg陽性小鼠9只，實(shí)驗(yàn)備用。
免疫接種與實(shí)驗(yàn)分組；基因疫苗接種方法采用小鼠雙側(cè)脛前肌(TA)直接注射法。用0.5％鹽酸布比卡于小鼠雙側(cè)TA各注射50μ1，第5日用劑量為75mg.kg的戌巴比鈉麻醉小鼠，于雙側(cè)TA同一部位各注射總?cè)萘繛?0μ1的PBS質(zhì)粒溶液。健康C57BL/6小鼠共28只，分為6組(1)pS2.S大劑量(100μg/只)組5只；(2)pS2.S中劑量(50μg/只)組5只；(3)pS2.S小劑量(10μg/只)組5只；(4)pcDNA3.1(100μg/只)對照組3只；(5)pS2.S+pFP(10μg+10μg/只)組5只及(6)pS2.S+pcDNA3.1(10μg+10μg/只)組5只。HBV Tg小鼠共9只，分為4小組，A組pS2.S大劑量(100μg/只)組2只；B組pS2.S+pFP(50μg+50μg)組3只；C組pFP(10μg/只)組2只及D組pcDNA3.1(100μg/只)組2只。采用眼球后靜脈叢穿刺法于免疫接種后第2、4、6、8、14周定期采血，分高血清標(biāo)本，置一20℃貯存，待分批一次性進(jìn)行血清HBsAg及抗-HBs ELISA法檢測。
統(tǒng)計(jì)處理采血兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。結(jié)果如下1．基因疫苗誘導(dǎo)健康動物體液免疫應(yīng)答的動態(tài)觀察血清抗-HBs≥10mIu/ml被認(rèn)為機(jī)體保護(hù)性有效濃度。圖6結(jié)果顯示pcDNA3.1接種正常小鼠后于2、4、8、14周血清抗-HBS濃度均小于10mIu.ml-1。與之相比，pS2.S高(100μg/只)、中(50μg/只)、低(10μg/只)，三組劑量一次性免疫小鼠均能在2周誘導(dǎo)抗-HBS產(chǎn)生(＞10mIu.ml-1)，抗體效價(jià)隨時(shí)間延長而增長。三組間比較，抗體濃度及陽性率亦有差別高、中劑量組二周抗體陽性率均為100％，高于低劑量組(60％)；血清抗體濃度比較，高劑量組(82.9±30.010mIu.ml-1)較中(42.2±25.610mIu.ml-1)、低(24.6±7.5)劑量組分別具顯著(P＜0.05)及非常顯著(P＜0.01)性差異。以后的4、8、14周高、中劑量組間差別縮小，但二者較低劑量組均具非常顯著性差異(P＜0.01)。
2．pFP對基因疫苗誘導(dǎo)正常動物抗體產(chǎn)生的影響圖7結(jié)果顯示，低劑量(10μg/只)的pS2.S與pFP聯(lián)合免疫，于2、4周誘導(dǎo)組內(nèi)全部(100％)健康小鼠抗體產(chǎn)生，而相同劑量的pS2.S+pcDNA3.1組僅分別為60％及80％。pFP聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生水平于2、4周分別為115.4±21.9mIu.ml-1,121.9±35.0mIu.ml-1，較pS2.S+pcDNA3.1組(24.6±27.5mIu.ml-1,33.1±8.9mIu.ml-1)均具非常顯著性差異。而于第8、14周，聯(lián)合pFP免疫組抗-HBS水平明顯下降，與聯(lián)合空白載體組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
3．基因疫苗誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠抗-HBS產(chǎn)生結(jié)果。
高劑量的pS2.S組與中劑量pS2.S聯(lián)合pFP(50μg/只)組各有一只Tg小鼠發(fā)生HBSAg血清轉(zhuǎn)換，其中聯(lián)合免疫組于2周誘導(dǎo)抗-HBS產(chǎn)生，單獨(dú)高劑量組產(chǎn)生抗體時(shí)間為第4周，且水平(20mIu.ml-1)低于聯(lián)合免疫組(45mIu.ml-1)；而第8周pS2.S組該只小鼠血清抗體水平升高(400.0mIu.ml-1)，高于同期的pS2.S+pFP組(275.6mIu.ml-1)。四組共9只HBV Tg小鼠于接種前血清HBSAg ELISA檢測均為陽性(P/N值≥2.1)，不同質(zhì)粒免疫后，各只鼠OD值均有下降，第4周pcDNA3.1有一只小鼠反跳性升高。比較第8周血清HBSAg檢測結(jié)果pS2.S組與pS2.S+pFP組P/N值分別為1.88±0.25、1.50±0.38均明顯較pFP(4.38±0.18)及pcDNA3.1(4.25±1.38)組低，見圖8。
