一種轉(zhuǎn)錄因子組及其制備方法、應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種轉(zhuǎn)錄因子組及其制備方法、應(yīng)用。本發(fā)明涉及三種神經(jīng)元再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Ascl1,Brn2,Pax6的重組慢病毒載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。具體地，本發(fā)明利用PCR方法獲取Ascl1,Brn2,Pax6目的基因，以pGC-LV-GFP為重組載體，插入合成的三種目的基因DNA片段，構(gòu)建了分別含Ascl1,Brn2,Pax6的GFP報(bào)告基因內(nèi)置的重組慢病毒質(zhì)粒pGC-GFP-Ascl1，pGC-GFP-Brn2，pGC-GFP-Pax6。經(jīng)慢病毒包裝后，將三種重組慢病毒質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)后獲得三種重組的慢病毒顆粒LV-Ascl1，LV-Brn2，LV-Pax6，并經(jīng)超速離心濃縮病毒顆粒，測定包裝病毒滴度。因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于阿爾茨海默病的基因治療，為患者提供新的安全有效的治療途徑。
【專利說明】—種轉(zhuǎn)錄因子組及其制備方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及三種神經(jīng)元再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Ascll, Brn2和Pax6的重組慢病毒載體及其構(gòu)建,還涉及三種神經(jīng)元再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Ascll，Brn2和Pax6重組慢病毒載體在阿爾茨海默病基因治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]阿爾茨海默病(AD)又稱老年癡呆癥，是全球最受關(guān)注的神經(jīng)退行性疾病之一。AD是一種進(jìn)行性高級認(rèn)知功能障礙和記憶功能喪失為特征的疾病。研究表明，AD發(fā)病率隨年齡增長而增加，65歲的發(fā)病率約0.5%，85歲以上可達(dá)8%。隨著我國逐步進(jìn)入老齡社會，老齡化趨勢將使老年癡呆患者數(shù)量增多，給個人、家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。盡管AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但大量研究表明β淀粉樣蛋白沉積，神經(jīng)原纖維纏結(jié)，慢性神經(jīng)炎癥，大量神經(jīng)細(xì)胞變性壞死等在AD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。目前還沒有任何一種治療方法能夠有效的阻止或者逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默病疾病進(jìn)展。阿爾茨海默病臨床上治療仍處于藥物局限、療效欠佳的階段。因此，發(fā)展新的治療技術(shù)和方法是擺在人們面前亟待解決的問題。
[0003]隨著分子生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)生物工程的飛速發(fā)展，使基因治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病越來越趨近現(xiàn)實(shí)。阿爾茨海默病基因治療作為一種新型的治療手段，已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。近年來已有研究表明，將特定組合的轉(zhuǎn)錄因子通過一定途徑異位表達(dá)于終末分化的體細(xì)胞中，可將這些體細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化成特定的功能細(xì)胞，完成細(xì)胞譜系之間轉(zhuǎn)換，而不需要重編程為多能性干細(xì)胞后再分化為有功能的體細(xì)胞，是基因治療研究的重大突破。因而，利用外源轉(zhuǎn)錄因子基因治療阿爾茨海默病是一種較為理想的策略。
[0004]Magdalena研究團(tuán)隊(duì)研究證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子Pax6過表達(dá)于小鼠的膠質(zhì)細(xì)胞中能引起膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的潛能(HeinsNetal., 2002)。2010年，Vierbuchen等從19個特異表達(dá)于神經(jīng)組織或與細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)換重編程相關(guān)的基因中篩選出Ascll，Brn2，Mytll基因，通過病毒介導(dǎo)的異位表達(dá)，成功地將胚胎和產(chǎn)后小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)型神經(jīng)細(xì)胞，這些誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞能夠表達(dá)多種神經(jīng)元特異性蛋白，產(chǎn)生動作電位，形成功能性突觸(Vierbuchenetal.，2010)。Heinrich領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)通過研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子Neur0g2或者Dlx2后能夠直接分化為谷氨酸能神經(jīng)元或者Y -羥基丁酸能神經(jīng)元，第一次證實(shí)了通過選擇不同的轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞直接誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為不同亞型的神經(jīng)元(Heinrichetal., 2010)。2011年Caiazzo研究小組實(shí)驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)入3個轉(zhuǎn)錄因子組合(Ascll、NurrU Lmxla)后，能夠直接轉(zhuǎn)分化為誘導(dǎo)型多巴胺能神經(jīng)元，且具有產(chǎn)生多巴胺的功能(Caiazzoetal.，2011)。