用于敲低err表達的小分子干擾rna、重組載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于沉默ERR的表達的小分子干擾RNA、shRNA、shRNA的編碼DNA、重組載體、重組慢病毒和藥物組合物及其應用，所述小分子干擾RNA具有與翻譯雌激素相關受體蛋白的信使RNA互補的核苷酸序列，長度為19～27bp。所述編碼shRNA的DNA克隆到pDSL-hpUGIP載體得到重組慢病毒載體，該重組慢病毒載體連同慢病毒包裝質粒侵染細胞，得到有活性的能夠轉錄ERR-shRNA的重組慢病毒；所述ERR-shRNA經(jīng)過宿主細胞加工后可生成能沉默ERR表達的小分子干擾RNA；本發(fā)明提供的小分子干擾RNA能靶向ERR的mRNA，并導致ERR的mRNA降解，從而降低ERR的表達水平。
【專利說明】用于敲低ERR表達的小分子干擾RNA、重組載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學、基因工程技術以及生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種用于敲低ERR表達的小分子干擾RNA、重組載體及其應用。
【背景技術】
[0002]雌激素相關受體(ERR)不與雌激素結合，研究表明其與骨質疏松癥和乳腺癌的發(fā)生有關，同時還在糖脂代謝途徑中起重要作用。
[0003]RNA干擾(RNA interference, RNAi)可誘發(fā)的基因沉默。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默。目前，應用RNA干擾技術對ERR (雌激素相關受體的信使RNA)進行基因沉默的方法主要有真核表達載體構建法和腺病毒載體構建法。但是，真核表達載體構建法轉染效率極低，而且只能轉染極少數(shù)的細胞種類，應用范圍受到很大限制。利用腺病毒載體構建的載體雖然宿主廣泛、感染效率高，但其不能有效整合、目的基因表達時問短等缺點限制了其在ERR轉基因研究中的應用。
[0004]因此，有必要提供一種采用RNA干擾技術對ERR進行基因沉默的方法。

【發(fā)明內容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于沉默ERR的表達的小分子干擾RNA、shRNA、shRNA的編碼DNA、重組載體、重組慢病毒及應用。
[0006]本發(fā)明提供的小分子干擾RNA能直接特異性靶向ERR的mRNA，并導致ERR的mRNA降解，產(chǎn)生基因沉默效應；本發(fā)明提供的shRNA、shRNA的編碼DNA、重組載體、重組慢病毒或藥物組合物能間接地沉默ERR的表達。
[0007]本發(fā)明涉及的英文縮寫及其中文釋義如下:
[0008]ERR:雌激素相關受體；
[0009]ERR-shRNA:具有靶向雌激素相關受體信使RNA的短發(fā)夾RNA ；
[0010]mRNA:信使 RNA ;siRNA:小分子干擾 RNA ；shRNA:短發(fā)夾 RNA ；
[0011]第一方面，本發(fā)明提供了一種小分子干擾RNA，所述小分子干擾RNA具有與翻譯雌激素相關受體蛋白的信使RNA互補的核苷酸序列，長度為19~29bp。
[0012]優(yōu)選地，本發(fā)明第一方面提供了的一種小分子干擾RNA，所述小分子干擾RNA具有與翻譯雌激素相關受體蛋白的信使RNA互補的核苷酸序列，長度為19~29bp。
[0013]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的長度為21~27bp。
[0014]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0015]優(yōu)選地，所述雌激素相關受體蛋白基因為小鼠雌激素相關受體α基因。
[0016]第二方面，本發(fā)明提供了一種shRNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。
[0017]優(yōu)選地，本發(fā)明第二方面提供了的一種shRNA，為具有莖環(huán)結構的單鏈RNA，所述shRNA具有小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列，其中，所述小分子干擾RNA具有與翻譯雌激素相關受體蛋白的信使RNA互補的核苷酸序列,長度為19~27bp。
[0018]優(yōu)選地，所述雌激素相關受體蛋白基因為小鼠雌激素相關受體α基因，所述小鼠雌激素相關受體α基因的Genebank登錄號為26379 ；。
[0019]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的長度為21~27bp。
