人乳頭瘤病毒6bE7蛋白表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供人乳頭瘤病毒6bE7蛋白表達(dá)純化方法，通過(guò)設(shè)計(jì)HPV-6bE7的擴(kuò)增引物，并從HPV-6b型全病毒質(zhì)粒中有效擴(kuò)增出該基因，插入到載體pGEX-4T2和pEGFP-C1中，獲得重組載體，轉(zhuǎn)染，收集上清與4B磁珠結(jié)合，再用凝血酶切除GST標(biāo)簽，獲取HPV-6bE7蛋白，行多點(diǎn)免疫，獲得純化的多克隆抗體。本發(fā)明增加了該蛋白原核表達(dá)時(shí)的可溶性，從而降低下游大規(guī)模生產(chǎn)成本以及分離純化難度，在提高表達(dá)量的同時(shí)也有利于分離純化，使該蛋白在工業(yè)化放大生產(chǎn)時(shí)降低難度，減少成本，并經(jīng)純化、免疫，得到高特異性、高效價(jià)比的多克隆抗體，能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，為進(jìn)一步研究治療尖銳濕疣疾病奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】人乳頭瘤病毒6bE7蛋白表達(dá)及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及病毒蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和抗體制備，具體涉及抑制人乳頭瘤病毒6b型E7蛋白原核表達(dá)及在制備多克隆抗體中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]尖銳濕疣是一種危害我國(guó)人民健康和家庭幸福的性傳播疾病，由人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)引起。HPV不僅可引起皮膚粘膜上皮的撫狀增生,還與多種鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，亞洲地區(qū)尖銳濕疣的病原體主要為人乳頭瘤病毒6b型(Human Papillomavirus type 6b, HPV~6b)和 11 型(Human Papillomavirus type 11,HPV-1I)。HPV-6bE7蛋白的表達(dá)成功可為疫苗的研制提供技術(shù)支持，也可作為感染干預(yù)性研究提供理論方法。目前臨床上缺乏可靠的檢測(cè)方法，HPV-6bE7蛋白抗體的發(fā)明可為HPV臨床檢測(cè)提供新的方法，同時(shí)為科學(xué)研究提供新的方法學(xué)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供人乳頭瘤病毒6bE7蛋白表達(dá)、純化方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn):
(1)"/v-份濟(jì)7基因的調(diào)取及擴(kuò)增:設(shè)\\HPV-6bE7的擴(kuò)增引物，并從HPV-6b型全病毒質(zhì)粒中有效擴(kuò)增出該基因，其中用于擴(kuò)增用于原核表達(dá)的///V-份濟(jì)7序列的上游引物序列為SEQ ID N0.1:5，-GAATTCCGCTGCCTACACTGCTGGACAA C-3’，劃線部分為 &oR I 酶切位點(diǎn)，下游引物序列為 SEQ ID N0.2:5，-CTCGAGCTACCTGAATCGTCCGCC ATCGTT-3’，劃線部分為ZAo I酶切位點(diǎn)；
用于擴(kuò)增用于真核表達(dá)的規(guī)序列的上游引物序列為SEQ ID N0.3:5，_GAATTCTATGCATGGAAGACATGTTACCC-3’，劃線部分為&oR I酶切位點(diǎn)，下游引物序列為SEQ ID N0.4:5’ -GGATCCTTAGGTCTTCGGTGCGCAGAT-3’,劃線部分為沒(méi)ag?H I 酶切位點(diǎn)；
(2)///V-份濟(jì)7基因原核及真核表達(dá)載體的構(gòu)建:將步驟(1)中得到的這兩個(gè)含不同酶切位點(diǎn)的"/V-份濟(jì)7基房序列按照先后順序插入到載體pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，獲得用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的重組載體 pGEX-4T2-(HPV-6bE7)和 pEGFP_Cl_ (HPV_6bE7)；
(3)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的原核表達(dá):將步驟(2)中構(gòu)建的重組載體pGEX-4T2-(HPV-6bE7)轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5 α，待細(xì)菌OD值介于0.6-0.8之間，加IPTG至終濃度為0.2mM,并在26-28°C的誘導(dǎo)溫度下，誘導(dǎo)4_6h后收集細(xì)菌，在250-300W超聲功率下，超聲時(shí)間9秒，間歇時(shí)間9秒，總時(shí)長(zhǎng)約3min以破碎細(xì)菌，收集上清；
(4)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的純化及HPV_6bE7蛋白的獲得:通過(guò)(3)步驟獲得的上清與Glutathione-Sepharose 4B磁珠(GE healthcare)結(jié)合，再用凝血酶(GEhealthcare)切除GST標(biāo)簽，獲取HPV_6bE7蛋白，PBS透析過(guò)夜獲得純化的HPV_6bE7蛋白。