2012年，Liu等實(shí)驗(yàn)證實(shí),將人纖維細(xì)胞用病毒介導(dǎo)過表達(dá)五種轉(zhuǎn)錄因子(Mashl, Ngn2, Sox2, NurrI, Pitx3),可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為多巴胺能神 經(jīng)元，且進(jìn)一步的大鼠體內(nèi)試驗(yàn)表明其能夠緩解帕金森病大鼠的癥狀，可作為帕金森患者潛在的治療策略(Liuetal.，2012)。Karow等通過反轉(zhuǎn)錄病毒將轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Mashl過表達(dá)于大腦皮質(zhì)周細(xì)胞，能夠?qū)⑵湓倬幊剔D(zhuǎn)化為誘導(dǎo)神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)自體細(xì)胞之間的直接轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步為轉(zhuǎn)錄因子用于中樞系統(tǒng)神經(jīng)退行性變基因治療提供了可能(Goritzetal.，2011)。研究顯示，單一的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)生成的神經(jīng)元功能可能尚不完善，即只具備神經(jīng)細(xì)胞特征，不具備神經(jīng)元功能或神經(jīng)元功能不完善，故不能用于臨床。并且由上所述可知特定的細(xì)胞如膠質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等，需要特定轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)；
[0005]轉(zhuǎn)錄因子Ascl 1，Brn2, Pax6等參與神經(jīng)組織且與細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)換重編程，并且與其他相關(guān)基因在體外實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)參與神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、再生相關(guān)，但用于基因治療阿爾茨海默病卻仍然有很大難度。其原因可能有，首先，中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要有神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，神經(jīng)元具有不可再生的特性，雖然細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)換重編程可以將機(jī)體體細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的治療，且多種轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元可具有一般神經(jīng)元所具有的的特征和功能，但選擇合適轉(zhuǎn)錄因子組合成為難題。目前，雖然Ascll, Brn2,Pax6等基因在實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)參與神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、再生相關(guān)，但是尚未見有報(bào)道此三者轉(zhuǎn)錄因子組合形式誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)為神經(jīng)元的報(bào)道；再者，基因治療需要合適、安全的基因載體，且通過有效可行的途徑實(shí)施。慢病毒是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，不但能感染分裂期的細(xì)胞并整合到其基因組中，而且還可以感染非分裂期的細(xì)胞，具有容納外源性目的基因片段大、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，其作為基因治療載體已被廣泛應(yīng)用。但現(xiàn)有技術(shù)也表明盡管慢病毒載體的研究有了很大進(jìn)展，但距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走。首先，重組病毒的滴度還不夠高，均在IO1TUAiI~103TU/ml之間，難以達(dá)到體內(nèi)應(yīng)用的需要；其次，由于HIV復(fù)雜的生物學(xué)性質(zhì)，要像常用的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣建立穩(wěn)定的HIV載體包裝細(xì)胞十分困難，已建立的包裝細(xì)胞均不理想。
[0006]本發(fā)明利用慢病毒作為 基因載體建立轉(zhuǎn)錄因子Ascll, Brn2，Pax6重組慢病毒顆粒，用于治療阿爾茨海默病小鼠，觀察小鼠空間記憶能力改善情況。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007]本發(fā)明的目的是在于提供三種神經(jīng)元再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Ascll，Brn2, Pax6，其作為特異表達(dá)于神經(jīng)組織且與細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)換重編程相關(guān)的基因，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞譜系之間轉(zhuǎn)換，具有誘導(dǎo)神經(jīng)元再生的能力。
[0008]本發(fā)明的另一目的是在于提供三種轉(zhuǎn)錄因子基因重組慢病毒載體的制備方法，將轉(zhuǎn)錄因子Ascl 1，Brn2, Pax6基因分別克隆于慢病毒轉(zhuǎn)移載體pGC_L_GFP，獲得重組慢病毒質(zhì)粒 pGC-L-GFP-Ascll, pGC-L-GFP-Brn2, pGC_L-GFP_Pax6，進(jìn)而與包裝質(zhì)粒載體pHelperl.0和pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)獲得包裝重組慢病毒顆粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6。并經(jīng)超速離心濃縮病毒顆粒，測定包裝病毒滴度。
[0009]本發(fā)明的另一目的是在于將制備好的三種轉(zhuǎn)錄因子重組慢病毒顆粒注入阿爾茨海默病小鼠模型的雙側(cè)海馬中，觀察混合的三種病毒載體顆粒治療后模型小鼠的空間記憶學(xué)習(xí)能力的改變情況。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0011]三種神經(jīng)元再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Ascll, Brn2, Pax6的制備方法,其步驟是:
[0012]目的基因Ascll, Brn2，Pax6的DNA片段的合成:參照Genbank小鼠Ascll, Brn2, Pax6基因序列，設(shè)計(jì)目的基因引物，提取、擴(kuò)增、純化Ascll, Brn2, Pax6的DNA片段。[0013]將目的基因片段插入帶有報(bào)告基因GFP的慢病毒轉(zhuǎn)移載體pGC-L-GFP，經(jīng)病毒包裝后，與包裝質(zhì)粒載體pHelperl.0和pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)獲得包裝重組慢病毒顆粒LV-Ascll，LV-Brn2, LV_Pax6。同樣方法獲得的慢病毒LV-GFP作為對照。
[0014]將收集的上清液離心后經(jīng)濾膜過濾，繼而進(jìn)一步超速離心獲得純化的慢病毒顆粒，進(jìn)一步測定包裝病毒滴度。
[0015]三種轉(zhuǎn)錄因子重組慢病毒顆粒在阿爾茨海默病基因治療方面的應(yīng)用。其步驟是:
[0016]為了評價三種重組慢病毒顆粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6在阿爾茨海默病基因治療方面的作用，我們選取阿爾茨海默病小鼠模型作為實(shí)驗(yàn)對象，觀察其經(jīng)經(jīng)慢病毒顆粒治療后，空間記憶學(xué)習(xí)能力的改變情況。 [0017]我們將三種重組慢病毒顆粒LV-Ascl 1，LV-Brn2, LV_Pax6按照1:1:1的比例混合(病毒滴度l*108TU/ml)，繼而將混合后的病毒混合液通過立體定向注射儀注入模型組的小鼠雙側(cè)海馬中，對照組給予生理鹽水，模型組給予慢病毒LV-GFP作為對照。
[0018]混合病毒注射后一周，通過水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠空間記憶學(xué)習(xí)能力的改變情況，評價三種重組慢病毒顆粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6在改善阿爾茨海默病空間記憶學(xué)習(xí)能力方面的作用。圖1為四組小鼠經(jīng)重組慢病毒顆粒LV-Ascl 1，LV-Brn2, LV-Pax6治療后水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0019]本發(fā)明中提及的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，或簡稱膠質(zhì)細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元多，在哺乳類，二者的比例約為十比一，膠質(zhì)細(xì)胞沒有神經(jīng)傳導(dǎo)能力，但對神經(jīng)元的正?；顒优c物質(zhì)代謝都有重要作用。
[0020]有益效果:
[0021]1、現(xiàn)有技術(shù)表明，β淀粉樣蛋白沉積、大量的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)元死亡是阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展過程中的主要病理變化過程。本發(fā)明首次成功的利用轉(zhuǎn)錄因子Ascll, Brn2, Pax6介導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)神經(jīng)元以及其進(jìn)一步治療阿爾茨海默病。具體本發(fā)明通過慢病毒技術(shù)包裝此三種Ascll, Brn2, Pax6基因，并將其整合到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的基因組中，發(fā)揮其神經(jīng)元誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的作用。在機(jī)體水平能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元轉(zhuǎn)化再生，改善阿爾茨海默病小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。
[0022]2、本發(fā)明采用的是基因治療途徑，即將重組的三種轉(zhuǎn)錄因子慢病毒表達(dá)載體直接導(dǎo)入小鼠雙側(cè)海馬，我們觀察到小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高，并且不良反應(yīng)少，效果肯定，為阿爾茨海默病治療提供新的思路。
[0023]3、現(xiàn)有技術(shù)表明盡管慢病毒載體的研究有了很大進(jìn)展，但距離臨床應(yīng)用還有很長的路要走。首先，重組病毒的滴度還不夠高，均在IO1TUAiI~103TU/ml之間，難以達(dá)到體內(nèi)應(yīng)用的需要；其次，由于HIV復(fù)雜的生物學(xué)性質(zhì)，要像常用的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣建立穩(wěn)定的HIV載體包裝細(xì)胞十分困難，已建立的包裝細(xì)胞均不理想。而本發(fā)明重組的滴度2*108TU/ml，達(dá)到了體內(nèi)給藥應(yīng)用的需要。
[0024]4、慢病毒載體具有感染譜廣、效率高、免疫原性較低等特點(diǎn)，感染后可長期、穩(wěn)定地表達(dá)外源基因；
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1.水迷宮實(shí)驗(yàn)中定位航行試驗(yàn)結(jié)果分析圖(逃避潛伏期數(shù)據(jù)結(jié)果);[0026]圖2.水迷宮實(shí)驗(yàn)中的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析圖；如圖2A為穿臺次數(shù)數(shù)據(jù)結(jié)果，圖2B為第四象限穿越頻率結(jié)果分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合具體實(shí)例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0028]實(shí)施例1:三種神經(jīng)元再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Ascll, Brn2, Pax6的重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)目的基因Ascll, Brn2, Pax6的DNA片段的合成:根據(jù)人Ascll (Genbank登錄號:NM_008553)，Brn2 (Genbank 登錄號:NM_008899)，Pax6 (Genbank 登錄號:NM_008899)基因序列，設(shè)計(jì)目的基因引物，其序列如下:
[0029](I) Ascll:5，_caagagcgcagccttag_3，；3，_gcaaaagtcagtgctgaacg_5，?