[0020]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0021]第三方面，本發(fā)明提供了一種shRNA的編碼DNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。
[0022]優(yōu)選地，本發(fā)明第三方面提供了的一種shRNA的編碼DNA，所述shRNA具有小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列，其中，所述小分子干擾RNA具有與翻譯雌激素相關受體蛋白的信使RNA互補的核苷酸序列，長度為19~27bp。
[0023]優(yōu)選地，所述雌激素相關受體蛋白基因為小鼠雌激素相關受體α基因。
[0024]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的長度為21~27bp。
[0025]優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示。
[0026]優(yōu)選地，所述編碼shRNA的DNA的含有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4所示的核苷
酸序列。
[0027]具體地，在此優(yōu)選條件下，所述SEQ ID NO:3 (5，_3，)為:
[0028]CCGCTAGTGCTCAGCTCTCTACCCAATTC AAGAGATTGGGTAGAGAGCTGAGCACTAGCTTTTTT ；
[0029]所述SEQ ID NO:4 (5，_3，)為:
[0030]AAAAAAGCTAGTGCTCAGCTCTCTACCCAATCTCTTGAATTGGGTAGAGAGCTGAGCACTAGCGG
[0031]進一步優(yōu)選地,所述SEQ ID N0:3或4所示的核苷酸序列的5’端具有酶切位點。
[0032]更進一步優(yōu)選地,所述SEQ ID N0:3或4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位點分別為 BamH I 和 Xho I。
[0033]在此優(yōu)選條件下，所述編碼shRNA的DNA具有如SEQ ID N0:5或6所示的核苷酸序列。
[0034]具體地，所述SEQ ID NO:5 (5，_3，)為:
[0035]
【權利要求】
1.一種小分子干擾RNA，其特征在于:所述小分子干擾RNA具有與翻譯雌激素相關受體蛋白的信使RNA互補的核苷酸序列，長度為19~29bp。
2.如權利要求1所述的小分子干擾RNA，其特征在于，所述小分子干擾RNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO: 2 所示。
3.一種shRNA，為具有莖環(huán)結構的單鏈RNA，其特征在于，所述shRNA具有如權利要求1或權利要求2所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。
4.一種編碼shRNA的DNA，其特征在于，所述shRNA具有如權利要求1或權利要求2所述的小分子干擾RNA的正義鏈或反義鏈的核苷酸序列。
5.如權利要求4所述的編碼shRNA的DNA，其特征在于，所述編碼shRNA的DNA含有如SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
6.如權利要求4所述的編碼shRNA的DNA，其特征在于，所述編碼shRNA的DNA還包括RNA聚合酶III啟動子。
7.—種重組載體，其特征在于，所述重組載體為在 a)pEN-hHlc質粒的多克隆位點或 b)pDSL-hpUGIP質粒的重組位點 插入如權利要求4~6任一所述的編碼shRNA的DNA得到的重組載體。
8.—種重組慢病毒，其特征在于，是如權利要求7的b)所述重組載體與包膜載體psPAX2和包裝載體pMD2.G共轉染哺乳動物細胞得到的重組慢病毒。
9.一種藥物組合物，其特征在于，包括如權利要求1所述的小分子干擾RNA、如權利要求3所述的shRNA、如權利要求4所述的編碼shRNA的DNA、如權利要求7的b)所述重組載體和如權利要求8的所述的重組慢病毒中的至少一種。
10 .如權利要求1所述的小分子干擾RNA、如權利要求3所述的shRNA、如權利要求4所述的編碼shRNA的DNA、如權利要求7的b)所述重組載體和如權利要求8的所述的重組慢病毒中的至少一種在制備抑制雌激素相關受體蛋白基因表達的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P19/10GK103725682SQ201310746591
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權日:2013年12月30日
【發(fā)明者】劉慶禮, 雷楊, 管敏, 潘浩波 申請人:深圳先進技術研究院