HBV基因疫苗是將病毒蛋白性抗原編碼的S或C區(qū)基因通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)肌注等途徑轉(zhuǎn)染至縮主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，并表達(dá)和分泌病毒抗原，分別通過局部組織抗原遞呈細(xì)胞(APC)或宿主細(xì)胞膜MHCⅡ及Ⅰ類分子進(jìn)行抗原呈遞，整個(gè)過程模擬了病毒感染的自然過程，因此基因疫苗免疫在誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答的同時(shí)，能更有效地誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，達(dá)到抗HBV慢性感染的免疫預(yù)防反治療目的。
與疫苗構(gòu)建插入的空白載體pcDNA3.1比較，本發(fā)明構(gòu)建的HBV基因疫苗pS2.S具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)健康小鼠體液免疫應(yīng)答效果，并呈一定的劑量依賴關(guān)系，為治療型基因疫苗的進(jìn)一步研制、質(zhì)粒構(gòu)建及篩選提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究一次性免疫接種后動態(tài)持續(xù)性觀察，結(jié)果血清抗體水平隨時(shí)間而不斷升高，與國外學(xué)者觀察結(jié)果基本一致。推測與局部淋巴濾泡中的濾泡樹突狀細(xì)胞(follicular dendritic cells)攝取疫苗DNA并長期保存和表達(dá)抗原有關(guān)。這樣，使B-細(xì)胞不斷將抗原加工后送呈給T細(xì)胞，保證了免疫應(yīng)答的記憶性，基因疫苗在宿主細(xì)胞持續(xù)表達(dá)的抗原成為再次增強(qiáng)免疫原，誘導(dǎo)血清抗-HBS水平的持續(xù)升高。
通過現(xiàn)有的直接注射途徑，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞的成功率并不高。如何提高基因疫苗效果，降低質(zhì)粒劑量，是該項(xiàng)新技術(shù)推廣應(yīng)用前必須解決的技術(shù)難題之一。白細(xì)胞介素-2(IL-2)及γ-干擾素(IFN-γ)均為Th1細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，并能促進(jìn)T細(xì)胞向Th1亞群分化。已有實(shí)驗(yàn)證明IFN-γ能促進(jìn)DC細(xì)胞(APC)膜表面MHCⅡ類抗原分子及CD86分子的表達(dá)，并增強(qiáng)DC抗原的呈遞功能。本發(fā)明構(gòu)建的IL-2與IFN-γ融蛋白編碼基因的表達(dá)質(zhì)粒(pFP)，聯(lián)合基因疫苗免疫，在取得相同的體液免疫效果的同時(shí)，可將基因疫苗質(zhì)粒劑量降到原來的1/10，并能減少同組動物個(gè)體問抗體水平差異，提高同組效果的均一性，表明pFP具有較強(qiáng)的佐劑效應(yīng)。然而，聯(lián)合疫苗接種第8周血清抗-HBs水平明顯降低，至14周低于對照組(pS2.S+pcDNA3.1)。分析其原因，可能與pFP表達(dá)的IL-2及INF-γ有關(guān)，一方面通過增強(qiáng)局部CTL功能致轉(zhuǎn)染基因疫苗的肌細(xì)胞壞死；另方面直接抑制pS2.S在肌細(xì)胞抗原表達(dá)，從而降低HBSAg的分泌及其免疫原性。
比較相同高劑量pS2.S單獨(dú)及聯(lián)合佐劑質(zhì)粒免疫正常小鼠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答結(jié)果，pS2.S pS2.S+pFP免疫HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠的二組中僅各有一只Tg小鼠血清抗-HBs陽性，表明Tg小鼠對HBSAg已形成免疫耐受。其中聯(lián)合佐劑免疫組的一只抗-HBs產(chǎn)生時(shí)間(2周)較單獨(dú)基因疫苗接種組早，而第8周抗體定量檢測結(jié)果后者較前者高，與健康動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。