[0030](2) Brn2:5，-aataaggcaaaaggaaagcaact-3J !3，-caaaacatcattacctgct-5J ；
[0031](3) Pax6:5，-gccagcaacacacctagtca-3J ;3，-ggggaaatgagtcctgttga-5J?
[0032]采用含有轉(zhuǎn)錄因子Ascll，Brn2，Pax6目的基因的DNA序列的基因片段，該基因片段由人cDNA文庫(上海英基生物科技有限公司)購買得到，對Ascll，Brn2, Pax6目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物(PCR試劑盒購自Takara公司).[0033]PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(25ul):10*buffer2.5ul，引物(10pmol/ul)各 0.5ul，dNTP(10mmol/L) 2ul,DNA聚合酶(2.5U/ul) 0.4ul, DNA模板lul,加雙蒸水補(bǔ)至25ul ;具體反應(yīng)程序參照試劑盒的說明書。
[0034]PCR 反應(yīng)條件:94°C變性 5min ；(94°C 45sec，60°C 45sec，72°C 60sec) 32 個循環(huán)；72°C IOmin。
`[0035]反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增后經(jīng)純化所得的目的基因DNA片段克隆于含有報(bào)告基因GFP的慢病毒轉(zhuǎn)移載體pGC-L-GFP (購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒 pGC-L-GFP-Ascll, pGC-L-GFP_Brn2，pGC_L-GFP_Pax6 (上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建)，用于制備慢病毒包裝質(zhì)粒。
[0036]實(shí)施例2:重組質(zhì)粒慢病毒包裝
[0037]1.病毒包裝步驟
[0038]慢病毒表達(dá)載體根據(jù)Zhou等(ZhouLetal.，2010)介紹的方法構(gòu)建。通過脂質(zhì)體法 Lipofectamine2000 將重組慢病毒質(zhì)粒 pGC-L-GFP-Ascll, pGC-L-GFP_Brn2，pGC-L-GFP-Pax6 與慢病毒包裝質(zhì)粒 pHelperl.0 (Invitrogen 公司，cat.N0.11668-500)和 pHelper2.0(Invitrogen公司，cat.N0.11668-500)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)。72小時后收集上清，同時補(bǔ)加生長液，12小時后再次收集上清液，獲得三種重組慢病毒顆粒LV-Ascll，LV-Brn2, LV_Pax6。
[0039]2.病毒的收獲及濃縮具體步驟
[0040]將步驟I獲得的上清液于4°C，4000g離心10分鐘后，去除細(xì)胞碎片，再經(jīng)0.45um濾膜過濾上清液于40ml超速離心管中；將病毒粗提液樣品加入到過濾杯中，將過濾杯插到過濾液收集管中，經(jīng)4000g超速離心至病毒濃縮體積。離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯倒扣在樣品收集杯上，離心力不超過lOOOg，離心時間2分鐘。樣品收集杯中即為病毒濃縮液；將病毒濃縮液移出，分裝保存病毒管中，_80°C保存。取其中一管做病毒生物學(xué)滴度測定。[0041]3.慢病毒滴度檢測具體步驟
[0042]采用逐孔稀釋滴度測定法，在測定前一天，為測定滴度所需的細(xì)胞鋪板，每孔加4*104個細(xì)胞，體積為IOOul ;根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準(zhǔn)備7-10個無菌的Ep管，在每管中加入90ul的無血清培養(yǎng)基；取待測定的病毒原液IOul加入第一管中，混勻后取IOul加到第二個管中，繼續(xù)相同的操作到最后一管；選取所需的細(xì)胞孔，吸取90ul培養(yǎng)基，丟棄，加入90ul稀釋好的病毒溶液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24小時后，加入完全培養(yǎng)基IOOu ；4天后，觀察熒光表達(dá)情況。熒光細(xì)胞數(shù)隨著稀釋倍數(shù)的增加而減少。滴度檢測結(jié)果2*108TU/ml。
[0043]實(shí)施例3:三種轉(zhuǎn)錄因子重組慢病毒顆粒在阿爾茨海默病基因治療方面的應(yīng)用
[0044]選取40只成年的雄性C57BL6小鼠，隨機(jī)分為四組，設(shè)置為空白對照組、阿爾茨海默病模型組、高劑量病毒治療組、低劑量病毒治療組，模型組小鼠以及治療組給予A β 1-42(購自一)立體定向注射于小鼠雙側(cè)海馬，空白對照組予以無菌生理鹽水。Αβ 1-42造模前三天，將三種重組慢病毒顆粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6按照1:1:1的比例混合(病毒滴度l*108TU/ml)，混合后的病毒混合液2ul通過立體定向注射儀注入治療組小鼠雙側(cè)海馬中，空白對照組和模型組分別給予同劑量的無菌生理鹽水和慢病毒LV-GFP作為對照。