[0004] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供人乳頭瘤病毒6bE7蛋白在制備多克隆抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明獲得的人類乳頭瘤病毒HPV-11E7蛋白，通過(guò)免疫動(dòng)物獲得血清并經(jīng)過(guò)純化獲得高特異性、高效價(jià)比的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究治療尖銳濕疣奠定基礎(chǔ)。
[0005]利用本領(lǐng)域周知的方法可以完成同源重組載體的構(gòu)建，在引物的兩端引入酶切位點(diǎn)，通過(guò)酶切產(chǎn)生粘性末端，可克隆到所需載體。所用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆過(guò)程見(jiàn)(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2008.)。
[0006]大腸埃希菌DH5 α購(gòu)于大連寶生物TaKaRa公司，pGEX_4T2原核表達(dá)載體購(gòu)于GEhealthcare, HPV_6b型全基因質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culturecollection, ATCC)，293T細(xì)胞購(gòu)于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。
[0007]轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至宿主細(xì)菌中可用通常的方法，如電穿孔、制備感受態(tài)細(xì)胞等。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過(guò)人們熟知的技術(shù)加以鑒定，如細(xì)菌經(jīng)收集并裂解，提取質(zhì)粒，然后PCR鑒定、酶切鑒定或測(cè)序鑒定。
[0008]體外獲得HPV_6bE7蛋白，是通過(guò)基因工程手段先在大腸埃希菌中進(jìn)行原核表達(dá)GST-HPV-6bE7融合蛋白，經(jīng)過(guò)純化，并切除GST標(biāo)簽蛋白，最終得到HPV_6bE7蛋白。該蛋白在尖銳濕疣發(fā)病機(jī)制研究中極具前景，是HPV診斷試劑開(kāi)發(fā)和疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)。
[0009]病毒蛋白一般具有不同程度的毒性，原核表達(dá)極容易形成不溶性的包涵體， 申請(qǐng)人:前期在大量的實(shí)驗(yàn)條件下，摸索可溶性蛋白的表達(dá)方式。后采用引入GST標(biāo)簽，并降低IPTG濃度，降低誘導(dǎo)時(shí)的溫度，縮短誘導(dǎo)時(shí)間等措施。增加了該蛋白原核表達(dá)時(shí)的可溶性，從而降低下游大規(guī)模生產(chǎn)成 本以及分離純化難度，在提高表達(dá)量的同時(shí)也有利于分離純化，使該蛋白在工業(yè)化放大生產(chǎn)時(shí)降低難度，減少成本。為進(jìn)一步研究治療尖銳濕疣奠定基礎(chǔ)。
[0010]HPV 6b型是引起尖銳濕疣的主要原因之一，目前的檢測(cè)手段很有限，如PCR，容易造成假陽(yáng)性，或假陰性。HPV-6b抗體的發(fā)明可通過(guò)免疫組化，免疫熒光，酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)等技術(shù)來(lái)檢測(cè)HPV 6b型病毒的感染，并且可與PCR技術(shù)聯(lián)用，來(lái)檢測(cè)HPV 6b型的感染，能大大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為重組質(zhì)粒pGEX-4T2-(HPV-6bE7)的電泳示意圖。圖中泳道Ml:TaKaRa DL15，000 DNA marker ;泳道1: HPV_6bE7基因(用PCR法從HPV_6b型全基因質(zhì)粒中擴(kuò)增得到);泳道 2:重組 pMD-18T-HPV-6bE7 質(zhì)粒；泳道 3:重組 pMD-18T-HPV_6bE7 經(jīng) AcoR I 和Xho I酶切；泳道4: pGEX-4T2質(zhì)粒；泳道5: pGEX_4T2質(zhì)粒經(jīng)I和沿ο I酶切；泳道 6:重組 pGEX-4T2-HPV-6bE7 ;泳道 7:重組 pGEX-4T2-HPV_6bE7 經(jīng)FcoR I 和 ZAo I 酶切；泳道 M2:TaKaRa DL 2,000 DNA marker。
[0012]圖2為重組質(zhì)粒pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)的電泳示意圖。圖中泳道Ml:TaKaRa DL15，000 DNA marker ;泳道1: HPV_6bE7基因(用PCR法從HPV_6b型全基因質(zhì)粒中擴(kuò)增得至丨J);泳道 2:重組 pMD-18T-HPV-6bE7 質(zhì)粒；泳道 3:重組 pMD-18T-HPV_6bE7 經(jīng)&oR I和I酶切；泳道4: pEGFP-Cl質(zhì)粒；泳道5: pEGFP-Cl質(zhì)粒經(jīng)&oR I和I酶切；泳道 6:重組 pEGFP-Cl-(HPV-6bE7);泳道 7:重組 pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)經(jīng)&oR I和 I 酶切；泳道 M2 =TaKaRa DL 2, 000 DNA marker。(
圖3為重組蛋白GST-HPV-6bE7誘導(dǎo)表達(dá)、純化、酶切的PAGE分析。圖中泳道M:蛋白預(yù)染marker ;泳道1:含pGEX_4T2質(zhì)粒的細(xì)菌經(jīng)誘導(dǎo)超聲破碎后離心所得的上清；泳道2:含pGEX-4T2-6bE7質(zhì)粒的細(xì)菌經(jīng)誘導(dǎo)超聲破碎后離心所得的上清；泳道3:純化酶切后的HPV-6bE7蛋白；泳道4:透析后的HPV-6bE7蛋白。