4組質(zhì)粒接種后Tg，小鼠血清HBSAg ELISA檢測值均降至試劑盒指示的陰性范圍，pFP與pcDNA3.1組血清HBsAg的下降可能分別與各自表達(dá)細(xì)胞介素及載體結(jié)構(gòu)中含氮個(gè)抗性基因致細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)有關(guān)。但該二組HBSAg檢測結(jié)果在第8周明顯較pS2.S及pS2.S+PFP組高，且pcDNA3.1組中一只小鼠血清HBsAg于4周有波動并呈陽性。提示基因疫苗及其聯(lián)合佐劑免疫能誘導(dǎo)針對HBsAg特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過CTL功能的增強(qiáng)及IL-2、INF-γ等細(xì)胞介素的釋放，更有效地抑制HBV的復(fù)制及其蛋白性抗原的表達(dá)，使HBsAg發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換。
目前，國內(nèi)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠品系的建立均采用顯微注射隨機(jī)插入HBV全基因組的方法，故在傳代后基因整合的穩(wěn)定性、基因編碼產(chǎn)物的表達(dá)及水平等方面存在諸多問題。本研究所用9只HBV Tg小鼠是90只組織HBV DNA陽性Tg小鼠中篩選HBSAg血清陽性者所得。因HBsAg ELISA檢測OD值較低，給治療性基因疫苗效果的評價(jià)帶來一定困難。但作為初步的實(shí)驗(yàn)摸索，結(jié)果仍不失一定參考意義。有特fmV轉(zhuǎn)基因動物的成熟建立，我們才能更好地評價(jià)基因疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫、打破免疫耐受、治療HBy慢性感染的確切療效。
實(shí)驗(yàn)例2DNA疫苗誘導(dǎo)健康小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抗-HBs的產(chǎn)生目的在HBV DNA疫苗成功誘導(dǎo)健康小鼠體液免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)上，深入探討其作為抗-HBV治療的可行性及作用機(jī)理。方法應(yīng)用基因重組技術(shù)，我們構(gòu)建編碼HBV中蛋白(preS2+S)及人白細(xì)胞介素融合蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pS2.S及pFP，繼經(jīng)肌注免疫健康Balb/C及HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠并分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)系列1．HBsAg特異性T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)不同質(zhì)粒接種后2周，取健康Balb/C小鼠脾臟并分離淋巴細(xì)胞在體外與不同濃度的HBsAg孵育，分別在培養(yǎng)72小時(shí)(hr)及96hr，檢測培養(yǎng)液上清細(xì)胞因子的釋放及T細(xì)胞增殖指數(shù)；2．樹突狀細(xì)胞(DCs)誘導(dǎo)HBsAg致敏的T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)第2次質(zhì)粒接種后的第2天，取小鼠局部引流淋巴結(jié)(LN)分離提取DCs并分別計(jì)數(shù)，在體外與HBsAg致敏的同品系小鼠T細(xì)胞培養(yǎng)96hr，檢測細(xì)胞增殖指數(shù)；3．HBV轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠血清誘生抗-HBs實(shí)驗(yàn)篩選9只血清HBsAg陽性的HBV Tg小鼠(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，分為4組pS2.S免疫組2只，100μg/只；pS2.S+pFP組3只，(50+50)μg/只；pFP組2只，100μg/只；空白載體pcDNA3.1組2只，100μg/只。免疫前及免疫后2、4、6、8周分別采血，一次性檢測血清HBsAg及抗-HBs水平。結(jié)果1．