[0045]三種轉(zhuǎn)錄因子重組慢病毒顆?；旌弦褐委熀笠恢埽瑢⑺慕M小鼠進(jìn)行為期七天的水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠逃避潛伏時間，穿越特定象限頻率，穿越實(shí)驗(yàn)中設(shè)置平臺的次數(shù)等數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評價這三種重組慢病毒顆粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6在改善阿爾茨海默病空間記憶學(xué)習(xí)能力方面的作用。
[0046]結(jié)果顯示:較模型組小鼠而言，經(jīng)三種轉(zhuǎn)錄因子重組慢病毒顆?；旌弦褐委煹男∈螅颖軡摲诿黠@縮短(圖1)，穿臺次數(shù)數(shù)(圖2A)和第四象限穿越頻率(圖2B)顯著增加，說明治療后小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著增強(qiáng)，療效肯定；同時，實(shí)驗(yàn)小鼠并未表現(xiàn)出明顯的不良反應(yīng)，且未見小鼠死亡`，說明了該治療方式分安全性可以得到保證。因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于阿爾茨海默病的基因治療，為患者提供新的安全有效的治療途徑。
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)錄因子組，其特征在于所述的轉(zhuǎn)錄因子組由Ascll、Brn2和Pax6構(gòu)成,其介導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)神經(jīng)元。
2.一種含有權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子組的重組慢病毒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)錄因子組的重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，通過以含綠色熒光蛋白GFP報(bào)告基因的pGC-L-GFP的質(zhì)粒為載體，分別插入Ascl 1，Brn2, Pax6基因片段，構(gòu)建三種含Ascll，Brn2，Pax6基因片段和綠色熒光蛋白GFP報(bào)告基因的PGC-L-GFP-Ascll，pGC-L-GFP-Brn2，pGC-L-GFP-Pax6 的重組質(zhì)粒，與包裝質(zhì)粒載體pHelperl.0和pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)獲得包裝重組慢病毒顆粒，命名為LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)錄因子組的重組慢病毒載體的構(gòu)建方法，其特征由以下步驟實(shí)現(xiàn): Cl)制備含有目的基因Ascll, Brn2, Pax6的DNA片段； 根據(jù) Genbank 登錄號:NM_008553, Genbank 登錄號:NM_008899, Genbank 登錄號:NM_008899記載的基因序列，設(shè)計(jì)目的基因引物，其序列如下:
Ascll:5，_caagagcgcagccttag_3，；3，_gcaaaagtcagtgctgaacg_5，。
Brn2:5’ -aataaggcaaaaggaaagcaact-3? ;3’ -caaaacatcattacctgct-5?；
Pax6:5，-gccagcaacacacctagtca-3? ;3，-ggggaaatgagtcctgttga-5?; (2)擴(kuò)增、純化Ascl`l,Brn2, Pax6基因的目的片段； (3)通過pGC-L-GFP載體質(zhì)粒制備重組慢病毒質(zhì)粒pGC-L-GFP-Ascll，pGC-L-GFP_Brn2，pGC-L-GFP-Pax6 ； (4)與包裝質(zhì)粒載體pHelperl.0和pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)獲得包裝重組慢病毒顆粒，命名為 LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)錄因子組的重組慢病毒載體，其特征步驟(4)中獲得慢病毒滴度為2*108TU/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)錄因子組的重組慢病毒載體在制備治療阿爾茨海默藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/12GK103773771SQ201310625388
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】趙鵬, 顧愛華, 陳品, 顏青, 鄒鵬, 王松濤 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)