[0013]圖4為兔抗HPV_6bE7蛋白多克隆抗體的Western-Blot效價(jià)鑒定。圖中泳道1:兔抗HPV-6bE7多克隆抗體(稀釋比1:5000);泳道2:兔抗HPV_6bE7多克隆抗體(稀釋比1:1000)。
[0014]圖5為Western blotting檢測(cè)HPV_6bE7在293T細(xì)胞中的表達(dá)。圖中泳道1:293T ;泳道 2:293T 轉(zhuǎn)染 pEGFP-Cl 質(zhì)粒；泳道 3:293T 轉(zhuǎn)染 pEGFP_Cl-HPV_6bE7 質(zhì)粒。
[0015]圖6為免疫熒光檢測(cè)HPV_6bE7在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
[0016]圖7為免疫組化檢測(cè)HPV_6bE7病理標(biāo)本中的表達(dá)。圖中白色箭頭:未感染HPV-6bE7的細(xì)胞，黑色箭頭:感染HPV-6bE7的細(xì)胞。
[0017]【具體實(shí)施方式】 本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0018]實(shí)施例1:HPV 6b型E7基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
用 PCR 方法從 HPV-6b purified plasmid DNA(ATCC:45150D)擴(kuò)增出 HPV_6b 基因(SEQID N0.5)，所用的引物逆K-份?^7_P up (SEQ ID N0.1), HPV~6bE7J> dn (SEQ ID N0.2)由上海生工合成。用于原核表達(dá)的上下游引物分別引入&01? I和通O I酶切位點(diǎn)HPV-6bE7_? up:5’ -GAATTCCGCTGCCTACACTGCTGGACAAC-3’
HPV-6bE7_? dn:5’ -CTCGAGCTACCTGAATCG TCCGCCATCGTT-3，
PCR反應(yīng)條件:50 μ L反應(yīng)體系中，加入IyL HPV_6b全病毒基因質(zhì)粒，20 μ mol/L的上下游引物各 I U L, 2.5mmol/L 的 dNTP mixture 4 μ L, 5XBuffer (Mg2+ plus) 10 μ L, rTaq聚合酶0.5 μ L，剩余用ddH20補(bǔ)足。用ABI公司的(型號(hào)為2720) PCR儀，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s ;56°C退火30s ;72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)以后，再72°C延伸7min。通過(guò)1.5%凝膠電泳分析得到預(yù)期為340bp的用與原核表達(dá)的HPV_6bE7序列(SEQID N0.6)。
[0019]將上述擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳純化后用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。連接至pMD?18-T Vector (TaKaRa:D101A)，轉(zhuǎn)化入 DH5 α 后，鋪于含 100 μ g/ mL Amp 的 LB 瓊脂平皿，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑選平皿上數(shù)個(gè)克隆接種5mL含IOOyg/ mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取pMD-18T-HPV-6bE7質(zhì)粒，并用I和通ο I雙酶切進(jìn)行初步鑒定，陽(yáng)性克隆送上海博尚進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證正確。
[0020]將測(cè)序正確的pMD-18T-HPV_6bE7 (原核)用I和Xho I雙酶切，酶切后的產(chǎn)物電泳純化后用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。
[0021]原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T2也用I和沿ο I雙酶切，電泳純化后用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。以適當(dāng)比例將上述線性PGEX-4T2和HPV-6bE7基因片段混合，用T4 DNA連接酶在16°C水浴中連接過(guò)夜。，轉(zhuǎn)化入DH5a后，鋪于含100 μ g/ mL Amp的LB瓊脂平皿，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑選平皿上數(shù)個(gè)克隆接種5mL含100μ g/ mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取pGEX-4T2-(HPV-6bE7)質(zhì)粒，并用EcoR I和通ο I雙酶切進(jìn)行初步鑒定，陽(yáng)性克隆送上海博尚進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證正確。從而完成HPV-6bE7基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建(見(jiàn)圖1)。
[0022]實(shí)施例2:HPV 6b型E7基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建用 PCR 方法從 HPV-6b purified plasmid DNA (ATCC:45150D)擴(kuò)增出 HPV_6b 基因，所用的引物規(guī)KM7_E up (SEQ ID N0.,HPV~6bE73 dn (SEQ ID N0.4)由上海生工合成。用于真核表達(dá)的上下游引物分別引入及I和ifeMl I酶切位點(diǎn)。
[0023] HPV-6bE73 即:5’ ~GAATTCTATGCATGGAAGACATGTTACCC~3?