HBV DNA疫苗誘導(dǎo)HBsAg特異性T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)體外HBsAg對DNA疫苗免疫后的T細(xì)胞的刺激呈濃度相關(guān)，HBsAg30ug.ml-1時(shí)刺激pS2.S免疫小鼠脾細(xì)胞增殖指數(shù)(5.6±0.9)明顯較pcDNA3.1組(2.0±0.5)高(表1)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平檢測結(jié)果高劑量(100μg/只)pS2.S免疫組IL-2(226.3±4.1pg.ml-1)及IFN-γ(51.1±7.7pg.ml-1)的分泌水平明顯較pcDNA3.1組(69.0±22.1/0.9±0.7pg.ml-1)高；中劑量(50μg/只)pS2.S聯(lián)合pFP(50μg/只)免疫組IL-2/IFN-γ水平(266.2±61.0/39.6±16.3pg.ml-1)，亦較中劑量pS2.S聯(lián)合空載質(zhì)粒pcDNA3.1組(150.1±26.2/10.6±5.6pg.ml-1)高；IL-4水平于各組質(zhì)粒免疫影響不明顯。2．DCs誘導(dǎo)HBsAg致敏的T-細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)pS2.S免疫小鼠局部LN DCs誘導(dǎo)HBsAg致敏的T-細(xì)胞增殖指數(shù)(4.20)較pcDNA3.1組(2.55)高(表2)，同時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明pS2.S組及pS2.S聯(lián)合pFP免疫組DCs數(shù)目及其占局部引流LN的百分比均明顯升高。3．HBV DNA疫苗誘導(dǎo)HBV Tg小鼠抗-HBs產(chǎn)生高劑量的pS2.S組與中劑量pS2.S聯(lián)合pFP組各有一只Tg小鼠分別于2、4周開始發(fā)生HBsAg血清轉(zhuǎn)換，且其抗體水平隨時(shí)間而增長。4組9只Tg小鼠于接種前血清HBsAg均陽性(ELISA P/N≥2.1)，不同質(zhì)粒免疫后，各只P/N值均有下降，第4周pcDNA3.1組有一只小鼠反跳性升高，比較第8周血清HBsAg檢測結(jié)果pS2.S組與pS2.S+pFP組P/N值分別為1.88±0.25,1.50±0.38，均明顯較pFP(4.38±0.18)及pcDNA3.1(4.25±1.38)組低(圖2)。結(jié)論本研究結(jié)果表明HBV DNA疫苗能有效誘導(dǎo)HBsAg特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，提示可能的作用機(jī)理是局部引流LN的DCs攝取質(zhì)粒表達(dá)的抗原或質(zhì)粒本身，通過MHC-Ⅱ或MHC-Ⅰ類抗原遞呈途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖并向Th1亞群分化，提高了IL-2/IFN-γ的分泌水平，有效地增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答以達(dá)到抗-HBV的治療目的；HBV-Tg小鼠的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果為治療型HBV DNA疫苗的深入研制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
權(quán)利要求
1．抗乙型肝炎病毒(HBV)雙質(zhì)?；蛞呙?，其特征在于由含粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)信號序列的HBV包膜中蛋白基因真核表達(dá)質(zhì)粒pS2.S，和含無關(guān)中間序列的人IL-2與IFN-r融合蛋白基因真核表達(dá)載體pFP組成。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗乙型肝炎病毒雙質(zhì)?；蛞呙纾涮卣髟谟诤珿M-CSF信號序列真核表達(dá)質(zhì)粒pS2.S的真核表達(dá)載體為pcDNA3.1(+)，目的基因?yàn)镠BV包膜中蛋白(preS2+S)基因片段，并在此基因片斷上游插入54mer的GM-CSF信號序列，所得整體目的基因片段長度為888bp，定向克隆于pcDNA3.1(+)載體的CMV啟動子下游。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗乙型肝炎病毒雙質(zhì)?；蛞呙?，其特征在于IL-2與IFN-r融合蛋白基因真核表達(dá)質(zhì)粒pFP的真核表達(dá)載體為pcDNA3.1(-)，目的基因?yàn)槿嘶蚱渌N屬的IL-2及INF-γ融合蛋白基因，為不影響所表達(dá)的二類細(xì)胞因子各自空間構(gòu)成及生物活性，在二者之間插入24MER的天關(guān)基因序列，所得整體目的基因長度為924bp，定向克隆于pcDNA3.1(-)載體的CMV啟動子下游。