HPV-6bE73 dn:5’ -GGATCCTTAGGTCTTCGGTGCGCAGAT-3，
PCR反應(yīng)條件:50 μ L反應(yīng)體系中，加入IyL HPV_6b全病毒基因質(zhì)粒，20 μ mol/L的上下游引物各 I U L, 2.5mmol/L 的 dNTP mixture 4 μ L, 5XBuffer (Mg2+ plus) 10 μ L, rTaq聚合酶0.5 μ L，剩余用ddH20補(bǔ)足。用ABI公司的(型號(hào)為2720) PCR儀，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s ;56°C退火30s ;72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)以后，再72°C延伸7min。通過(guò)1.5%凝膠電泳分析得到預(yù)期為310bp的用于真核表達(dá)的HPV_6bE7序列(SEQID N0.7)。
[0024]將上述擴(kuò)增的產(chǎn)物電泳純化后用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。連接至pMD?18-T Vector (TaKaRa:D101A)，轉(zhuǎn)化入 DH5 α 后，鋪于含 100 μ g/ mL Amp 的 LB 瓊脂平皿，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑選平皿上數(shù)個(gè)克隆接種5mL含IOOyg/ mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取pMD-18T-HPV-6bE7質(zhì)粒，并用I和漢.Η I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，陽(yáng)性克隆送上海生工進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證正確。
[0025]將測(cè)序正確的pMD-18T-HPV_6bE7 (真核)用&oR I和I雙酶切，酶切后的產(chǎn)物電泳純化后用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。
[0026]真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Cl也用I和I雙酶切，電泳純化后用DNA片段回收試劑盒回收純化目的條帶。以適當(dāng)比例將上述線性pEGFP-Cl和HPV-6bE7基因片段混合，用T4 DNA連接酶在16°C水浴中連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化入DH5a后，鋪于含50yg/ mL kana的LB瓊脂平皿，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑選平皿上數(shù)個(gè)克隆接種5mL含50 μ g/ mL kana的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取pEGFP-Cl-(HPV-6bE7)質(zhì)粒，并用EcoR I和及I雙酶切進(jìn)行初步鑒定，陽(yáng)性克隆送上海博尚進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證正確。從而完成HPV-6bE7基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建(見(jiàn)圖2)。
[0027]實(shí)施例3:HPV 6b型E7蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
pGEX-4T2-(HPV-6bE7)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α，接種于含氨芐青霉素(Amp)100 μ g/mL的LB培養(yǎng)液，待細(xì)菌OD值介于0.6-0.8之間，加IPTG至終濃度為0.2mM,誘導(dǎo)溫度:26-28°C，誘導(dǎo)4-6h后收集細(xì)菌，冰浴超聲裂解菌體，4°C 12000 rpm IOmin離心分離上清和沉淀，并經(jīng)15%聚丙烯凝膠電泳鑒定(見(jiàn)圖3)。
[0028]實(shí)施例4:HPV 6b型E7蛋白的純化和酶切
取菌體上清與Glutathione-Sepharose 4B磁珠結(jié)合,再用凝血酶切除GST標(biāo)簽,獲取HPV-6bE7蛋白，PBS透析蛋白過(guò)夜，并經(jīng)聚丙烯凝膠電泳鑒定(見(jiàn)圖3)。
[0029]實(shí)施例5:HPV 6b E7蛋白兔多克隆抗體的制備和純化
用純化后的HPV-6bE7蛋白免疫新西蘭雌兔，體重為2.5kg為宜。初次免疫用含E7蛋白500 μ g的抗原完全弗氏佐劑乳化劑1.6mL于兔子背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，以后每隔IOd用含E7蛋白500 μ g的抗原不完全弗氏佐劑乳化劑加強(qiáng)免疫3次。耳緣靜脈采血，雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定血清中多價(jià)抗血清效價(jià)(I:8以上符合要求)。IOd后，E7蛋白500 μ g直接腹股溝區(qū)肌肉注射。5d后麻醉下心臟取血，分離血清后分裝并置-20°C保存。血清按rPiOtein GAgaros說(shuō)明書(shū)操作,親和層析獲得抗體IgG。