4．抗乙型肝炎病毒雙質(zhì)?；蛞呙绲闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟谥苽浞椒ò╝．以含HBV基因的原核表達(dá)質(zhì)粒PUC19為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因，正引物內(nèi)設(shè)計(jì)含有54mer的GM-CSF信號序列，引物序列為正引物5’-ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCT GCAGCATCTCTGCATCCACA GCTTTTCACC AAGCT-3’，反引物5’-TTAAATGTAT ACCCAAAGACAA-3’，擴(kuò)增片段長度為888bp；參照Sambrook等的方法將目的基因定向克隆于已預(yù)先用EcoRⅠ消化的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中CMV啟動子下游；b．細(xì)胞基因組DNA的提取按Sambrook等的方法進(jìn)行，為不影響表達(dá)的細(xì)胞因子各自的空間構(gòu)象，在二類細(xì)胞因子基因片段之間插入24mer的無關(guān)序列，擴(kuò)增IL-2基因的引物序列為正引物P1 5’-ATGTACAGGA TGCAACTCCT A-3’，反引物P2 5’-TGGGTCCTGG CAGTAACACG AACCCCCGCC TCCTGACCCAGCAGTTAGTG TTGAGATGAT-3’；擴(kuò)增IFN-r基因引物序列為正引物P3 5’-ATCATCTCAA CACTAACTGC TGGGTCAGGA GGCGGGGGTT CGTGTTACTGCCAGGACCCA-3’，反引物P4 5’-TTACTGGGATGCTCTTCGACCT-3’；取1μg基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，P1+P2與P3+P4的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后混合作為融合蛋白基因擴(kuò)增的模板，用引物P1+P4行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為924bP的含中間序列的融合細(xì)胞因子基因片段，將其定向克隆于經(jīng)EcoRⅠ消化的pcDNA3.1(-)載體中；c．重組載體pcDNA-S2.S,pcDNA-ⅡF分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆，經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，采用QIA prep和Endofree Plasmid Mega Kit按操作說明書制備和純化質(zhì)粒，溶于無菌無熱源的PBS緩沖液中，-20℃貯存?zhèn)洌?br> 5．抗乙型肝炎病毒雙質(zhì)?；蛞呙绲挠猛荆涮卣髟谟谟糜谥委熀皖A(yù)防乙型病毒性肝炎或其它病毒性疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗乙型肝炎病毒雙質(zhì)?；蛞呙?、其制備方法及其應(yīng)用，雙質(zhì)粒基因疫苗由含粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM－CSF信號序列的分子蛋白基因真核表達(dá)質(zhì)粒HBV pS
文檔編號C12N15/79GK1316518SQ0010785
公開日2001年10月10日 申請日期2000年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月18日
發(fā)明者陳光明, 謝宗法, 楊富強(qiáng), 何曉嬙, 黃英, 吳樂園 申請人:中國人民解放軍第四五八醫(yī)院