[0030] 實(shí)施例6:HPV 6b型E7多克隆抗體IgG的Western-Blot效價(jià)分析
將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白及牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)作為空白對(duì)照,經(jīng)15% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h，以多個(gè)稀釋滴度的兔抗HPV 6b型E7多克隆抗IgG為一抗、I:5000羊抗兔IgG-HRP為二抗進(jìn)行免疫印跡，ECL顯色。(見(jiàn)圖4)實(shí)施例7:HPV 6b型E7蛋白多克隆抗體IgG的特異性鑒定(Western blot)
轉(zhuǎn)染24h前將293T細(xì)胞以5父106個(gè)/1^濃度接種于IOcm的培養(yǎng)皿(含10%FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基、5%C02、37°C )。轉(zhuǎn)染前，培養(yǎng)基換成無(wú)血清的DMEM。轉(zhuǎn)染按Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)操作，將質(zhì)粒pEGFP-Cl、重組質(zhì)粒pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)各取10 μ g分別與20 μ I轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000在DMEM培養(yǎng)基中形成復(fù)合物，混合室溫放置30min后覆蓋于IOcm的培養(yǎng)皿，293T未轉(zhuǎn)染細(xì)胞做轉(zhuǎn)染空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染6h后，將培養(yǎng)基換成含10%FBS的DMEM，培養(yǎng)24h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，終止轉(zhuǎn)染。用RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白，用BCA試劑盒(碧云天)測(cè)蛋白濃度，以每孔40 μ g的總蛋白經(jīng)95°C變性后5min后，以10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h，以兔抗HPV 6b型E7多克隆抗IgG為一抗，稀釋比1:5000,1:5000羊抗兔IgG-HRP為二抗進(jìn)行免疫印跡，ECL顯色。(見(jiàn)圖5)
實(shí)施例8:HPV 6b型E7蛋白多克隆抗體IgG的特異性鑒定(免疫熒光)
轉(zhuǎn)染24h前將293T細(xì)胞以2.5X IO5個(gè)/mL濃度接種于放有細(xì)胞爬片的6孔板(含10%FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基、5%C02、37°C )。轉(zhuǎn)染前，培養(yǎng)基換成無(wú)血清的DMEM。轉(zhuǎn)染按Lipofectamine 2000 說(shuō)明書(shū)操作，將質(zhì)粒 pEGFP-Cl、重組質(zhì)粒 pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)各取4ug分別與8 μ I轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000在DMEM培養(yǎng)基中形成復(fù)合物，混合室溫放置30min后覆蓋于6孔板中，293T未轉(zhuǎn)染細(xì)胞做轉(zhuǎn)染空白對(duì)照。培養(yǎng)24h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，終止轉(zhuǎn)染。將6孔板中的細(xì)胞爬片用PBS洗3遍后依次4%多聚甲醛室溫固定10min、0.l%TritonX-100室溫孵育7min，期間PBS洗3遍，每次5min。置于4°C保存或進(jìn)行免疫熒光分析。免疫熒光實(shí)驗(yàn)在暗盒中進(jìn)行。取出上述爬有293T細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染的作對(duì)照)蓋玻片于10%山羊血清室溫封閉2h，I:500 (5%山羊血清稀釋)的HPV-6bE7兔多克隆抗體IgG為一抗4°C孵育過(guò)夜，1:500 (5%山羊血清稀釋)的Alexa Flour555羊抗兔IgG為二抗室溫孵育IhjjygAil DAPI染色8min，期間用PBS洗3遍每次5min。封片后熒光顯微鏡觀察(見(jiàn)圖6)
實(shí)施例9:HPV 6b型E7蛋白多克隆抗體IgG的特異性鑒定(免疫組化)
收集臨床尖銳濕疣標(biāo)本，通過(guò)RT-PCR鑒定HPV感染的類型。取HPV 6b型陽(yáng)性的組織，通過(guò)包埋，切片，烤片，脫蠟，抗原修復(fù)(檸檬酸緩沖液)，血清封閉。一抗(1:500)，4°C孵育過(guò)夜。PBS洗三次后，滴加二抗(1:1000)，室37°C靜置lh，PBS再洗三次后，DAB顯色5_10min。自來(lái)水沖洗IOmin,蘇木精復(fù)染,鹽酸酒精分化，自來(lái)水再?zèng)_洗lOmin。脫水后封片鏡檢。
【權(quán)利要求】
1.人乳頭瘤病毒6bE7蛋白表達(dá)純化方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)"/v-份濟(jì)7基因的調(diào)取及擴(kuò)增:設(shè)\\HPV-6bE7的擴(kuò)增引物，并從HPV-6b型全病毒質(zhì)粒中有效擴(kuò)增出該基因，其中用于擴(kuò)增用于原核表達(dá)的///V-份濟(jì)7序列的上游引物序列為SEQ ID N0.1:5，-GAATTCCGCTGCCTACACTGCTGGACAA C-3’，劃線部分為 &oR I 酶切位點(diǎn)，下游引物序列為 SEQ ID N0.2:5，-CTCGAGCTACCTGAATCGTCCGCC ATCGTT-3’，劃線部分為ZAo I酶切位點(diǎn)； 用于擴(kuò)增用于真核表達(dá)的規(guī)序列的上游引物序列為SEQ ID N0.3:5，_GAATTCTATGCATGGAAGACATGTTACCC-3’，劃線部分為&oR I酶切位點(diǎn)，下游引物序列為SEQ ID N0.4:5’ -GGATCCTTAGGTCTTCGGTGCGCAGAT-3’，劃線部分為沒(méi)ag?H I 酶切位點(diǎn)； (2)///V-份濟(jì)7基因原核及真核表達(dá)載體的構(gòu)建:將步驟(1)中得到的這兩個(gè)含不同酶切位點(diǎn)的"/V-份濟(jì)7基房序列插入到載體pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，獲得用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的重組載體 PGEX-4T2-(HPV-6bE7)和 pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)； (3)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的原核表達(dá):將步驟(2)中構(gòu)建的重組載體pGEX-4T2-(HPV-6bE7)轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5 α，待細(xì)菌OD值介于0.6-0.8之間，加IPTG至終濃度為0.2mM,并在26-28°C的誘導(dǎo)溫度下，誘導(dǎo)4_6h后收集細(xì)菌，在250-300W超聲功率下，超聲時(shí)間9秒，間歇時(shí)間9秒，總時(shí)長(zhǎng)約3min以破碎細(xì)菌，收集上清； (4)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的純化及HPV_6bE7蛋白的獲得:通過(guò)(3)步驟獲得的上清與Glutathione-Sepharose 4B磁珠(GE healthcare)結(jié)合，再用凝血酶(GEhealthcare)切除GST標(biāo)簽，獲取HPV_6bE7蛋白，PBS透析過(guò)夜獲得純化的HPV_6bE7蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒6bE7蛋白表達(dá)純化方法，其特征在于，在設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)載體時(shí)，選擇含GST標(biāo)簽的pGEX-4T2，有利于蛋白表達(dá)的可溶性，且在蛋白純化后，可將GST標(biāo)簽切除，使獲得的蛋白更接近天然HPV-6bE7蛋白，在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)為避免形成不可溶的包涵體，采取了優(yōu)化IPTG濃度，誘導(dǎo)時(shí)間，降低了誘導(dǎo)溫度等措施。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒6bE7蛋白表達(dá)純化方法，其特征在于，步驟(I)、(2)、(3)中，大腸埃希菌宿主DH5 α、真核表達(dá)載體pEGFP_Cl購(gòu)于大連寶生物TaKaRa，原核表達(dá)載體PGEX-4T2從GE health care公司購(gòu)得，HPV_6b型全基因質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的人乳頭瘤病毒6bE7蛋白在制備多克隆抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/025GK103952427SQ201410194990
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月11日
【發(fā)明者】程浩, 周強(qiáng), 湯怡, 朱可建, 陳賢禎, 韓睿 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)